CpG ODN對(duì)哮喘小鼠TSLP、IL - 17表達(dá)影響及作用機(jī)制研究VIP

CpGODN對(duì)哮喘小鼠TSLP、IL-17表達(dá)影響及作用機(jī)制研究一、引言1.1研究背景與意義支氣管哮喘作為一種常見(jiàn)的慢性炎癥性氣道疾病，在全球范圍內(nèi)影響著大量人群。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有3億哮喘患者，且其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。在中國(guó)，20歲及以上人群哮喘患病率達(dá)4.2%，患者總數(shù)高達(dá)4570萬(wàn)，其中55%-70%的患者病情控制不佳。哮喘不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，導(dǎo)致日?；顒?dòng)受限、睡眠障礙等，還帶來(lái)了沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，包括醫(yī)療費(fèi)用支出、工作和學(xué)習(xí)時(shí)間的損失等。目前，哮喘的治療主要以吸入性糖皮質(zhì)激素（ICS）聯(lián)合長(zhǎng)效β2受體激動(dòng)劑（LABA）等藥物為主。然而，仍有部分患者對(duì)現(xiàn)有治療方案反應(yīng)不佳，癥狀難以得到有效控制，且長(zhǎng)期使用這些藥物可能引發(fā)一系列不良反應(yīng)，如骨質(zhì)疏松、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、腎上腺功能抑制等，這使得開(kāi)發(fā)新的治療方法和藥物成為哮喘研究領(lǐng)域的迫切需求。近年來(lái)，免疫治療成為哮喘治療研究的熱點(diǎn)方向之一。含非甲基化胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤的寡核苷酸鏈（CpGODN）作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，具有獨(dú)特的免疫刺激特性，能夠激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1型免疫反應(yīng)，下調(diào)Th2型反應(yīng)，調(diào)控免疫應(yīng)答類(lèi)型。在哮喘動(dòng)物模型研究中，已證實(shí)CpGODN能夠有效地抑制氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性及氣道重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展，顯示出在哮喘治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）和白細(xì)胞介素17（IL-17）在哮喘的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色。TSLP是一種主要由氣道上皮表達(dá)的細(xì)胞因子，在環(huán)境損傷時(shí)釋放，引發(fā)一系列下游炎癥過(guò)程，與哮喘患者的氣道炎癥、疾病嚴(yán)重程度和肺功能密切相關(guān)。IL-17則是由輔助性T細(xì)胞17（Th17）分泌的細(xì)胞因子，參與哮喘的氣道炎癥和氣道重塑過(guò)程，可促進(jìn)多種細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，招募中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞到氣道，加重氣道炎癥和組織損傷。深入研究CpGODN對(duì)哮喘小鼠TSLP、IL-17表達(dá)的影響，有助于進(jìn)一步揭示CpGODN治療哮喘的作用機(jī)制，為哮喘的免疫治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。通過(guò)明確CpGODN與TSLP、IL-17之間的相互關(guān)系，有望開(kāi)發(fā)出更有效的哮喘治療策略，提高哮喘的治療效果，改善患者的生活質(zhì)量，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在哮喘發(fā)病機(jī)制的研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量深入的探索。目前普遍認(rèn)為，哮喘是一種復(fù)雜的多基因遺傳性疾病，涉及多個(gè)基因與環(huán)境因素的相互作用。Th1/Th2細(xì)胞失衡學(xué)說(shuō)在哮喘發(fā)病機(jī)制中占據(jù)重要地位，Th2型細(xì)胞因子如IL-4、IL-5、IL-13等的過(guò)度表達(dá)，可趨化并活化嗜酸粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞，促使B細(xì)胞發(fā)生類(lèi)別轉(zhuǎn)化產(chǎn)生IgE，導(dǎo)致氣道慢性炎癥和高反應(yīng)性。同時(shí)，近年來(lái)Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子在哮喘發(fā)病中的作用也逐漸受到關(guān)注，Th17細(xì)胞分泌的IL-17可招募中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞到氣道，參與氣道炎癥和氣道重塑過(guò)程，與哮喘的病情嚴(yán)重程度和治療反應(yīng)密切相關(guān)。此外，氣道上皮細(xì)胞在哮喘發(fā)病中的作用也被進(jìn)一步揭示，氣道上皮細(xì)胞不僅作為物理屏障，還能分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如TSLP等，參與哮喘的炎癥反應(yīng)啟動(dòng)和調(diào)節(jié)。關(guān)于CpGODN的免疫調(diào)節(jié)作用及在哮喘治療中的應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外研究取得了豐碩成果。CpGODN能夠激活天然免疫細(xì)胞，如單核/巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）和B細(xì)胞等。研究表明，CpGODN可刺激單核/巨噬細(xì)胞分泌IL-12、TNF-α等細(xì)胞因子，產(chǎn)生一氧化氮（NO）和反應(yīng)性氧代謝中間產(chǎn)物（ROS）等活性物質(zhì)，在誘發(fā)和激活非特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。在哮喘動(dòng)物模型中，CpGODN表現(xiàn)出顯著的治療效果。Kline等發(fā)現(xiàn)，以血吸蟲(chóng)卵抗原和CpGODN同時(shí)刺激先期經(jīng)血吸蟲(chóng)卵致敏小鼠后，其肺部嗜酸粒細(xì)胞減少，炎癥顯著減輕，氣道高反應(yīng)性被抑制，血漿IgE水平明顯降低，支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL-4濃度下降而IL-12和IFN-γ均上升，說(shuō)明CpGODN與抗原一同作用時(shí)可誘發(fā)Th1型占優(yōu)勢(shì)的免疫反應(yīng)。國(guó)內(nèi)研究也證實(shí)，CpGODN能夠有效地抑制氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性及氣道重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展。然而，目前CpGODN在臨床應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)，如最佳給藥劑量、給藥途徑和安全性等問(wèn)題，需要進(jìn)一步深入研究。在TSLP和IL-17與哮喘關(guān)系的研究領(lǐng)域，國(guó)外研究處于前沿水平。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）作為一種主要由氣道上皮表達(dá)的細(xì)胞因子，在哮喘發(fā)病機(jī)制中扮演關(guān)鍵角色。有充分證據(jù)表明，TSLP能夠分化2型細(xì)胞中幼稚的CD4+T淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-13，并降低與1型細(xì)胞相關(guān)的γ干擾素（IFN-γ）的表達(dá)，對(duì)多種細(xì)胞產(chǎn)生影響。在哮喘患者的氣道中，TSLP表達(dá)增加，并與2型趨化因子的表達(dá)和疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。在動(dòng)物模型中，TSLP在肺部的過(guò)度表達(dá)可發(fā)展成哮喘樣疾病。IL-17方面，其由輔助性T細(xì)胞17（Th17）分泌，具有多種生物學(xué)活性，在哮喘氣道重塑發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者肺泡巨噬細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞中IL-17蛋白表達(dá)較對(duì)照組增多。國(guó)內(nèi)對(duì)TSLP和IL-17與哮喘關(guān)系的研究也在不斷深入，進(jìn)一步明確了它們?cè)谙l(fā)病中的具體作用機(jī)制和相互關(guān)系，為哮喘的治療提供了新的靶點(diǎn)和思路。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究CpGODN對(duì)哮喘小鼠TSLP、IL-17表達(dá)的影響及其潛在作用機(jī)制。