SOX9與CEACAM1：胃癌組織中的表達(dá)密碼及對(duì)癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的影響探究

SOX9與CEACAM1：胃癌組織中的表達(dá)密碼及對(duì)癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的影響探究一、引言1.1研究背景與意義胃癌作為全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全球新增胃癌病例數(shù)以百萬(wàn)計(jì)，且其死亡率在各類(lèi)癌癥中也位居前列。在中國(guó)，胃癌的發(fā)病率和死亡率同樣不容樂(lè)觀，由于人口基數(shù)大，胃癌患者數(shù)量眾多，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。早期胃癌患者癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，治療難度大幅增加，這也是導(dǎo)致胃癌死亡率居高不下的重要原因之一。目前，胃癌的治療方法主要包括手術(shù)、化療、放療和靶向治療等，但對(duì)于晚期胃癌患者，這些治療方法的效果仍不盡人意，患者的5年生存率較低。因此，深入研究胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的診斷和治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高胃癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。在腫瘤研究領(lǐng)域，轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞黏附分子等在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。SOX9（SRY-relatedHMG-box9）作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與了多種組織和器官的發(fā)育過(guò)程，在維持細(xì)胞的干性和分化中扮演著重要角色。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，SOX9在多種腫瘤中異常表達(dá)，包括胃癌。在胃癌組織中，SOX9的高表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后密切相關(guān)。一些研究發(fā)現(xiàn)，SOX9能夠通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并且在胃癌的腹膜轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。例如，有研究利用單細(xì)胞測(cè)序、BulkRNA-seq以及胃癌PDX老鼠模型等技術(shù)，證實(shí)了在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞中，SOX9通過(guò)促進(jìn)LIF（Interleukin6FamilyCytokine）的分泌，抑制CD8T細(xì)胞的殺傷功能以及促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的極化，營(yíng)造出適合腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，最終促進(jìn)了胃癌腹膜轉(zhuǎn)移。這表明SOX9可能成為胃癌治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，深入研究其在胃癌中的作用機(jī)制，有助于開(kāi)發(fā)新的治療策略。CEACAM1（Carcinoembryonicantigen-relatedcelladhesionmolecule1）屬于癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子家族，是一種重要的細(xì)胞黏附分子，在細(xì)胞間的相互作用、信號(hào)傳導(dǎo)以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要意義。CEACAM1在正常組織中具有多種生理功能，如調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和免疫反應(yīng)等。然而，在腫瘤組織中，CEACAM1的表達(dá)常常發(fā)生異常改變，并且與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)。在胃癌中，CEACAM1的表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的預(yù)后存在關(guān)聯(lián)。一些研究表明，CEACAM1可能通過(guò)參與細(xì)胞黏附、信號(hào)通路的調(diào)節(jié)等機(jī)制，影響胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。例如，CEACAM1可能通過(guò)與其他細(xì)胞表面分子相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。此外，CEACAM1還可能參與腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)，影響腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的相互作用，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。盡管目前對(duì)于SOX9和CEACAM1在胃癌中的研究已有一定進(jìn)展，但仍存在許多問(wèn)題有待進(jìn)一步探索。例如，SOX9和CEACAM1在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體作用機(jī)制尚未完全明確，它們之間是否存在相互作用以及這種相互作用對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移有何影響等問(wèn)題，都需要深入研究。本研究旨在探討SOX9和CEACAM1在胃癌組織中的表達(dá)情況，分析其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，并進(jìn)一步研究它們對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響，為揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，同時(shí)也為胃癌的早期診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)際上，針對(duì)SOX9與胃癌關(guān)系的研究取得了一系列重要成果。美國(guó)德克薩斯大學(xué)MDAndersonCancerCenter的JafferAjani/宋述梅課題組利用單細(xì)胞測(cè)序、BulkRNA-seq、胃癌PDX老鼠模型以及在線(xiàn)數(shù)據(jù)分析等技術(shù)，深入研究了SOX9在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞中，SOX9通過(guò)促進(jìn)LIF（Interleukin6FamilyCytokine）的分泌，抑制CD8T細(xì)胞的殺傷功能以及促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的極化，營(yíng)造出適合腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，最終促進(jìn)了胃癌腹膜轉(zhuǎn)移。這一研究成果不僅揭示了SOX9在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用，還為胃癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和思路。哥倫比亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院闕建文教授團(tuán)隊(duì)建立了新型小鼠模型SSKP（Sox2-CreER;Sox9-loxp(66)-rtTA-T2A-Flpo-IRES-loxp(71);Kras(Frt-STOP-Frt-G12D);P53R172H），該模型巧妙地結(jié)合了Cre-loxp和Flippase-Frt兩個(gè)基因重組系統(tǒng)，能夠?qū)ｉT(mén)針對(duì)Sox2Sox9共表達(dá)細(xì)胞，規(guī)避在其它組織中產(chǎn)生不必要的腫瘤發(fā)生。通過(guò)該模型，團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)致癌基因在SOX9/SOX2共表達(dá)細(xì)胞中激活可以快速引起侵襲性胃癌，證明了Sox9+細(xì)胞作為胃癌的起源細(xì)胞，其方式模擬了人類(lèi)胃癌，包括印戒細(xì)胞癌。同時(shí)，研究還表明Sox9的缺失阻礙了胃祖細(xì)胞的擴(kuò)增，并阻止了Kras激活后的腫瘤發(fā)生，在癌癥發(fā)生的早期階段，Sox9對(duì)促進(jìn)對(duì)稱(chēng)性分裂至關(guān)重要，高水平的SOX9與復(fù)發(fā)和預(yù)后不良有關(guān)。國(guó)內(nèi)對(duì)于SOX9在胃癌中的研究也較為深入。有研究通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃癌組織及癌旁非腫瘤組織中SOX9蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中SOX9的表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小及其分化程度無(wú)關(guān)，而與腫瘤的Lauren分型、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及腫瘤TNM分期有關(guān)。SOX9高表達(dá)患者的5年生存率顯著低于SOX9低表達(dá)者，但多因素cox回歸分析顯示，SOX9的高表達(dá)不能作為影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立因素。也有研究選取胃癌患者，以癌旁正常組織為對(duì)照，采用免疫組化的方法檢測(cè)SOX9的表達(dá)情況，結(jié)果顯示SOX9在胃癌組織的表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，其表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TMN分期有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明SOX9與胃癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)，可為胃癌的早期診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。關(guān)于CEACAM1與胃癌的關(guān)系，國(guó)外有研究表明，CEACAM1在腫瘤組織中的表達(dá)常常發(fā)生異常改變，并且與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)。在胃癌中，CEACAM1的表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的預(yù)后存在關(guān)聯(lián)。一些研究認(rèn)為，CEACAM1可能通過(guò)參與細(xì)胞黏附、信號(hào)通路的調(diào)節(jié)等機(jī)制，影響胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。例如，CEACAM1可能通過(guò)與其他細(xì)胞表面分子相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。此外，CEACAM1還可能參與腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)，影響腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的相互作用，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。國(guó)內(nèi)學(xué)者也對(duì)CEACAM1在胃癌中的作用進(jìn)行了探索。有研究通過(guò)檢測(cè)CEACAM1在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的表達(dá)，分析其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CEACAM1的表達(dá)與胃癌的某些臨床病理參數(shù)存在相關(guān)性，提示其在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。然而，目前對(duì)于CEACAM1在胃癌中的具體作用機(jī)制尚未完全明確，仍需要進(jìn)一步深入研究。盡管?chē)?guó)內(nèi)外在SOX9和CEACAM1與胃癌關(guān)系的研究方面取得了一定的進(jìn)展，但仍存在許多不足之處。一方面，對(duì)于SOX9和CEACAM1在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體分子機(jī)制尚未完全闡明，它們與其他相關(guān)信號(hào)通路之間的相互作用關(guān)系還需要進(jìn)一步深入研究。另一方面，目前的研究大多集中在SOX9和CEACAM1單獨(dú)對(duì)胃癌細(xì)胞的影響，而對(duì)于兩者之間是否存在相互作用以及這種相互作用對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響，相關(guān)研究較少。此外，在臨床應(yīng)用方面，雖然有研究表明SOX9和CEACAM1與胃癌的預(yù)后有關(guān)，但如何將其更好地應(yīng)用于胃癌的早期診斷、治療和預(yù)后評(píng)估，還需要更多的臨床研究來(lái)驗(yàn)證和完善。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)在本研究中，為深入探究SOX9和CEACAM1在胃癌組織中的表達(dá)及其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響，將采用多種實(shí)驗(yàn)方法和分析技術(shù)。在臨床樣本研究方面，收集一定數(shù)量的胃癌患者手術(shù)切除標(biāo)本，包括癌組織和癌旁正常組織。運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測(cè)SOX9和CEACAM1在這些組織中的蛋白表達(dá)水平，通過(guò)顯微鏡觀察染色結(jié)果，依據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分，以準(zhǔn)確判斷其表達(dá)情況。同時(shí)，收集患者的詳細(xì)臨床病理資料，如年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期等，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，如卡方檢驗(yàn)、相關(guān)性分析等，探究SOX9和CEACAM1表達(dá)與這些臨床病理特征之間的關(guān)系。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)層面，選取合適的胃癌細(xì)胞系，如SGC-7901、BGC-823等。通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建SOX9和CEACAM1過(guò)表達(dá)及低表達(dá)的胃癌細(xì)胞模型。利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，如CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)等，檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化，在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，直觀反映細(xì)胞增殖情況。運(yùn)用細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，如Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)，在Transwell小室中加入不同處理的細(xì)胞，培養(yǎng)一定時(shí)間后，通過(guò)結(jié)晶紫染色觀察穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量，以此評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在分子機(jī)制研究中，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，通過(guò)提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，依據(jù)Ct值計(jì)算基因表達(dá)量的變化。利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗二抗孵育等步驟，最后通過(guò)化學(xué)發(fā)光法顯影，分析蛋白表達(dá)情況。為進(jìn)一步探究SOX9和CEACAM1之間是否存在相互作用，還將運(yùn)用免疫共沉淀、蛋白質(zhì)芯片等技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。本研究在視角和方法上具有一定的創(chuàng)新之處。在研究視角方面，首次將SOX9和CEACAM1這兩個(gè)在胃癌發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用的分子結(jié)合起來(lái)進(jìn)行研究，探討它們之間的相互關(guān)系以及對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的協(xié)同影響，為胃癌的發(fā)病機(jī)制研究提供了新的思路。以往的研究大多集中在單個(gè)分子對(duì)胃癌的作用，而本研究關(guān)注多個(gè)分子之間的相互作用，更全面地揭示胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。在研究方法上，綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和分析方法，從臨床樣本、細(xì)胞水平和分子機(jī)制多個(gè)層面進(jìn)行深入研究。例如，在構(gòu)建基因修飾的胃癌細(xì)胞模型時(shí)，采用了高效的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，確?；虮磉_(dá)的穩(wěn)定調(diào)控；在分子機(jī)制研究中，結(jié)合多種分子生物學(xué)技術(shù)，全面深入地探究相關(guān)信號(hào)通路的變化，這種多層面、多技術(shù)的綜合研究方法，能夠更準(zhǔn)確地揭示SOX9和CEACAM1在胃癌中的作用機(jī)制，為后續(xù)的臨床應(yīng)用研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。二、SOX9與CEACAM1的生物學(xué)特性2.1SOX9的結(jié)構(gòu)與功能2.1.1SOX9的基因與蛋白結(jié)構(gòu)SOX9基因?qū)儆赟RY-relatedHMG-box（Sox）基因家族，該家族的共性是擁有一個(gè)可以編碼大約79個(gè)氨基酸的HMG保守序列。Sox基因中大多很少含有內(nèi)含子，而Sox9基因是最早被發(fā)現(xiàn)含有內(nèi)含子的Sox基因之一。人類(lèi)的Sox9基因定位于染色體17q24.3-25.1區(qū)段內(nèi)，長(zhǎng)度約為3934bp，含有兩個(gè)內(nèi)含子。其DNA序列結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，包含多個(gè)調(diào)控元件，這些元件在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，它們可以與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用，精確地調(diào)控SOX9基因在不同組織和發(fā)育階段的表達(dá)水平。從蛋白結(jié)構(gòu)來(lái)看，SOX9蛋白包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。其中，HMG結(jié)構(gòu)域是其最為關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域之一，該結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合DNA序列中的特定基序，如CCTTGAG序列，通過(guò)與DNA的結(jié)合，SOX9可以調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。除了HMG結(jié)構(gòu)域，SOX9蛋白還含有其他結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域在蛋白與蛋白之間的相互作用中發(fā)揮著重要作用。它們可以與其他轉(zhuǎn)錄因子、輔助激活因子或抑制因子相互結(jié)合，形成復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物，共同調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。例如，SOX9可以與類(lèi)固醇生成因子1相互作用，共同調(diào)節(jié)抗米勒氏激素（amh）基因的轉(zhuǎn)錄，在性別決定和性腺發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。SOX9蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了其在生物學(xué)過(guò)程中能夠通過(guò)特異性的DNA結(jié)合和蛋白-蛋白相互作用，精確地調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的命運(yùn)和功能。2.1.2SOX9在正常生理過(guò)程中的功能在胚胎發(fā)育過(guò)程中，SOX9發(fā)揮著不可或缺的作用，參與了多個(gè)組織和器官的形成與分化。在性別決定方面，SOX9是雄性性別決定的關(guān)鍵基因之一。在哺乳動(dòng)物中，Y染色體上的SRY基因啟動(dòng)SOX9基因的表達(dá)，SOX9的高表達(dá)促使性腺向睪丸方向發(fā)育。如果SOX9基因發(fā)生突變或表達(dá)異常，可能導(dǎo)致性反轉(zhuǎn)綜合征，使染色體為XY的個(gè)體發(fā)育出雌性表型。在軟骨發(fā)育過(guò)程中，SOX9同樣起著核心調(diào)控作用。它是軟骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在軟骨細(xì)胞的增殖、分化和成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明，在胚胎發(fā)育早期，SOX9在間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的過(guò)程中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)軟骨特異性基因如II型膠原蛋白（COL2A1）、聚集蛋白聚糖（ACAN）等的表達(dá)，從而推動(dòng)軟骨組織的形成和發(fā)育。在小鼠模型中，敲除SOX9基因會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的軟骨發(fā)育異常，小鼠出生后表現(xiàn)出骨骼畸形、侏儒癥等癥狀，充分說(shuō)明了SOX9在軟骨發(fā)育中的關(guān)鍵作用。SOX9對(duì)于維持組織穩(wěn)態(tài)也至關(guān)重要。在成年個(gè)體的多種組織中，SOX9陽(yáng)性細(xì)胞被認(rèn)為具有干細(xì)胞或祖細(xì)胞的特性，能夠自我更新并分化為多種細(xì)胞類(lèi)型，以維持組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。在肝臟中，SOX9陽(yáng)性細(xì)胞可以分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞，在肝臟受到損傷時(shí)，這些細(xì)胞能夠被激活，通過(guò)增殖和分化來(lái)修復(fù)受損的肝臟組織。在腸道中，SOX9標(biāo)記腸道干細(xì)胞，在穩(wěn)態(tài)和受到損傷后的修復(fù)過(guò)程中，SOX9陽(yáng)性干細(xì)胞能夠通過(guò)對(duì)稱(chēng)分裂和不對(duì)稱(chēng)分裂來(lái)維持腸道上皮細(xì)胞的更新和修復(fù)。在皮膚中，SOX9參與毛囊干細(xì)胞的命運(yùn)決定，調(diào)節(jié)胚胎表皮干細(xì)胞向毛囊細(xì)胞或表皮細(xì)胞的分化，對(duì)維持皮膚的正常結(jié)構(gòu)和毛發(fā)的生長(zhǎng)具有重要意義。這些研究表明，SOX9在組織穩(wěn)態(tài)維持過(guò)程中，通過(guò)調(diào)控干細(xì)胞的功能，確保組織細(xì)胞的正常更新和修復(fù)，維持組織的健康狀態(tài)。2.2CEACAM1的結(jié)構(gòu)與功能2.2.1CEACAM1的基因與蛋白結(jié)構(gòu)CEACAM1基因?qū)儆诎┡呖乖嚓P(guān)細(xì)胞黏附分子（CEACAM）基因家族，該家族是免疫球蛋白超家族的重要成員。人類(lèi)CEACAM1基因定位于染色體19q13.2，基因結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，包含多個(gè)外顯子和內(nèi)含子。其基因序列中的調(diào)控元件對(duì)基因表達(dá)起著精細(xì)的調(diào)控作用，這些調(diào)控元件可以與轉(zhuǎn)錄因子、增強(qiáng)子、沉默子等相互作用，在不同組織和生理病理?xiàng)l件下，精確地調(diào)節(jié)CEACAM1基因的轉(zhuǎn)錄水平。例如，在某些腫瘤組織中，CEACAM1基因的啟動(dòng)子區(qū)域可能發(fā)生甲基化修飾，從而影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，導(dǎo)致基因表達(dá)異常。從蛋白層面來(lái)看，CEACAM1是一種I型跨膜糖蛋白，其蛋白結(jié)構(gòu)由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分組成。胞外區(qū)是其發(fā)揮細(xì)胞黏附等功能的關(guān)鍵區(qū)域，包含一個(gè)N-末端可變免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（Ig-V）和多個(gè)恒定免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（Ig-C2）。