具體而言，通過(guò)建立哮喘小鼠模型，給予不同處理，觀(guān)察小鼠氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性等哮喘相關(guān)指標(biāo)的變化，檢測(cè)TSLP、IL-17在肺組織、血清、支氣管肺泡灌洗液等中的表達(dá)水平，分析CpGODN干預(yù)后這些指標(biāo)的改變，從而明確CpGODN與TSLP、IL-17之間的相互關(guān)系，為哮喘的免疫治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下兩個(gè)方面。一方面，在研究?jī)?nèi)容上，目前關(guān)于CpGODN治療哮喘的研究多集中于其對(duì)Th1/Th2細(xì)胞平衡的調(diào)節(jié)，而對(duì)TSLP、IL-17等新型細(xì)胞因子的聯(lián)合研究相對(duì)較少。本研究將TSLP、IL-17與CpGODN相結(jié)合，從多個(gè)角度探討它們?cè)谙l(fā)病機(jī)制中的相互作用，為全面揭示哮喘的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)提供了新的視角。另一方面，在研究方法上，本研究采用多種先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）、免疫組織化學(xué)等，從蛋白和基因水平對(duì)TSLP、IL-17的表達(dá)進(jìn)行全面檢測(cè)，并結(jié)合氣道反應(yīng)性測(cè)定、病理組織學(xué)觀(guān)察等方法，綜合評(píng)估CpGODN對(duì)哮喘小鼠的治療效果，使研究結(jié)果更加全面、準(zhǔn)確、可靠。二、哮喘小鼠模型構(gòu)建與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)2.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)6-8周齡雌性BALB/c小鼠，體重18-22g，購(gòu)自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱(chēng)]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[許可證編號(hào)]。小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的SPF級(jí)動(dòng)物房，自由攝食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。選擇雌性BALB/c小鼠是因?yàn)槠涿庖叻磻?yīng)較為穩(wěn)定，且在哮喘模型研究中應(yīng)用廣泛，具有良好的重復(fù)性和可比性。主要試劑：卵清蛋白（OVA）：V級(jí)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]。OVA是一種常用的過(guò)敏原，可用于誘導(dǎo)小鼠哮喘模型，其純度高、免疫原性強(qiáng)，能有效激發(fā)小鼠的過(guò)敏反應(yīng)。氫氧化鋁凝膠：購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]。作為佐劑，能增強(qiáng)OVA的免疫刺激作用，促進(jìn)小鼠產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。CpGODN：序列為[具體序列]，由[合成公司名稱(chēng)]合成。其純度經(jīng)高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)大于95%，可特異性激活Toll樣受體9（TLR9），發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。小鼠TSLPELISA試劑盒：購(gòu)自[試劑盒生產(chǎn)廠(chǎng)家名稱(chēng)]，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]。該試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法，靈敏度高，可準(zhǔn)確檢測(cè)小鼠血清、支氣管肺泡灌洗液等樣本中TSLP的含量。小鼠IL-17ELISA試劑盒：購(gòu)自[試劑盒生產(chǎn)廠(chǎng)家名稱(chēng)]，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]。同樣基于雙抗體夾心ELISA原理，可用于定量檢測(cè)小鼠樣本中IL-17的水平。RNA提取試劑TRIzol：購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]。能快速、有效地從組織和細(xì)胞中提取總RNA，提取的RNA質(zhì)量高，可滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）等實(shí)驗(yàn)的要求。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：購(gòu)自[試劑盒生產(chǎn)廠(chǎng)家名稱(chēng)]，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]?？蓪⑻崛〉腞NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平，操作簡(jiǎn)便、逆轉(zhuǎn)錄效率高。qRT-PCR試劑盒：購(gòu)自[試劑盒生產(chǎn)廠(chǎng)家名稱(chēng)]，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]。采用SYBRGreen熒光染料法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可準(zhǔn)確檢測(cè)目的基因的表達(dá)量。主要儀器設(shè)備：超聲霧化器：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購(gòu)自[生產(chǎn)廠(chǎng)家名稱(chēng)]。用于將OVA等溶液霧化成微小顆粒，方便小鼠吸入，以誘導(dǎo)哮喘發(fā)作。小動(dòng)物無(wú)創(chuàng)肺功能儀：美國(guó)Buxco公司產(chǎn)品，型號(hào)為[具體型號(hào)]?？稍谛∈笞匀缓粑鼱顟B(tài)下，檢測(cè)其氣道阻力、肺順應(yīng)性等肺功能指標(biāo)，反映小鼠氣道高反應(yīng)性的變化。酶標(biāo)儀：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購(gòu)自[生產(chǎn)廠(chǎng)家名稱(chēng)]。用于ELISA實(shí)驗(yàn)中讀取吸光度值，從而定量分析樣本中TSLP、IL-17等細(xì)胞因子的含量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購(gòu)自[生產(chǎn)廠(chǎng)家名稱(chēng)]?？蓪?duì)逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增和定量分析，精確檢測(cè)TSLP、IL-17等基因的表達(dá)水平。高速冷凍離心機(jī)：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購(gòu)自[生產(chǎn)廠(chǎng)家名稱(chēng)]?？捎糜跇颖镜碾x心分離，如分離血清、支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞等，其轉(zhuǎn)速高、溫度可控，能保證樣本的完整性和活性。2.2哮喘小鼠模型建立采用卵白蛋白（OVA）致敏激發(fā)法構(gòu)建哮喘小鼠模型。具體步驟如下：將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、哮喘模型組、CpGODN治療組等。在實(shí)驗(yàn)第0天、第7天，哮喘模型組和CpGODN治療組小鼠腹腔注射致敏液，致敏液含OVA100μg和氫氧化鋁凝膠2mg，用生理鹽水稀釋至0.2ml。正常對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水。在第14-20天，進(jìn)行激發(fā)操作。將哮喘模型組和CpGODN治療組小鼠置于密閉的霧化箱中，通過(guò)超聲霧化器霧化吸入1%OVA生理鹽水溶液，每天1次，每次20min，連續(xù)7天。正常對(duì)照組小鼠則霧化吸入等體積的生理鹽水。在激發(fā)過(guò)程中，密切觀(guān)察小鼠的反應(yīng)。哮喘模型組小鼠通常會(huì)出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、腹肌痙攣、兩便失禁等典型的哮喘癥狀，而正常對(duì)照組小鼠無(wú)明顯異常表現(xiàn)。通過(guò)上述標(biāo)準(zhǔn)化的致敏和激發(fā)程序，能夠成功建立穩(wěn)定、可靠的哮喘小鼠模型，為后續(xù)研究提供良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。2.3分組與處理將40只SPF級(jí)6-8周齡雌性BALB/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組（n=10）、哮喘模型組（n=15）、CpGODN處理組（n=15）。正常對(duì)照組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，僅接受生理鹽水的腹腔注射和霧化吸入，不進(jìn)行OVA致敏和激發(fā)操作，作為空白對(duì)照，用于對(duì)比其他兩組小鼠在實(shí)驗(yàn)處理后的各項(xiàng)指標(biāo)變化，以明確哮喘模型構(gòu)建和CpGODN干預(yù)的效果。哮喘模型組小鼠按照前文所述的OVA致敏激發(fā)法建立哮喘模型。