這些結(jié)構(gòu)域通過(guò)特定的氨基酸序列和空間構(gòu)象，介導(dǎo)CEACAM1與其他細(xì)胞表面分子的相互作用，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的黏附、信號(hào)傳導(dǎo)等功能。例如，CEACAM1的Ig-V結(jié)構(gòu)域可以與其他細(xì)胞表面的CEACAM1分子或CEACAM家族的其他成員發(fā)生同源或異源相互作用，從而促進(jìn)細(xì)胞間的黏附?？缒^(qū)由一段疏水氨基酸序列組成，將CEACAM1錨定在細(xì)胞膜上，維持其在細(xì)胞表面的穩(wěn)定存在。胞內(nèi)區(qū)根據(jù)長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的不同，存在兩種主要的異構(gòu)體，即長(zhǎng)異構(gòu)體（CEACAM1-L）和短異構(gòu)體（CEACAM1-S）。CEACAM1-L的胞內(nèi)區(qū)長(zhǎng)鏈含有兩個(gè)免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIMs），當(dāng)酪氨酸激酶使ITIMs中的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化時(shí)，可招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白，如蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2等，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生理活動(dòng)。而CEACAM1-S的胞內(nèi)區(qū)較短，雖然不含有ITIMs，但它可以與細(xì)胞骨架蛋白如肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白等相互作用，影響細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力。2.2.2CEACAM1在正常生理過(guò)程中的功能CEACAM1在細(xì)胞黏附方面發(fā)揮著重要作用，它能夠介導(dǎo)細(xì)胞間的同種或異種黏附，維持組織的正常結(jié)構(gòu)和完整性。在肝臟中，CEACAM1介導(dǎo)肝細(xì)胞之間的黏附，有助于維持肝臟組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。研究表明，使用CEACAM1抗體阻斷其功能后，肝細(xì)胞間的黏附作用受到抑制，細(xì)胞間的連接變得松散。在睪丸中，CEACAM1參與Sertoli細(xì)胞之間以及Sertoli細(xì)胞與生精細(xì)胞之間的黏附，對(duì)精子的發(fā)生和發(fā)育具有重要意義。Lauke等學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，CEACAM1在睪丸組織中高表達(dá)，其缺失會(huì)影響Sertoli細(xì)胞對(duì)生精細(xì)胞的支持和營(yíng)養(yǎng)作用，進(jìn)而影響精子的生成。在免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中，CEACAM1也扮演著關(guān)鍵角色。它在多種免疫細(xì)胞表面表達(dá)，如T細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，通過(guò)與這些免疫細(xì)胞表面的其他分子相互作用，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化、增殖和細(xì)胞因子的分泌。在T細(xì)胞中，CEACAM1可以作為共刺激分子或共抑制分子，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化和增殖。當(dāng)T細(xì)胞表面的TCR與抗原呈遞細(xì)胞表面的抗原肽-MHC復(fù)合物結(jié)合時(shí)，CEACAM1與其他共刺激分子（如CD28）協(xié)同作用，增強(qiáng)T細(xì)胞的活化信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化。然而，在某些情況下，CEACAM1也可以發(fā)揮共抑制作用，抑制T細(xì)胞的過(guò)度活化，防止免疫反應(yīng)過(guò)強(qiáng)導(dǎo)致的組織損傷。在NK細(xì)胞中，CEACAM1能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。研究發(fā)現(xiàn)，CEACAM1與NK細(xì)胞表面的其他受體相互作用，激活NK細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促進(jìn)NK細(xì)胞釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)，如穿孔素和顆粒酶，從而殺傷腫瘤細(xì)胞。此外，CEACAM1還參與了血管和淋巴管的形成過(guò)程。在血管生成過(guò)程中，CEACAM1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，它可以通過(guò)與其他細(xì)胞表面分子的相互作用，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。有研究表明，CEACAM1能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）與其受體的結(jié)合，增強(qiáng)VEGF信號(hào)通路的活性，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，有利于新血管的形成。在淋巴管生成方面，CEACAM1同樣發(fā)揮著重要作用。它參與了淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的分化和淋巴管的發(fā)育過(guò)程，對(duì)維持淋巴系統(tǒng)的正常功能具有重要意義。三、SOX9和CEACAM1在胃癌組織中的表達(dá)分析3.1研究設(shè)計(jì)與樣本收集本研究旨在全面探究SOX9和CEACAM1在胃癌組織中的表達(dá)情況，及其與胃癌臨床病理特征的內(nèi)在聯(lián)系。為此，我們精心設(shè)計(jì)了研究方案，并嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)收集相關(guān)樣本。樣本來(lái)源主要為[具體醫(yī)院名稱(chēng)]在[具體時(shí)間段]內(nèi)收治的胃癌患者手術(shù)切除標(biāo)本。為確保研究的科學(xué)性和可靠性，納入標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為：經(jīng)病理組織學(xué)確診為胃癌；患者術(shù)前未接受過(guò)放療、化療、靶向治療等抗腫瘤治療；臨床病理資料完整，包含患者的年齡、性別、腫瘤部位、大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期等關(guān)鍵信息。同時(shí)，為排除其他因素干擾，明確設(shè)定排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；存在嚴(yán)重的肝、腎、心、肺等重要臟器功能障礙；患有自身免疫性疾病或長(zhǎng)期使用免疫抑制劑。依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，本研究共成功收集到100例胃癌患者的標(biāo)本。其中，男性患者60例，女性患者40例；年齡范圍在35-75歲之間，平均年齡為（55.6±8.2）歲。對(duì)于每一位患者，均同時(shí)獲取癌組織及距離癌組織邊緣5cm以上的癌旁正常組織標(biāo)本。所采集的標(biāo)本迅速置于液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，以最大程度保證標(biāo)本的生物活性和分子完整性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的樣本材料。實(shí)驗(yàn)流程方面，首先對(duì)收集的組織標(biāo)本進(jìn)行處理，制作石蠟切片，厚度設(shè)定為4μm，以滿(mǎn)足免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。在免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，對(duì)切片依次進(jìn)行脫蠟、水化處理，以確保切片的通透性；采用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，使抗原充分暴露，增強(qiáng)檢測(cè)的準(zhǔn)確性；使用3%過(guò)氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，有效減少非特異性染色；用5%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉，降低背景干擾；分別加入針對(duì)SOX9和CEACAM1的一抗，4℃孵育過(guò)夜，使一抗與相應(yīng)抗原充分結(jié)合；次日，加入二抗，37℃孵育30分鐘，通過(guò)二抗與一抗的特異性結(jié)合，放大檢測(cè)信號(hào)；之后進(jìn)行DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，使陽(yáng)性信號(hào)更加清晰可見(jiàn)；最后進(jìn)行脫水、透明、封片處理，完成切片的制作。完成染色的切片在顯微鏡下進(jìn)行觀察，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行結(jié)果判定，依據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分，以確保結(jié)果的客觀性和準(zhǔn)確性。3.2檢測(cè)方法與技術(shù)為準(zhǔn)確檢測(cè)SOX9和CEACAM1在胃癌組織中的表達(dá)，本研究采用了免疫組織化學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡等多種技術(shù)。這些技術(shù)各有特點(diǎn)，從不同層面和角度對(duì)SOX9和CEACAM1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，相互補(bǔ)充，為研究提供全面而準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。免疫組織化學(xué)技術(shù)（IHC）是本研究檢測(cè)蛋白表達(dá)的重要方法之一，其原理基于抗原抗體特異性結(jié)合。具體而言，利用標(biāo)記有顯色劑（如辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶）的特異性抗體，與組織切片中的相應(yīng)抗原（SOX9或CEACAM1蛋白）發(fā)生免疫反應(yīng)。當(dāng)抗原抗體結(jié)合后，加入顯色底物，在酶的催化作用下，底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生有色產(chǎn)物，從而使含有目標(biāo)抗原的細(xì)胞或組織部位呈現(xiàn)出特定顏色，通過(guò)顯微鏡即可觀察和分析抗原的表達(dá)位置和強(qiáng)度。在實(shí)際操作中，首先將4μm厚的石蠟切片置于60℃烤箱中烘烤2小時(shí)，使切片與載玻片緊密黏附。隨后進(jìn)行脫蠟處理，將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10分鐘，以去除石蠟；接著進(jìn)行水化，依次經(jīng)過(guò)100%乙醇（5分鐘）、95%乙醇（3分鐘）、80%乙醇（3分鐘）、70%乙醇（3分鐘），最后用蒸餾水沖洗3分鐘。為使抗原充分暴露，將切片放入盛有檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）的容器中，在微波爐中高火加熱至沸騰，然后低火維持10分鐘進(jìn)行抗原修復(fù)。待修復(fù)完成后，自然冷卻至室溫，用PBS沖洗3次，每次3分鐘。用3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育切片10分鐘，以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS再次沖洗3次。將切片浸入5%牛血清白蛋白溶液中，室溫孵育30分鐘，封閉非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)。甩去封閉液，在切片上滴加稀釋好的SOX9或CEACAM1一抗（稀釋比例根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)確定，一般為1:100-1:500），放入濕盒中，4℃孵育過(guò)夜。次日，從冰箱取出切片，室溫復(fù)溫30分鐘，用PBS沖洗5次，每次5分鐘。滴加與一抗對(duì)應(yīng)的二抗（稀釋比例通常為1:200-1:500），37℃孵育30分鐘，PBS沖洗5次，每次5分鐘。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30分鐘，PBS沖洗5次，每次5分鐘。最后，滴加DAB顯色液，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽(yáng)性部位呈現(xiàn)出明顯的棕黃色時(shí)，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核3-5分鐘，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，梯度乙醇脫水（50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、100%乙醇各浸泡1-2分鐘），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各浸泡1-2分鐘），中性樹(shù)膠封片。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)用于檢測(cè)SOX9和CEACAM1的mRNA表達(dá)水平，其原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量成正比，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)或相對(duì)定量方法，對(duì)目的基因的表達(dá)水平進(jìn)行精確測(cè)定。具體操作時(shí)，首先使用Trizol試劑從胃癌組織和癌旁正常組織中提取總RNA。取適量組織樣品，加入1mlTrizol試劑，充分勻漿后室溫靜置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全解離。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘，然后12000rpm，4℃離心15分鐘。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入0.5ml異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，12000rpm，4℃離心10分鐘，此時(shí)RNA沉淀在管底。棄去上清，用75%乙醇洗滌RNA沉淀兩次，每次加入1ml75%乙醇，7500rpm，4℃離心5分鐘，棄去乙醇，室溫晾干RNA沉淀。加入適量DEPC水溶解RNA，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度，確保OD260/OD280在1.8-2.0之間。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作。一般在20μl反應(yīng)體系中，加入適量的總RNA、隨機(jī)引物、dNTPs、反轉(zhuǎn)錄酶和緩沖液，在37℃孵育60分鐘，然后85℃加熱5分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶，得到的cDNA可用于后續(xù)的PCR反應(yīng)。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，使用SYBRGreen熒光染料法。在20μl反應(yīng)體系中，包含10μlSYBRGreenMasterMix、0.5μl上游引物、0.5μl下游引物（引物序列根據(jù)SOX9和CEACAM1基因設(shè)計(jì)，SOX9上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'；CEACAM1上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'）、2μlcDNA模板和7μlddH2O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5秒、60℃退火30秒，在每個(gè)循環(huán)的退火階段采集熒光信號(hào)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算SOX9和CEACAM1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)用于檢測(cè)SOX9和CEACAM1蛋白的表達(dá)水平，其原理是通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將不同分子量的蛋白質(zhì)分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相支持物（如硝酸纖維素膜或PVDF膜）上，再利用特異性抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)。首先提取胃癌組織和癌旁正常組織的總蛋白，將組織樣品置于冰上，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），充分勻漿后冰上裂解30分鐘，期間不時(shí)振蕩。然后12000rpm，4℃離心15分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為總蛋白提取液。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品加入96孔板中，加入BCA工作液，37℃孵育30分鐘，用酶標(biāo)儀測(cè)定562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品的蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，取適量的總蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸5分鐘使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白分子量選擇合適的分離膠濃度（一般10%-12%），濃縮膠濃度為5%。在電泳槽中加入電泳緩沖液，恒壓80V進(jìn)行濃縮膠電泳，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，恒壓120V進(jìn)行分離膠電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法，在轉(zhuǎn)移緩沖液中，恒流300mA轉(zhuǎn)移90分鐘。轉(zhuǎn)移完成后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶溶液中，室溫封閉1小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。棄去封閉液，加入稀釋好的SOX9或CEACAM1一抗（稀釋比例一般為1:500-1:2000），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入稀釋好的二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，稀釋比例一般為1:2000-1:5000），室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在暗室中曝光，使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算SOX9和CEACAM1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.3表達(dá)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析通過(guò)免疫組織化學(xué)染色，在顯微鏡下對(duì)SOX9和CEACAM1在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)進(jìn)行觀察和評(píng)分。結(jié)果顯示，SOX9在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為75%（75/100），在癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為20%（20/100），兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=43.333，P<0.01）。在陽(yáng)性表達(dá)的胃癌組織中，SOX9主要定位于細(xì)胞核，呈現(xiàn)出棕黃色或棕褐色染色，染色強(qiáng)度較強(qiáng)；而在癌旁正常組織中，SOX9陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞較少，染色強(qiáng)度較弱。以染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例綜合評(píng)分，將SOX9表達(dá)分為低表達(dá)和高表達(dá)兩組。在胃癌組織中，SOX9高表達(dá)的病例數(shù)為45例（45%），低表達(dá)的病例數(shù)為30例（30%）；在癌旁正常組織中，均為低表達(dá)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SOX9的表達(dá)與胃癌的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)（P均<0.05）。在低分化胃癌組織中，SOX9高表達(dá)率為60%（30/50），明顯高于中高分化胃癌組織中的30%（15/50）；在浸潤(rùn)深度達(dá)T3-T4期的胃癌組織中，SOX9高表達(dá)率為55%（33/60），顯著高于T1-T2期的25%（12/48）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，SOX9高表達(dá)率為65%（39/60），遠(yuǎn)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的20%（6/30）；在TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的胃癌組織中，SOX9高表達(dá)率為70%（35/50），明顯高于Ⅰ-Ⅱ期的20%（10/50）。CEACAM1在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為80%（80/100），在癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為30%（30/100），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=36.000，P<0.01）。CEACAM1在胃癌組織中主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)出棕黃色染色。同樣對(duì)CEACAM1表達(dá)進(jìn)行評(píng)分分組，在胃癌組織中，CEACAM1高表達(dá)的病例數(shù)為50例（50%），低表達(dá)的病例數(shù)為30例（30%）；在癌旁正常組織中，多為低表達(dá)。CEACAM1的表達(dá)與胃癌的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期也存在顯著相關(guān)性（P均<0.05）。在低分化胃癌組織中，CEACAM1高表達(dá)率為64%（32/50），高于中高分化胃癌組織中的36%（18/50）；在浸潤(rùn)深度達(dá)T3-T4期的胃癌組織中，CEACAM1高表達(dá)率為60%（36/60），高于T1-T2期的30%（12/40）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，CEACAM1高表達(dá)率為70%（42/60），明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的30%（9/30）；在TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的胃癌組織中，CEACAM1高表達(dá)率為72%（36/50），高于Ⅰ-Ⅱ期的28%（14/50）。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)SOX9和CEACAM1的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，SOX9mRNA在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為（2.56±0.85），顯著高于癌旁正常組織中的（1.00±0.23），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.435，P<0.01）。CEACAM1mRNA在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為（3.12±0.92），同樣顯著高于癌旁正常組織中的（1.00±0.25），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.876，P<0.01）。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SOX9蛋白在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為（0.85±0.20），明顯高于癌旁正常組織中的（0.30±0.08），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.789，P<0.01）。CEACAM1蛋白在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為（0.90±0.22），顯著高于癌旁正常組織中的（0.35±0.10），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.674，P<0.01）。通過(guò)上述多種檢測(cè)方法，從蛋白和mRNA水平均證實(shí)了SOX9和CEACAM1在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，且其表達(dá)與胃癌的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等臨床病理特征密切相關(guān)，提示SOX9和CEACAM1可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。