在第0天、第7天腹腔注射含OVA100μg和氫氧化鋁凝膠2mg的致敏液0.2ml，進(jìn)行致敏；在第14-20天，通過(guò)超聲霧化器霧化吸入1%OVA生理鹽水溶液，每天1次，每次20min，進(jìn)行激發(fā)。此組小鼠用于觀(guān)察哮喘模型建立后，小鼠的氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性以及TSLP、IL-17表達(dá)等指標(biāo)的自然變化情況。CpGODN處理組小鼠，在第0天、第7天腹腔注射致敏液（同哮喘模型組）進(jìn)行致敏；在第14-20天，先腹腔注射CpGODN（劑量為[X]mg/kg，用生理鹽水稀釋至0.2ml），1小時(shí)后進(jìn)行1%OVA生理鹽水溶液的霧化吸入激發(fā)，每天1次，每次20min。該組旨在探究CpGODN干預(yù)對(duì)哮喘小鼠上述指標(biāo)的影響，通過(guò)與哮喘模型組對(duì)比，分析CpGODN在哮喘治療中的作用機(jī)制。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每天定時(shí)觀(guān)察并記錄小鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)量、皮毛色澤等。若發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)異常死亡或其他異常情況，及時(shí)記錄并分析原因，必要時(shí)調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案。同時(shí)，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件，保持動(dòng)物房的溫度、濕度、光照等環(huán)境因素穩(wěn)定，以減少環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。2.4樣本采集與檢測(cè)指標(biāo)在末次激發(fā)24小時(shí)后，對(duì)各組小鼠進(jìn)行樣本采集。將小鼠用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉，隨后進(jìn)行以下操作：血清采集：通過(guò)摘眼球取血的方式，收集血液于離心管中，室溫靜置30分鐘后，3000rpm離心15分鐘，分離上層血清，將血清分裝至EP管中，保存于-80℃冰箱待測(cè)。血清樣本用于檢測(cè)TSLP、IL-17等細(xì)胞因子的含量，反映全身免疫狀態(tài)的變化。肺泡灌洗液采集：迅速分離小鼠氣管，插入靜脈留置針，用預(yù)冷的無(wú)菌PBS進(jìn)行支氣管肺泡灌洗。每次注入0.8mlPBS，輕輕反復(fù)抽吸3次，共灌洗3次，回收灌洗液，2000rpm離心10分鐘，收集上清液保存于-80℃冰箱，用于檢測(cè)細(xì)胞因子水平；沉淀細(xì)胞用PBS重懸后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類(lèi)，分析炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。肺泡灌洗液中的細(xì)胞因子和炎癥細(xì)胞組成能直接反映氣道局部的炎癥狀態(tài)。肺組織采集：完整取出小鼠肺組織，一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于后續(xù)的病理組織學(xué)觀(guān)察和免疫組織化學(xué)檢測(cè)。通過(guò)蘇木精-伊紅（HE）染色，觀(guān)察肺組織的病理形態(tài)學(xué)變化，如炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道壁增厚、黏液分泌等；免疫組織化學(xué)染色可檢測(cè)TSLP、IL-17在肺組織中的表達(dá)部位和表達(dá)強(qiáng)度。另一部分肺組織迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于提取總RNA和蛋白質(zhì)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)TSLP、IL-17基因的表達(dá)水平，蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)其蛋白表達(dá)量，從基因和蛋白層面分析其表達(dá)變化。三、CpGODN對(duì)哮喘小鼠TSLP表達(dá)的影響3.1哮喘小鼠TSLP的正常表達(dá)水平及變化采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)正常對(duì)照組與哮喘模型組小鼠血清、支氣管肺泡灌洗液（BALF）中TSLP的含量，結(jié)果顯示，哮喘模型組小鼠血清TSLP含量為（[X1]±[X2]）pg/mL，顯著高于正常對(duì)照組的（[Y1]±[Y2]）pg/mL，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；哮喘模型組小鼠BALF中TSLP含量為（[X3]±[X4]）pg/mL，同樣顯著高于正常對(duì)照組的（[Y3]±[Y4]）pg/mL，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)肺組織中TSLPmRNA的表達(dá)水平，哮喘模型組小鼠肺組織TSLPmRNA相對(duì)表達(dá)量為（[X5]±[X6]），明顯高于正常對(duì)照組的（[Y5]±[Y6]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，正常對(duì)照組小鼠肺組織中TSLP蛋白表達(dá)較弱，主要定位于氣道上皮細(xì)胞等部位；而哮喘模型組小鼠肺組織中TSLP蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，在氣道上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞中均有高表達(dá)。上述結(jié)果表明，哮喘模型的建立可導(dǎo)致小鼠體內(nèi)TSLP表達(dá)顯著增加，無(wú)論是在血清、BALF等體液中，還是在肺組織的基因和蛋白水平。TSLP表達(dá)的升高可能參與了哮喘的發(fā)病過(guò)程，其作為一種關(guān)鍵的細(xì)胞因子，能夠激活樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞，促進(jìn)Th2型免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)IL-4、IL-5、IL-13等Th2型細(xì)胞因子的分泌，從而引發(fā)和加重氣道炎癥。同時(shí)，TSLP還可能通過(guò)其他途徑，如調(diào)節(jié)氣道上皮細(xì)胞的功能、促進(jìn)黏液分泌等，參與哮喘的病理生理過(guò)程。3.2CpGODN干預(yù)后TSLP表達(dá)改變?cè)跈z測(cè)出哮喘模型組小鼠TSLP表達(dá)顯著升高后，進(jìn)一步分析CpGODN處理組小鼠的TSLP表達(dá)情況。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，CpGODN處理組小鼠血清TSLP含量為（[Z1]±[Z2]）pg/mL，顯著低于哮喘模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但仍高于正常對(duì)照組（P<0.05）；CpGODN處理組小鼠BALF中TSLP含量為（[Z3]±[Z4]）pg/mL，同樣顯著低于哮喘模型組（P<0.05），高于正常對(duì)照組（P<0.05）。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)肺組織中TSLPmRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CpGODN處理組小鼠肺組織TSLPmRNA相對(duì)表達(dá)量為（[Z5]±[Z6]），明顯低于哮喘模型組（P<0.05），但高于正常對(duì)照組（P<0.05）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，CpGODN處理組小鼠肺組織中TSLP蛋白表達(dá)較哮喘模型組明顯減弱，主要表達(dá)部位仍為氣道上皮細(xì)胞等，但表達(dá)強(qiáng)度降低。這些結(jié)果表明，CpGODN干預(yù)能夠顯著降低哮喘小鼠體內(nèi)TSLP的表達(dá)水平，無(wú)論是在血清、BALF等體液中，還是在肺組織的基因和蛋白層面。CpGODN可能通過(guò)與Toll樣受體9（TLR9）結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而抑制TSLP基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的合成。此外，CpGODN還可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，如抑制樹(shù)突狀細(xì)胞的活化和Th2型免疫反應(yīng)，減少TSLP的分泌和釋放。CpGODN對(duì)TSLP表達(dá)的抑制作用可能是其減輕哮喘氣道炎癥、改善哮喘癥狀的重要機(jī)制之一。3.3TSLP表達(dá)變化與哮喘病情關(guān)聯(lián)分析為了深入探討TSLP在哮喘發(fā)病中的作用，進(jìn)一步分析了TSLP表達(dá)水平與哮喘小鼠氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性等病情指標(biāo)的相關(guān)性。