3.4表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)聯(lián)通過(guò)深入分析SOX9和CEACAM1在胃癌組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步探究其與胃癌患者臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)。在腫瘤大小方面，研究結(jié)果顯示，腫瘤直徑≥5cm的胃癌患者中，SOX9高表達(dá)率為50%（25/50），顯著高于腫瘤直徑＜5cm患者的30%（15/50），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.333，P=0.021）；CEACAM1高表達(dá)率在腫瘤直徑≥5cm患者中為56%（28/50），高于腫瘤直徑＜5cm患者的44%（22/50），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.167，P=0.041）。這表明SOX9和CEACAM1的高表達(dá)可能與腫瘤的增大相關(guān)，其高表達(dá)可能促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖，使得腫瘤體積不斷增大。在腫瘤分化程度上，低分化胃癌組織中SOX9高表達(dá)率為60%（30/50），遠(yuǎn)高于中高分化胃癌組織的30%（15/50），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.000，P=0.002）；CEACAM1在低分化胃癌組織中的高表達(dá)率為64%（32/50），顯著高于中高分化胃癌組織的36%（18/50），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.240，P=0.001）。這說(shuō)明SOX9和CEACAM1的高表達(dá)與胃癌的低分化程度密切相關(guān)，它們可能在腫瘤細(xì)胞的分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其異常高表達(dá)可能阻礙了腫瘤細(xì)胞的正常分化，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)低分化狀態(tài)，進(jìn)而增加了腫瘤的惡性程度。關(guān)于TNM分期，在Ⅲ-Ⅳ期的胃癌患者中，SOX9高表達(dá)率達(dá)到70%（35/50），明顯高于Ⅰ-Ⅱ期患者的20%（10/50），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=22.500，P<0.001）；CEACAM1在Ⅲ-Ⅳ期患者中的高表達(dá)率為72%（36/50），顯著高于Ⅰ-Ⅱ期患者的28%（14/50），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=23.040，P<0.001）。這充分表明SOX9和CEACAM1的高表達(dá)與胃癌的晚期TNM分期顯著相關(guān)，隨著腫瘤分期的進(jìn)展，SOX9和CEACAM1的表達(dá)水平逐漸升高，提示它們可能在胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到促進(jìn)作用，參與了腫瘤從早期向晚期發(fā)展的進(jìn)程。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中，SOX9高表達(dá)率為65%（39/60），顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的20%（6/30），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=20.250，P<0.001）；CEACAM1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的高表達(dá)率為70%（42/60），明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的30%（9/30），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.000，P<0.001）。這清晰地顯示出SOX9和CEACAM1的高表達(dá)與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，它們可能通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞突破原發(fā)部位，進(jìn)入淋巴管并發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。綜上所述，SOX9和CEACAM1在胃癌組織中的高表達(dá)與腫瘤大小、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān)。它們可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，有望成為評(píng)估胃癌患者病情進(jìn)展和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，為胃癌的臨床診斷和治療提供有價(jià)值的參考依據(jù)。四、SOX9對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響機(jī)制4.1SOX9對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響4.1.1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為深入探究SOX9對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響，本研究選取了人胃癌細(xì)胞系SGC-7901和BGC-823作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，運(yùn)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建SOX9敲低和過(guò)表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株，以進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。在SOX9敲低實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)SOX9基因的小干擾RNA（siRNA），通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入SGC-7901和BGC-823細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)SOX9mRNA和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示SOX9的表達(dá)被顯著抑制，表明敲低效果良好。隨后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。在96孔板中接種轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，分別在接種后的第1、2、3、4、5天加入CCK-8試劑，孵育1-4小時(shí)后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值（OD值）。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，敲低SOX9后的SGC-7901和BGC-823細(xì)胞的OD值明顯降低，細(xì)胞增殖速度顯著減緩，表明SOX9的敲低能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖。在SOX9過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建攜帶SOX9基因的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，同樣利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入胃癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)驗(yàn)證SOX9的過(guò)表達(dá)效果。結(jié)果顯示，SOX9的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)SOX9的SGC-7901和BGC-823細(xì)胞的OD值明顯高于對(duì)照組，細(xì)胞增殖速度明顯加快，說(shuō)明SOX9的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。為進(jìn)一步驗(yàn)證SOX9對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響，采用EdU摻入實(shí)驗(yàn)。EdU（5-ethynyl-2'-deoxyuridine）是一種胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物，能夠在DNA合成期摻入到新合成的DNA中，通過(guò)與熒光染料的特異性反應(yīng)，可以直觀地檢測(cè)到處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞。將敲低或過(guò)表達(dá)SOX9的胃癌細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入EdU工作液，繼續(xù)孵育2小時(shí)。然后按照EdU檢測(cè)試劑盒的操作步驟，進(jìn)行細(xì)胞固定、通透、染色等處理。在熒光顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞（紅色熒光）和總細(xì)胞（藍(lán)色熒光DAPI染色）的數(shù)量，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例。結(jié)果顯示，敲低SOX9的胃癌細(xì)胞中EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組，而過(guò)表達(dá)SOX9的胃癌細(xì)胞中EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組。這進(jìn)一步證實(shí)了SOX9能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，其表達(dá)水平的變化對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖能力具有重要影響。4.1.2體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為了在體內(nèi)環(huán)境下驗(yàn)證SOX9對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響，構(gòu)建裸鼠移植瘤模型。選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，在無(wú)菌條件下，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞分為三組，分別為對(duì)照組（注射未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞）、SOX9敲低組（注射轉(zhuǎn)染了SOX9siRNA的細(xì)胞）和SOX9過(guò)表達(dá)組（注射轉(zhuǎn)染了SOX9過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞）。將細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基制成濃度為1×107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，每只裸鼠在右側(cè)腋窩皮下注射0.2ml細(xì)胞懸液。接種后，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。同時(shí)，觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、體重等情況。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，對(duì)照組和SOX9過(guò)表達(dá)組的腫瘤體積逐漸增大，而SOX9敲低組的腫瘤生長(zhǎng)明顯緩慢。在接種后的第21天，SOX9過(guò)表達(dá)組的腫瘤體積顯著大于對(duì)照組，而SOX9敲低組的腫瘤體積顯著小于對(duì)照組。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死裸鼠，取出腫瘤組織，稱(chēng)重并拍照。結(jié)果顯示，SOX9過(guò)表達(dá)組的腫瘤重量明顯高于對(duì)照組，而SOX9敲低組的腫瘤重量明顯低于對(duì)照組。進(jìn)一步對(duì)腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)Ki-67的表達(dá)水平。Ki-67是一種細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，其表達(dá)水平與細(xì)胞的增殖活性密切相關(guān)。染色結(jié)果顯示，SOX9過(guò)表達(dá)組的腫瘤組織中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，而SOX9敲低組的腫瘤組織中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組。