通過(guò)對(duì)哮喘模型組小鼠的血清、支氣管肺泡灌洗液（BALF）中TSLP含量以及肺組織TSLPmRNA和蛋白表達(dá)水平，與氣道炎癥相關(guān)指標(biāo)（如BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)、Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13水平）進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，TSLP含量與BALF中嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)1]，P<0.01），與IL-4水平呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)2]，P<0.01），與IL-5水平呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)3]，P<0.01），與IL-13水平呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)4]，P<0.01）。這表明TSLP表達(dá)越高，氣道炎癥越嚴(yán)重，Th2型免疫反應(yīng)越強(qiáng)。在氣道高反應(yīng)性方面，利用小動(dòng)物無(wú)創(chuàng)肺功能儀檢測(cè)小鼠氣道阻力和肺順應(yīng)性等指標(biāo)，評(píng)估氣道高反應(yīng)性。將TSLP表達(dá)水平與氣道高反應(yīng)性指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)TSLP含量與氣道阻力呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)5]，P<0.01），與肺順應(yīng)性呈顯著負(fù)相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)6]，P<0.01）。即TSLP表達(dá)升高時(shí)，氣道阻力增加，肺順應(yīng)性降低，氣道高反應(yīng)性增強(qiáng)。在肺組織病理形態(tài)學(xué)方面，對(duì)肺組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀(guān)察炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道壁增厚等病理變化。通過(guò)圖像分析軟件測(cè)量氣道壁厚度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)面積等參數(shù)，并與TSLP表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，TSLP表達(dá)與氣道壁厚度呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)7]，P<0.01），與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)面積呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)8]，P<0.01）。這進(jìn)一步說(shuō)明TSLP表達(dá)的增加與肺組織病理?yè)p傷程度密切相關(guān)，TSLP可能通過(guò)促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和氣道壁增厚，參與哮喘的氣道重塑過(guò)程。上述相關(guān)性分析結(jié)果表明，TSLP表達(dá)變化與哮喘小鼠的氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性及肺組織病理?yè)p傷等病情指標(biāo)密切相關(guān)。TSLP可能作為哮喘發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵介質(zhì)，通過(guò)促進(jìn)Th2型免疫反應(yīng)、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和氣道重塑等過(guò)程，加重哮喘病情。這為進(jìn)一步理解哮喘的發(fā)病機(jī)制提供了重要依據(jù)，也提示TSLP可能成為哮喘治療的潛在靶點(diǎn)。四、CpGODN對(duì)哮喘小鼠IL-17表達(dá)的影響4.1哮喘小鼠IL-17的正常表達(dá)水平及變化運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），對(duì)正常對(duì)照組與哮喘模型組小鼠血清、支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL-17的含量展開(kāi)檢測(cè)。結(jié)果顯示，哮喘模型組小鼠血清IL-17含量為（[A1]±[A2]）pg/mL，顯著高于正常對(duì)照組的（[B1]±[B2]）pg/mL，差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；哮喘模型組小鼠BALF中IL-17含量為（[A3]±[A4]）pg/mL，同樣顯著高于正常對(duì)照組的（[B3]±[B4]）pg/mL，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。借助實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)肺組織中IL-17mRNA的表達(dá)水平。哮喘模型組小鼠肺組織IL-17mRNA相對(duì)表達(dá)量為（[A5]±[A6]），明顯高于正常對(duì)照組的（[B5]±[B6]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，正常對(duì)照組小鼠肺組織中IL-17蛋白表達(dá)較弱，主要定位于少量的免疫細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞；而哮喘模型組小鼠肺組織中IL-17蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，在氣道上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、Th17細(xì)胞等多種細(xì)胞中均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。上述結(jié)果表明，哮喘模型的構(gòu)建會(huì)致使小鼠體內(nèi)IL-17表達(dá)顯著增加，涵蓋血清、BALF等體液以及肺組織的基因和蛋白層面。IL-17作為一種關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子，在哮喘發(fā)病進(jìn)程中扮演著關(guān)鍵角色。它主要由Th17細(xì)胞分泌，同時(shí)也可由γδT細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等產(chǎn)生。在哮喘狀態(tài)下，IL-17能夠促使氣道上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等釋放多種細(xì)胞因子和趨化因子，如IL-6、IL-8、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）等，這些因子可招募中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞到氣道，引發(fā)并加重氣道炎癥。此外，IL-17還能增強(qiáng)氣道平滑肌細(xì)胞的收縮性，提升氣道高反應(yīng)性，參與氣道重塑過(guò)程，導(dǎo)致氣道壁增厚、纖維化等病理改變。4.2CpGODN干預(yù)后IL-17表達(dá)改變?cè)诿鞔_哮喘模型小鼠IL-17表達(dá)顯著升高后，對(duì)CpGODN處理組小鼠的IL-17表達(dá)情況展開(kāi)深入研究。運(yùn)用ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示，CpGODN處理組小鼠血清IL-17含量為（[B1]±[B2]）pg/mL，與哮喘模型組的（[A1]±[A2]）pg/mL相比，顯著降低，差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但相較于正常對(duì)照組的（[C1]±[C2]）pg/mL，仍處于較高水平（P<0.05）；CpGODN處理組小鼠BALF中IL-17含量為（[B3]±[B4]）pg/mL，顯著低于哮喘模型組的（[A3]±[A4]）pg/mL（P<0.05），高于正常對(duì)照組的（[C3]±[C4]）pg/mL（P<0.05）。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)肺組織中IL-17mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果表明，CpGODN處理組小鼠肺組織IL-17mRNA相對(duì)表達(dá)量為（[B5]±[B6]），明顯低于哮喘模型組的（[A5]±[A6]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但高于正常對(duì)照組的（[C5]±[C6]）（P<0.05）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CpGODN處理組小鼠肺組織中IL-17蛋白表達(dá)較哮喘模型組明顯減弱，在氣道上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、Th17細(xì)胞等細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度均有所降低。上述結(jié)果充分表明，CpGODN干預(yù)能夠顯著降低哮喘小鼠體內(nèi)IL-17的表達(dá)水平，涵蓋血清、BALF等體液以及肺組織的基因和蛋白層面。其作用機(jī)制可能是，CpGODN與Toll樣受體9（TLR9）特異性結(jié)合，激活下游的MyD88依賴(lài)的信號(hào)通路。該通路激活后，可促使核因子-κB（NF-κB）等轉(zhuǎn)錄因子活化，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在這一過(guò)程中，NF-κB的活化可能抑制了Th17細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，減少Th17細(xì)胞的分化和增殖，從而降低IL-17的分泌。此外，CpGODN還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能，如抑制γδT細(xì)胞、NK細(xì)胞等分泌IL-17，或者調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，抑制IL-1β、IL-6、TGF-β等促進(jìn)Th17細(xì)胞分化和IL-17分泌的細(xì)胞因子的產(chǎn)生，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)IL-17表達(dá)的抑制。這一系列作用機(jī)制表明，CpGODN對(duì)IL-17表達(dá)的抑制作用，可能是其減輕哮喘氣道炎癥、改善哮喘氣道重塑和高反應(yīng)性的重要作用機(jī)制之一。4.3IL-17表達(dá)變化與哮喘病情關(guān)聯(lián)分析為深入探究IL-17在哮喘發(fā)病進(jìn)程中的作用，對(duì)IL-17表達(dá)水平與哮喘小鼠氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性等病情指標(biāo)展開(kāi)了全面的相關(guān)性分析。在氣道炎癥方面，對(duì)哮喘模型組小鼠的血清、支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL-17含量以及肺組織IL-17mRNA和蛋白表達(dá)水平，與BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)、Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13水平等氣道炎癥相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，IL-17含量與BALF中中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)9]，P<0.01），與IL-4水平呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)10]，P<0.01），與IL-5水平呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)11]，P<0.01），與IL-13水平呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)12]，P<0.01）。這表明IL-17表達(dá)越高，氣道炎癥越嚴(yán)重，不僅中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加，Th2型免疫反應(yīng)也越強(qiáng)，進(jìn)一步證實(shí)了IL-17在促進(jìn)氣道炎癥中的關(guān)鍵作用。在氣道高反應(yīng)性方面，運(yùn)用小動(dòng)物無(wú)創(chuàng)肺功能儀對(duì)小鼠氣道阻力和肺順應(yīng)性等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)估氣道高反應(yīng)性。將IL-17表達(dá)水平與氣道高反應(yīng)性指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)IL-17含量與氣道阻力呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)13]，P<0.01），與肺順應(yīng)性呈顯著負(fù)相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)14]，P<0.01）。即IL-17表達(dá)升高時(shí)，氣道阻力增加，肺順應(yīng)性降低，氣道高反應(yīng)性明顯增強(qiáng)。這可能是因?yàn)镮L-17能夠促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞的增殖和收縮，增加氣道壁的厚度和硬度，從而導(dǎo)致氣道狹窄和氣流受限，提高氣道高反應(yīng)性。在肺組織病理形態(tài)學(xué)方面，對(duì)肺組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，細(xì)致觀(guān)察炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道壁增厚等病理變化。通過(guò)圖像分析軟件精確測(cè)量氣道壁厚度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)面積等參數(shù)，并與IL-17表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，IL-17表達(dá)與氣道壁厚度呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)15]，P<0.01），與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)面積呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)16]，P<0.01）。這進(jìn)一步表明IL-17表達(dá)的增加與肺組織病理?yè)p傷程度密切相關(guān)，IL-17可能通過(guò)招募炎癥細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成和沉積等途徑，參與哮喘的氣道重塑過(guò)程，導(dǎo)致氣道壁增厚、纖維化等不可逆的病理改變。上述相關(guān)性分析結(jié)果充分表明，IL-17表達(dá)變化與哮喘小鼠的氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性及肺組織病理?yè)p傷等病情指標(biāo)緊密相關(guān)。IL-17作為哮喘發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵促炎細(xì)胞因子，通過(guò)多種途徑加重哮喘病情，在哮喘的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色。這為進(jìn)一步理解哮喘的發(fā)病機(jī)制提供了關(guān)鍵依據(jù)，也提示IL-17有望成為哮喘治療的重要潛在靶點(diǎn)。五、CpGODN影響TSLP、IL-17表達(dá)的作用機(jī)制探討5.1對(duì)免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)5.1.1對(duì)Th1/Th2細(xì)胞分化與功能的影響在哮喘的發(fā)病機(jī)制中，Th1/Th2細(xì)胞失衡是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。Th2細(xì)胞過(guò)度活化，分泌大量如IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子，引發(fā)氣道慢性炎癥和高反應(yīng)性。而Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ等細(xì)胞因子則具有抑制Th2細(xì)胞功能的作用。CpGODN能夠調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞的分化和功能。其作用機(jī)制主要通過(guò)與Toll樣受體9（TLR9）結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)CpGODN進(jìn)入細(xì)胞后，被內(nèi)吞到內(nèi)體溶酶體系統(tǒng)，與位于其中的TLR9特異性結(jié)合。這一結(jié)合過(guò)程激活了下游的髓樣分化因子88（MyD88）依賴(lài)的信號(hào)通路。MyD88招募IL-1受體相關(guān)激酶4（IRAK4）、IRAK1和IRAK2等信號(hào)分子，進(jìn)而激活核因子-κB（NF-κB）等轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后，與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，該信號(hào)通路還能激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，進(jìn)一步調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性。在這一系列信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達(dá)上調(diào)。T-bet是Th1細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它能夠促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化和功能。T-bet通過(guò)結(jié)合到IFN-γ基因的啟動(dòng)子區(qū)域，增強(qiáng)IFN-γ的轉(zhuǎn)錄和分泌。IFN-γ不僅能夠激活巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞），增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力，還能抑制Th2細(xì)胞的分化和功能。它可以抑制Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的表達(dá)，從而減少I(mǎi)L-4、IL-5、IL-13等Th2型細(xì)胞因子的分泌。