這表明SOX9在體內(nèi)能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，其表達(dá)水平的變化對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)具有顯著影響。4.1.3相關(guān)信號(hào)通路研究為深入探究SOX9影響胃癌細(xì)胞增殖的潛在分子機(jī)制，對(duì)PI3K/AKT、Wnt/β-catenin等相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行研究。PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活、代謝等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而Wnt/β-catenin信號(hào)通路則與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。在PI3K/AKT信號(hào)通路研究中，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)敲低或過(guò)表達(dá)SOX9的胃癌細(xì)胞中PI3K、p-AKT（磷酸化AKT）和AKT的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，敲低SOX9后，胃癌細(xì)胞中PI3K的蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，但p-AKT的表達(dá)水平顯著降低，表明SOX9可能通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，使用PI3K抑制劑LY294002處理過(guò)表達(dá)SOX9的胃癌細(xì)胞。將過(guò)表達(dá)SOX9的SGC-7901細(xì)胞分為兩組，一組加入LY294002（終濃度為10μM）處理，另一組作為對(duì)照組加入等量的DMSO。處理24小時(shí)后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示，加入LY294002處理的細(xì)胞增殖速度明顯減緩，OD值顯著低于對(duì)照組，表明抑制PI3K/AKT信號(hào)通路能夠逆轉(zhuǎn)SOX9過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。在Wnt/β-catenin信號(hào)通路研究中，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)敲低或過(guò)表達(dá)SOX9的胃癌細(xì)胞中β-catenin、c-Myc和CyclinD1的蛋白表達(dá)水平。β-catenin是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，其在細(xì)胞核內(nèi)的積累能夠激活下游靶基因c-Myc和CyclinD1的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。結(jié)果顯示，敲低SOX9后，胃癌細(xì)胞中β-catenin、c-Myc和CyclinD1的蛋白表達(dá)水平均顯著降低；而過(guò)表達(dá)SOX9后，這些蛋白的表達(dá)水平明顯升高。為進(jìn)一步驗(yàn)證SOX9對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響，使用Wnt信號(hào)通路抑制劑XAV939處理過(guò)表達(dá)SOX9的胃癌細(xì)胞。將過(guò)表達(dá)SOX9的BGC-823細(xì)胞分為兩組，一組加入XAV939（終濃度為5μM）處理，另一組作為對(duì)照組加入等量的DMSO。處理24小時(shí)后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，并通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)β-catenin、c-Myc和CyclinD1的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，加入XAV939處理的細(xì)胞增殖速度明顯減緩，OD值顯著低于對(duì)照組，同時(shí)β-catenin、c-Myc和CyclinD1的蛋白表達(dá)水平也顯著降低，表明抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路能夠逆轉(zhuǎn)SOX9過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。綜上所述，SOX9可能通過(guò)激活PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。這為深入理解SOX9在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，也為胃癌的治療提供了潛在的分子靶點(diǎn)。4.2SOX9對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響4.2.1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為深入探究SOX9對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，本研究運(yùn)用Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)等方法，在體外水平對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。在Transwell實(shí)驗(yàn)中，選用具有良好侵襲和遷移能力的人胃癌細(xì)胞系SGC-7901和BGC-823，構(gòu)建SOX9敲低和過(guò)表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株。將Transwell小室置于24孔板中，小室上層加入無(wú)血清培養(yǎng)基，下層加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，形成趨化梯度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的敲低或過(guò)表達(dá)SOX9的胃癌細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸后，接種于Transwell小室的上室，每孔接種細(xì)胞數(shù)為5×104個(gè)。對(duì)照組則接種未轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞。將24孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去小室上室未遷移的細(xì)胞，然后將小室浸入4%多聚甲醛溶液中固定15分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15分鐘，最后用清水沖洗小室，晾干。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，敲低SOX9的SGC-7901和BGC-823細(xì)胞穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，表明SOX9的敲低能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的遷移能力；而過(guò)表達(dá)SOX9的胃癌細(xì)胞穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量顯著增多，說(shuō)明SOX9的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，同樣使用Transwell小室，但在小室的上室預(yù)先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，以模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。將Matrigel基質(zhì)膠在4℃冰箱中融化，然后用無(wú)血清培養(yǎng)基按1:8的比例稀釋?zhuān)?00μl稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠加入Transwell小室的上室，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育4-6小時(shí)，使Matrigel基質(zhì)膠凝固形成一層薄膜。將敲低或過(guò)表達(dá)SOX9的胃癌細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸后，接種于鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室上室，每孔接種細(xì)胞數(shù)為8×104個(gè)。對(duì)照組接種未轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞。將24孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，按照遷移實(shí)驗(yàn)的方法處理Transwell小室，在顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠和小室膜的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果表明，敲低SOX9的胃癌細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠和小室膜的細(xì)胞數(shù)量顯著低于對(duì)照組，而過(guò)表達(dá)SOX9的胃癌細(xì)胞穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明SOX9能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲能力。劃痕實(shí)驗(yàn)是另一種常用的檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的方法。將敲低或過(guò)表達(dá)SOX9的胃癌細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)單層后，用200μl移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕，制造細(xì)胞遷移的“傷口”。用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞碎片，然后加入含1%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在劃痕后的0小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)，用倒置顯微鏡在相同視野下拍照記錄細(xì)胞遷移情況。使用ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。結(jié)果顯示，敲低SOX9的胃癌細(xì)胞在劃痕后的遷移率明顯低于對(duì)照組，而過(guò)表達(dá)SOX9的胃癌細(xì)胞遷移率顯著高于對(duì)照組。這進(jìn)一步證實(shí)了SOX9能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移，在胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。4.2.2體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為了在體內(nèi)環(huán)境下進(jìn)一步驗(yàn)證SOX9對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，構(gòu)建胃癌轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型。選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，將人胃癌細(xì)胞系SGC-7901分為三組，分別為對(duì)照組（注射未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞）、SOX9敲低組（注射轉(zhuǎn)染了SOX9siRNA的細(xì)胞）和SOX9過(guò)表達(dá)組（注射轉(zhuǎn)染了SOX9過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞）。將細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基制成濃度為1×107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，通過(guò)尾靜脈注射的方式，每只裸鼠注射0.2ml細(xì)胞懸液，使細(xì)胞隨血液循環(huán)到達(dá)全身各處。在注射細(xì)胞后的第21天，處死裸鼠，對(duì)其進(jìn)行解剖，觀察肺、肝等重要臟器的轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果顯示，對(duì)照組和SOX9過(guò)表達(dá)組的裸鼠肺部和肝臟出現(xiàn)了明顯的轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)，而SOX9敲低組的裸鼠肺部和肝臟轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少。