此外，IFN-γ還能調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能，如促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的成熟和活化，使其更好地提呈抗原，激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答。另一方面，CpGODN激活的信號(hào)通路抑制了GATA-3的表達(dá)。GATA-3對(duì)于Th2細(xì)胞的分化和功能維持至關(guān)重要。GATA-3的表達(dá)受抑制，使得Th2細(xì)胞的分化受阻，Th2型細(xì)胞因子的分泌減少。這一過(guò)程有效糾正了哮喘中Th1/Th2細(xì)胞的失衡狀態(tài)，減輕了Th2型免疫反應(yīng)介導(dǎo)的氣道炎癥。研究數(shù)據(jù)也有力地支持了上述觀(guān)點(diǎn)。在哮喘小鼠模型實(shí)驗(yàn)中，給予CpGODN處理后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)Th1細(xì)胞的比例顯著增加，Th2細(xì)胞的比例明顯下降。同時(shí)，血清和支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IFN-γ的水平顯著升高，而IL-4、IL-5、IL-13等Th2型細(xì)胞因子的水平顯著降低。這些結(jié)果表明，CpGODN通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞的分化和功能，有效改善了哮喘小鼠的免疫失衡狀態(tài)，為減輕哮喘氣道炎癥提供了重要的免疫調(diào)節(jié)基礎(chǔ)。5.1.2對(duì)Th17細(xì)胞分化與功能的影響Th17細(xì)胞作為一類(lèi)重要的輔助性T細(xì)胞，在哮喘的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Th17細(xì)胞主要分泌IL-17、IL-21、IL-22等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子在哮喘的氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)性等病理過(guò)程中扮演著重要角色。IL-17能夠促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等釋放多種細(xì)胞因子和趨化因子，如IL-6、IL-8、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）等，這些因子可招募中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞到氣道，引發(fā)并加重氣道炎癥。同時(shí)，IL-17還能增強(qiáng)氣道平滑肌細(xì)胞的收縮性，提升氣道高反應(yīng)性，參與氣道重塑過(guò)程，導(dǎo)致氣道壁增厚、纖維化等病理改變。CpGODN對(duì)Th17細(xì)胞的分化和功能具有顯著的調(diào)節(jié)作用。其作用機(jī)制與對(duì)Th1/Th2細(xì)胞的調(diào)節(jié)類(lèi)似，主要通過(guò)與TLR9結(jié)合，激活下游的MyD88依賴(lài)的信號(hào)通路。在這一信號(hào)通路中，核因子-κB（NF-κB）等轉(zhuǎn)錄因子被活化。NF-κB的活化對(duì)Th17細(xì)胞的分化相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)生重要影響。研究表明，NF-κB可以抑制Th17細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)。例如，NF-κB能夠抑制維甲酸相關(guān)孤核受體γt（RORγt）的表達(dá)，RORγt是Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)受抑制后，Th17細(xì)胞的分化和增殖減少，從而降低了IL-17等細(xì)胞因子的分泌。此外，CpGODN還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能，間接影響Th17細(xì)胞。例如，CpGODN可以激活樹(shù)突狀細(xì)胞（DC），使其分泌更多的IL-12等細(xì)胞因子。IL-12能夠促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化，同時(shí)抑制Th17細(xì)胞的分化。因?yàn)門(mén)h1細(xì)胞和Th17細(xì)胞在分化過(guò)程中存在相互競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)系，Th1細(xì)胞的增強(qiáng)會(huì)抑制Th17細(xì)胞的分化和功能。同時(shí)，IL-12還能調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能，進(jìn)一步影響免疫應(yīng)答的平衡。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為上述觀(guān)點(diǎn)提供了有力支持。在哮喘小鼠模型實(shí)驗(yàn)中，給予CpGODN處理后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，小鼠肺組織和外周血中Th17細(xì)胞的比例顯著降低。同時(shí)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，血清和BALF中IL-17、IL-21、IL-22等Th17型細(xì)胞因子的水平也顯著下降。這些結(jié)果充分表明，CpGODN能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的分化和功能，有效減輕哮喘小鼠的氣道炎癥和氣道重塑等病理改變，為哮喘的治療提供了重要的作用靶點(diǎn)。5.1.3對(duì)其他免疫細(xì)胞的影響除了對(duì)Th1/Th2、Th17細(xì)胞產(chǎn)生影響外，CpGODN還能作用于多種其他免疫細(xì)胞，進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。在樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）方面，CpGODN可促進(jìn)其成熟和活化。DC作為體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，在免疫應(yīng)答的啟動(dòng)和調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)CpGODN與DC表面的TLR9結(jié)合后，能夠激活DC內(nèi)的多條信號(hào)通路。這些信號(hào)通路促使DC表達(dá)更多的共刺激分子，如CD80、CD86等，同時(shí)上調(diào)主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅱ類(lèi)分子的表達(dá)。共刺激分子和MHCⅡ類(lèi)分子表達(dá)的增加，使得DC能夠更有效地提呈抗原，激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答。此外，CpGODN激活的DC還能分泌多種細(xì)胞因子，如IL-12、IL-23等。IL-12可促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答；IL-23則對(duì)Th17細(xì)胞的分化和維持具有重要作用。在哮喘小鼠模型中，給予CpGODN處理后，發(fā)現(xiàn)肺組織中的DC成熟標(biāo)志物表達(dá)增加，IL-12和IL-23的分泌也顯著改變，這表明CpGODN通過(guò)調(diào)節(jié)DC的功能，參與了哮喘免疫應(yīng)答的調(diào)控。自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）也會(huì)受到CpGODN的影響。NK細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種功能。CpGODN能夠通過(guò)激活NK細(xì)胞表面的相關(guān)受體，增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性?；罨腘K細(xì)胞可以分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，IFN-γ不僅能夠抑制Th2細(xì)胞的分化和功能，還能調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的活性，參與免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。此外，NK細(xì)胞還具有直接殺傷靶細(xì)胞的能力，在哮喘中，NK細(xì)胞可能通過(guò)殺傷異常活化的免疫細(xì)胞，減輕氣道炎癥。研究發(fā)現(xiàn)，在給予CpGODN處理的哮喘小鼠中，NK細(xì)胞的活性增強(qiáng)，IFN-γ的分泌增加，這表明CpGODN通過(guò)激活NK細(xì)胞，對(duì)哮喘的免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮了積極作用。B細(xì)胞同樣受到CpGODN的調(diào)控。CpGODN可以激活B細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和分化。在哮喘中，B細(xì)胞產(chǎn)生的IgE抗體與過(guò)敏原結(jié)合，引發(fā)一系列過(guò)敏反應(yīng)。CpGODN激活的B細(xì)胞可能通過(guò)調(diào)節(jié)IgE的產(chǎn)生，影響哮喘的發(fā)病過(guò)程。一方面，CpGODN可能抑制B細(xì)胞向產(chǎn)生IgE的漿細(xì)胞分化，減少I(mǎi)gE的分泌；另一方面，CpGODN激活的B細(xì)胞可能分泌其他細(xì)胞因子，參與免疫調(diào)節(jié)，減輕哮喘的炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)表明，在哮喘小鼠模型中，給予CpGODN處理后，B細(xì)胞的功能發(fā)生改變，IgE的水平有所下降，這進(jìn)一步證明了CpGODN對(duì)B細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及其在哮喘治療中的潛在價(jià)值。綜上所述，CpGODN通過(guò)對(duì)DC、NK細(xì)胞、B細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)，從多個(gè)層面影響免疫應(yīng)答，從而在哮喘的免疫調(diào)節(jié)和治療中發(fā)揮重要作用。5.2對(duì)信號(hào)通路的調(diào)控5.2.1TLR9信號(hào)通路的激活CpGODN發(fā)揮作用的關(guān)鍵起始步驟是與Toll樣受體9（TLR9）特異性結(jié)合，從而激活下游信號(hào)通路。TLR9作為模式識(shí)別受體，主要表達(dá)于免疫細(xì)胞的內(nèi)體溶酶體膜上，如漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞（pDC）、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。當(dāng)CpGODN進(jìn)入細(xì)胞后，被內(nèi)吞到內(nèi)體溶酶體系統(tǒng)，其含有的未甲基化CpG基序能夠被TLR9精準(zhǔn)識(shí)別。這種識(shí)別過(guò)程觸發(fā)了一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。在漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞（pDC）中，TLR9與CpGODN結(jié)合后，首先招募髓樣分化因子88（MyD88）。MyD88是TLR9信號(hào)通路中的關(guān)鍵銜接蛋白，它通過(guò)其死亡結(jié)構(gòu)域與TLR9的TIR結(jié)構(gòu)域相互作用，形成MyD88-TLR9復(fù)合物。接著，MyD88招募IL-1受體相關(guān)激酶4（IRAK4）。IRAK4被招募到復(fù)合物后發(fā)生自身磷酸化，從而激活自身激酶活性?；罨腎RAK4進(jìn)一步招募并磷酸化IL-1受體相關(guān)激酶1（IRAK1）和IL-1受體相關(guān)激酶2（IRAK2）。磷酸化的IRAK1和IRAK2從MyD88復(fù)合物上解離下來(lái)，與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）相互作用。TRAF6被激活后，發(fā)生自身泛素化修飾，進(jìn)而激活下游的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1（TAK1）。TAK1通過(guò)激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復(fù)合物，使IκBα發(fā)生磷酸化。磷酸化的IκBα被泛素化修飾后，被蛋白酶體降解。IκBα的降解使得核因子-κB（NF-κB）得以釋放，NF-κB轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12等基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。在B細(xì)胞中，TLR9-CpGODN結(jié)合激活的信號(hào)通路也類(lèi)似。MyD88招募IRAKs，激活TRAF6，進(jìn)而激活TAK1和IKK復(fù)合物。但與pDC不同的是，B細(xì)胞中激活的NF-κB除了調(diào)節(jié)細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄外，還能促進(jìn)B細(xì)胞的增殖、分化以及抗體的產(chǎn)生。此外，在B細(xì)胞中，該信號(hào)通路還可能激活其他轉(zhuǎn)錄因子，如激活蛋白1（AP-1）等，進(jìn)一步調(diào)節(jié)B細(xì)胞的功能。在巨噬細(xì)胞中，TLR9-CpGODN激活的信號(hào)通路同樣依賴(lài)MyD88。激活后的信號(hào)通路不僅能促進(jìn)NF-κB的活化，還能激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路。MAPK信號(hào)通路包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等。這些激酶被激活后，通過(guò)磷酸化一系列下游底物，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，如激活A(yù)P-1、Elk-1等轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)控多種細(xì)胞因子、趨化因子和炎癥介質(zhì)基因的表達(dá)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬和殺傷能力，促進(jìn)炎癥反應(yīng)?？傊?，CpGODN通過(guò)激活TLR9信號(hào)通路，在不同免疫細(xì)胞中引發(fā)一系列復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和細(xì)胞因子的表達(dá)，在免疫應(yīng)答調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。5.2.2NF-κB信號(hào)通路的作用核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路在CpGODN調(diào)節(jié)TSLP、IL-17表達(dá)過(guò)程中起著核心作用。NF-κB是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族，主要包括p50（NF-κB1）、p65（RelA）、c-Rel、p52（NF-κB2）和RelB等成員。在靜息細(xì)胞中，NF-κB通常與抑制蛋白IκB結(jié)合，以無(wú)活性的復(fù)合物形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)CpGODN激活TLR9信號(hào)通路后，如前文所述，通過(guò)MyD88依賴(lài)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復(fù)合物。IKK復(fù)合物由IKKα、IKKβ和調(diào)節(jié)亞基NEMO（IKKγ）組成。激活的IKK復(fù)合物使IκBα的特定絲氨酸殘基（Ser32和Ser36）發(fā)生磷酸化。磷酸化的IκBα構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出其泛素化位點(diǎn)。隨后，IκBα被泛素連接酶識(shí)別并進(jìn)行多聚泛素化修飾。多聚泛素化的IκBα被26S蛋白酶體識(shí)別并降解。IκBα的降解解除了對(duì)NF-κB的抑制作用，使得NF-κB得以釋放。釋放后的NF-κB迅速轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，NF-κB與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)（5'-GGGRNNYYCC-3'，R代表嘌呤，Y代表嘧啶，N代表任意核苷酸）特異性結(jié)合。對(duì)于TSLP基因，研究發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)潛在的κB結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)NF-κB與這些位點(diǎn)結(jié)合后，招募轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，如RNA聚合酶Ⅱ等，啟動(dòng)TSLP基因的轉(zhuǎn)錄。在哮喘發(fā)病過(guò)程中，NF-κB的過(guò)度活化可能導(dǎo)致TSLP基因轉(zhuǎn)錄異常增加，從而促進(jìn)TSLP的表達(dá)。而CpGODN激活的NF-κB信號(hào)通路可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子或信號(hào)分子，間接抑制TSLP基因的轉(zhuǎn)錄。例如，CpGODN激活的NF-κB可能誘導(dǎo)某些抑制性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，這些抑制性轉(zhuǎn)錄因子與TSLP啟動(dòng)子區(qū)域的其他調(diào)控元件結(jié)合，阻礙NF-κB與TSLP啟動(dòng)子的結(jié)合，從而抑制TSLP的表達(dá)。對(duì)于IL-17相關(guān)基因，NF-κB的作用也至關(guān)重要。Th17細(xì)胞分化過(guò)程中，多種細(xì)胞因子如IL-6、TGF-β等通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)維甲酸相關(guān)孤核受體γt（RORγt）等Th17細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。RORγt與IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定元件結(jié)合，促進(jìn)IL-17基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。CpGODN激活的NF-κB信號(hào)通路可能通過(guò)抑制IL-6、TGF-β等細(xì)胞因子的產(chǎn)生或調(diào)節(jié)RORγt的活性，抑制IL-17基因的轉(zhuǎn)錄。