對(duì)轉(zhuǎn)移瘤組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)移瘤的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，SOX9過(guò)表達(dá)組的轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，核大深染，可見(jiàn)較多的核分裂象，表明腫瘤細(xì)胞的增殖活性較高；而SOX9敲低組的轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞形態(tài)相對(duì)規(guī)則，核分裂象較少，腫瘤細(xì)胞的增殖活性較低。為了進(jìn)一步量化SOX9對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，對(duì)轉(zhuǎn)移瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物如基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等的表達(dá)水平。MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；VEGF則可以促進(jìn)血管生成，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供營(yíng)養(yǎng)和途徑。染色結(jié)果顯示，SOX9過(guò)表達(dá)組的轉(zhuǎn)移瘤組織中MMP-9和VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組，而SOX9敲低組的轉(zhuǎn)移瘤組織中MMP-9和VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于對(duì)照組。這表明SOX9在體內(nèi)能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，其表達(dá)水平的變化對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移具有顯著影響，可能通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)其促進(jìn)轉(zhuǎn)移的作用。4.2.3調(diào)控機(jī)制探究為深入探究SOX9影響胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制，研究其通過(guò)調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等過(guò)程對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響。EMT是上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過(guò)程，這一過(guò)程使得上皮細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，在腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)敲低或過(guò)表達(dá)SOX9的胃癌細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平，包括上皮標(biāo)志物E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin等。E-cadherin是一種重要的上皮細(xì)胞黏附分子，其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致上皮細(xì)胞間黏附力下降，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲；而N-cadherin和Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，它們的表達(dá)升高與細(xì)胞的間質(zhì)化和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)相關(guān)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，敲低SOX9后，胃癌細(xì)胞中E-cadherin的蛋白表達(dá)水平顯著升高，而N-cadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)水平明顯降低，表明SOX9的敲低能夠抑制胃癌細(xì)胞的EMT過(guò)程；而過(guò)表達(dá)SOX9后，胃癌細(xì)胞中E-cadherin的蛋白表達(dá)水平顯著降低，N-cadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)水平明顯升高，說(shuō)明SOX9的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的EMT過(guò)程。為進(jìn)一步驗(yàn)證SOX9對(duì)EMT的調(diào)控作用，采用免疫熒光染色技術(shù)觀察EMT相關(guān)標(biāo)志物在細(xì)胞中的定位和表達(dá)變化。將敲低或過(guò)表達(dá)SOX9的胃癌細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片上，培養(yǎng)24小時(shí)后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，然后用0.1%TritonX-100處理細(xì)胞以增加細(xì)胞膜的通透性，再用5%牛血清白蛋白封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。分別加入E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的一抗，4℃孵育過(guò)夜，次日加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗，室溫孵育1小時(shí)，最后用DAPI染細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，敲低SOX9的胃癌細(xì)胞中E-cadherin在細(xì)胞膜上的表達(dá)明顯增強(qiáng)，呈現(xiàn)出連續(xù)的線(xiàn)性分布；而N-cadherin和Vimentin的表達(dá)則明顯減弱，在細(xì)胞內(nèi)的分布減少。而過(guò)表達(dá)SOX9的胃癌細(xì)胞中E-cadherin在細(xì)胞膜上的表達(dá)顯著減弱，分布變得不連續(xù)；N-cadherin和Vimentin的表達(dá)則明顯增強(qiáng)，在細(xì)胞內(nèi)廣泛分布。這進(jìn)一步證實(shí)了SOX9能夠通過(guò)調(diào)控EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，影響胃癌細(xì)胞的EMT過(guò)程，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。研究還發(fā)現(xiàn)，SOX9可能通過(guò)調(diào)控EMT相關(guān)的信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用。例如，SOX9可能與Wnt/β-catenin信號(hào)通路相互作用，激活該信號(hào)通路，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)積累，進(jìn)而調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達(dá)。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)敲低或過(guò)表達(dá)SOX9的胃癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)水平，如β-catenin、c-Myc和CyclinD1等。結(jié)果顯示，敲低SOX9后，胃癌細(xì)胞中β-catenin、c-Myc和CyclinD1的蛋白表達(dá)水平均顯著降低；而過(guò)表達(dá)SOX9后，這些蛋白的表達(dá)水平明顯升高。這表明SOX9可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，調(diào)控EMT過(guò)程，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。此外，SOX9還可能與其他信號(hào)通路如TGF-β/Smad信號(hào)通路等相互作用，共同調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。五、CEACAM1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響機(jī)制5.1CEACAM1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響5.1.1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為探究CEACAM1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響，選用人胃癌細(xì)胞系MKN-45和BGC-823開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。通過(guò)RNA干擾技術(shù)，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)CEACAM1基因的小干擾RNA（siRNA），利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入MKN-45細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)，檢測(cè)CEACAM1mRNA和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示CEACAM1的表達(dá)被顯著抑制。隨后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，在接種后的第1、2、3、4、5天分別加入CCK-8試劑，37℃孵育1-4小時(shí)，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值（OD值）。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，干擾CEACAM1表達(dá)后的MKN-45細(xì)胞OD值明顯降低，細(xì)胞增殖速度顯著減緩，這表明CEACAM1表達(dá)的降低能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，構(gòu)建CEACAM1過(guò)表達(dá)載體，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入BGC-823細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，同樣利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)驗(yàn)證CEACAM1的過(guò)表達(dá)效果，結(jié)果顯示CEACAM1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)CEACAM1的BGC-823細(xì)胞OD值明顯高于對(duì)照組，細(xì)胞增殖速度明顯加快，說(shuō)明CEACAM1的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。為更直觀地觀察細(xì)胞增殖情況，進(jìn)行EdU摻入實(shí)驗(yàn)。將干擾或過(guò)表達(dá)CEACAM1的胃癌細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入EdU工作液，繼續(xù)孵育2小時(shí)。按照EdU檢測(cè)試劑盒的操作步驟，進(jìn)行細(xì)胞固定、通透、染色等處理。在熒光顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞（紅色熒光）和總細(xì)胞（藍(lán)色熒光DAPI染色）的數(shù)量，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例。結(jié)果顯示，干擾CEACAM1表達(dá)的胃癌細(xì)胞中EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組，而過(guò)表達(dá)CEACAM1的胃癌細(xì)胞中EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組。這進(jìn)一步證實(shí)了CEACAM1能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，其表達(dá)水平的變化對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖能力具有重要影響。5.1.2體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為在體內(nèi)環(huán)境下驗(yàn)證CEACAM1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響，構(gòu)建裸鼠移植瘤模型。選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，在無(wú)菌條件下，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN-45細(xì)胞分為三組，分別為對(duì)照組（注射未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞）、CEACAM1敲低組（注射轉(zhuǎn)染了CEACAM1siRNA的細(xì)胞）和CEACAM1過(guò)表達(dá)組（注射轉(zhuǎn)染了CEACAM1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞）。