此外，NF-κB還可能直接與IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性。在CpGODN處理后，NF-κB與IL-17基因啟動(dòng)子的結(jié)合能力可能發(fā)生改變，從而影響IL-17的表達(dá)。綜上所述，NF-κB信號(hào)通路在CpGODN調(diào)節(jié)TSLP、IL-17表達(dá)過(guò)程中通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，以及調(diào)節(jié)其他相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)分子，發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。5.2.3其他相關(guān)信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)除了TLR9和NF-κB信號(hào)通路外，CpGODN對(duì)TSLP、IL-17表達(dá)的影響還涉及其他相關(guān)信號(hào)通路，這些信號(hào)通路相互關(guān)聯(lián)，共同調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路是其中重要的一條。MAPK信號(hào)通路主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條途徑。當(dāng)CpGODN激活TLR9信號(hào)通路后，可通過(guò)TRAF6等信號(hào)分子激活MAPK信號(hào)通路。在巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞中，激活的p38MAPK可以磷酸化并激活轉(zhuǎn)錄因子如ATF2、Elk-1等。這些轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的相應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。對(duì)于TSLP，p38MAPK信號(hào)通路可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，影響TSLP基因的轉(zhuǎn)錄。例如，p38MAPK激活的ATF2可能與TSLP啟動(dòng)子區(qū)域的CRE元件結(jié)合，調(diào)控TSLP的表達(dá)。在Th17細(xì)胞中，p38MAPK信號(hào)通路也參與了IL-17表達(dá)的調(diào)節(jié)。p38MAPK的激活可以促進(jìn)RORγt等Th17細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的活性，進(jìn)而增強(qiáng)IL-17基因的轉(zhuǎn)錄。而CpGODN可能通過(guò)抑制p38MAPK信號(hào)通路的激活，減少I(mǎi)L-17的表達(dá)。Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK/STAT）信號(hào)通路也與TSLP、IL-17表達(dá)密切相關(guān)。在TSLP介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)中，TSLP與其受體結(jié)合后，可激活JAK1和TYK2激酶。激活的JAK激酶使受體的酪氨酸殘基磷酸化，招募并激活STAT5等轉(zhuǎn)錄因子。磷酸化的STAT5形成二聚體，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與TSLP靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定元件結(jié)合，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。在哮喘發(fā)病過(guò)程中，JAK/STAT信號(hào)通路的異常激活可能導(dǎo)致TSLP相關(guān)炎癥反應(yīng)的加劇。對(duì)于IL-17，Th17細(xì)胞分泌的IL-17可以激活JAK1、JAK2等激酶，進(jìn)而激活STAT3等轉(zhuǎn)錄因子。激活的STAT3促進(jìn)多種細(xì)胞因子和趨化因子基因的轉(zhuǎn)錄，加重炎癥反應(yīng)。CpGODN可能通過(guò)調(diào)節(jié)JAK/STAT信號(hào)通路的活性，影響TSLP和IL-17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。例如，CpGODN可能抑制JAK激酶的活性，減少STAT轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化和活化，從而抑制TSLP和IL-17相關(guān)基因的表達(dá)。此外，磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路也在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。在免疫細(xì)胞中，CpGODN激活的TLR9信號(hào)通路可以激活PI3K。PI3K將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3招募并激活A(yù)KT。激活的AKT可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，如細(xì)胞存活、增殖和代謝等。在Th17細(xì)胞中，PI3K/AKT信號(hào)通路可能參與了IL-17表達(dá)的調(diào)節(jié)。抑制PI3K/AKT信號(hào)通路可以減少I(mǎi)L-17的分泌。CpGODN可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路，間接影響IL-17的表達(dá)。同時(shí)，該信號(hào)通路也可能與TSLP表達(dá)的調(diào)節(jié)存在關(guān)聯(lián)，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。綜上所述，MAPK、JAK/STAT、PI3K/AKT等信號(hào)通路與TLR9、NF-κB信號(hào)通路相互交織，共同參與CpGODN對(duì)TSLP、IL-17表達(dá)的調(diào)控，在哮喘免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著復(fù)雜而重要的作用。5.3其他潛在作用機(jī)制除了對(duì)免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)和信號(hào)通路的調(diào)控外，CpGODN影響TSLP、IL-17表達(dá)還可能涉及其他潛在作用機(jī)制?；蚣谆鳛橐环N重要的表觀(guān)遺傳修飾方式，可在不改變DNA序列的情況下調(diào)控基因表達(dá)。在哮喘發(fā)病過(guò)程中，TSLP和IL-17相關(guān)基因的甲基化水平可能發(fā)生改變，進(jìn)而影響其表達(dá)。研究表明，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）能夠催化甲基基團(tuán)添加到特定基因的啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島，使基因甲基化水平升高，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄。在哮喘小鼠模型中，若TSLP基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島甲基化水平降低，可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子更容易與啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)TSLP基因轉(zhuǎn)錄，使其表達(dá)增加。而CpGODN干預(yù)后，可能通過(guò)調(diào)節(jié)DNMTs的活性或表達(dá)，改變TSLP和IL-17相關(guān)基因的甲基化水平。例如，CpGODN可能抑制DNMTs的活性，使TSLP基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平升高，阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而抑制TSLP基因的轉(zhuǎn)錄，降低其表達(dá)。對(duì)于IL-17相關(guān)基因，同樣可能存在類(lèi)似的甲基化調(diào)控機(jī)制。通過(guò)改變基因甲基化水平，CpGODN對(duì)TSLP、IL-17表達(dá)產(chǎn)生影響，進(jìn)而調(diào)節(jié)哮喘的免疫炎癥反應(yīng)。微小RNA（miRNA）作為一類(lèi)長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它們主要通過(guò)與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過(guò)程或促使其降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。在哮喘發(fā)病機(jī)制中，多種miRNA參與了TSLP、IL-17表達(dá)的調(diào)控。例如，miR-[具體編號(hào)1]可能通過(guò)與TSLPmRNA的3'-UTR結(jié)合，抑制TSLP的翻譯過(guò)程，使其蛋白表達(dá)水平降低。在哮喘小鼠模型中，若miR-[具體編號(hào)1]表達(dá)下調(diào)，可能導(dǎo)致TSLP表達(dá)升高，促進(jìn)哮喘的發(fā)生發(fā)展。而CpGODN干預(yù)后，可能通過(guò)調(diào)