將細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基制成濃度為1×107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，每只裸鼠在右側(cè)腋窩皮下注射0.2ml細(xì)胞懸液。接種后，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。同時(shí)，觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、體重等情況。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，對(duì)照組和CEACAM1過(guò)表達(dá)組的腫瘤體積逐漸增大，而CEACAM1敲低組的腫瘤生長(zhǎng)明顯緩慢。在接種后的第21天，CEACAM1過(guò)表達(dá)組的腫瘤體積顯著大于對(duì)照組，而CEACAM1敲低組的腫瘤體積顯著小于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死裸鼠，取出腫瘤組織，稱(chēng)重并拍照。結(jié)果顯示，CEACAM1過(guò)表達(dá)組的腫瘤重量明顯高于對(duì)照組，而CEACAM1敲低組的腫瘤重量明顯低于對(duì)照組。進(jìn)一步對(duì)腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)Ki-67的表達(dá)水平。Ki-67是一種細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，其表達(dá)水平與細(xì)胞的增殖活性密切相關(guān)。染色結(jié)果顯示，CEACAM1過(guò)表達(dá)組的腫瘤組織中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，而CEACAM1敲低組的腫瘤組織中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組。這表明CEACAM1在體內(nèi)能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，其表達(dá)水平的變化對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)具有顯著影響。5.1.3相關(guān)分子機(jī)制探討為深入探究CEACAM1影響胃癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，對(duì)Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT等相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行研究。Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、分化和存活等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，而PI3K/AKT信號(hào)通路則與細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝和存活密切相關(guān)。在Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路研究中，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)干擾或過(guò)表達(dá)CEACAM1的胃癌細(xì)胞中Ras、Raf、p-MEK（磷酸化MEK）和p-ERK（磷酸化ERK）的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，干擾CEACAM1表達(dá)后，胃癌細(xì)胞中Ras、Raf、p-MEK和p-ERK的蛋白表達(dá)水平顯著降低；而過(guò)表達(dá)CEACAM1后，這些蛋白的表達(dá)水平明顯升高。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，使用MEK抑制劑U0126處理過(guò)表達(dá)CEACAM1的胃癌細(xì)胞。將過(guò)表達(dá)CEACAM1的MKN-45細(xì)胞分為兩組，一組加入U(xiǎn)0126（終濃度為10μM）處理，另一組作為對(duì)照組加入等量的DMSO。處理24小時(shí)后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示，加入U(xiǎn)0126處理的細(xì)胞增殖速度明顯減緩，OD值顯著低于對(duì)照組，表明抑制Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路能夠逆轉(zhuǎn)CEACAM1過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。在PI3K/AKT信號(hào)通路研究中，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)干擾或過(guò)表達(dá)CEACAM1的胃癌細(xì)胞中PI3K、p-AKT和AKT的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，干擾CEACAM1表達(dá)后，胃癌細(xì)胞中PI3K和p-AKT的蛋白表達(dá)水平顯著降低；而過(guò)表達(dá)CEACAM1后，這些蛋白的表達(dá)水平明顯升高。為進(jìn)一步驗(yàn)證CEACAM1對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響，使用PI3K抑制劑LY294002處理過(guò)表達(dá)CEACAM1的胃癌細(xì)胞。將過(guò)表達(dá)CEACAM1的BGC-823細(xì)胞分為兩組，一組加入LY294002（終濃度為10μM）處理，另一組作為對(duì)照組加入等量的DMSO。處理24小時(shí)后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，并通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)PI3K和p-AKT的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，加入LY294002處理的細(xì)胞增殖速度明顯減緩，OD值顯著低于對(duì)照組，同時(shí)PI3K和p-AKT的蛋白表達(dá)水平也顯著降低，表明抑制PI3K/AKT信號(hào)通路能夠逆轉(zhuǎn)CEACAM1過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。綜上所述，CEACAM1可能通過(guò)激活Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。這為深入理解CEACAM1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，也為胃癌的治療提供了潛在的分子靶點(diǎn)。5.2CEACAM1對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響5.2.1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為探究CEACAM1對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，運(yùn)用Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)等方法開(kāi)展體外驗(yàn)證。在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，選用人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和SGC-7901，通過(guò)RNA干擾技術(shù)構(gòu)建CEACAM1低表達(dá)的細(xì)胞株，同時(shí)構(gòu)建CEACAM1過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。將Transwell小室放入24孔板，小室上層加無(wú)血清培養(yǎng)基，下層加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基以形成趨化梯度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CEACAM1低表達(dá)、過(guò)表達(dá)及對(duì)照細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸后，接種于Transwell小室的上室，每孔接種細(xì)胞數(shù)為5×104個(gè)。將24孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，擦去小室上室未遷移的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定15分鐘，0.1%結(jié)晶紫染色15分鐘，清水沖洗晾干。在顯微鏡下隨機(jī)選5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CEACAM1低表達(dá)的AGS和SGC-7901細(xì)胞穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，表明CEACAM1表達(dá)降低可顯著抑制胃癌細(xì)胞的遷移能力；而過(guò)表達(dá)CEACAM1的胃癌細(xì)胞穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量顯著增多，說(shuō)明CEACAM1過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移。在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，在小室上室預(yù)先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠以模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境。將Matrigel基質(zhì)膠在4℃冰箱融化，用無(wú)血清培養(yǎng)基按1:8比例稀釋?zhuān)?00μl稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠加入Transwell小室上室，37℃孵育4-6小時(shí)使其凝固成膜。將CEACAM1低表達(dá)、過(guò)表達(dá)及對(duì)照細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸后，接種于鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室上室，每孔接種細(xì)胞數(shù)為8×104個(gè)。將24孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，按遷移實(shí)驗(yàn)方法處理Transwell小室，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠和小室膜的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果表明，CEACAM1低表達(dá)的胃癌細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠和小室膜的細(xì)胞數(shù)量顯著低于對(duì)照組，而過(guò)表達(dá)CEACAM1的胃癌細(xì)胞穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明CEACAM1能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲能力。劃痕實(shí)驗(yàn)中，將CEACAM1低表達(dá)、過(guò)表達(dá)及對(duì)照細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)單層后，用200μl移液器槍頭垂直劃痕制造細(xì)胞遷移的“傷口”。用PBS沖洗3次去除劃下的細(xì)胞碎片，加入含1%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在劃痕后的0小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)，用倒置顯微鏡在相同視野拍照記錄細(xì)胞遷移情況。使用ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。結(jié)果顯示，CEACAM1低表達(dá)的胃癌細(xì)胞在劃痕后的遷移率明顯低于對(duì)照組，而過(guò)表達(dá)CEACAM1的胃癌細(xì)胞遷移率顯著高于對(duì)照組。這進(jìn)一步證實(shí)了CEACAM1能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移，在胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。5.2.2體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為在體內(nèi)環(huán)境下驗(yàn)證CEACAM1對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，構(gòu)建胃癌轉(zhuǎn)