不結(jié)球白菜冷相關(guān)CBF基因的鑒定與調(diào)控路徑解析VIP

不結(jié)球白菜冷相關(guān)CBF基因的鑒定與調(diào)控路徑解析一、引言1.1研究背景不結(jié)球白菜（Brassicarapassp.chinensis），作為十字花科蕓薹屬的重要成員，在我國蔬菜生產(chǎn)和消費(fèi)結(jié)構(gòu)中占據(jù)著舉足輕重的地位。它起源于中國，擁有悠久的栽培歷史，憑借其生長周期短、適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量可觀以及口感鮮美等諸多優(yōu)點(diǎn)，成為我國長江中下游地區(qū)乃至更廣泛區(qū)域廣泛種植的大眾蔬菜，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。此外，不結(jié)球白菜富含礦物質(zhì)、膳食纖維和各類維生素，對調(diào)節(jié)人體酸堿平衡、促進(jìn)新陳代謝以及預(yù)防疾病等方面發(fā)揮著重要作用，在保障人們?nèi)粘ｏ嬍辰】捣矫姘缪葜豢苫蛉钡慕巧?。然而，不結(jié)球白菜喜冷涼氣候，對低溫脅迫較為敏感。在實(shí)際的生長過程中，尤其是在早春和晚秋季節(jié)，不結(jié)球白菜常常會遭遇低溫天氣的侵襲。低溫環(huán)境會對不結(jié)球白菜產(chǎn)生諸多負(fù)面影響，一方面，會導(dǎo)致其體內(nèi)酶活性降低，從而限制了植物正常的生長發(fā)育進(jìn)程，使得植株生長緩慢，葉片發(fā)黃、萎蔫，嚴(yán)重時甚至?xí)霈F(xiàn)凍害癥狀，直接影響到不結(jié)球白菜的產(chǎn)量；另一方面，低溫還可能導(dǎo)致不結(jié)球白菜提前抽薹，這不僅會改變植株的生長形態(tài)，還會極大地降低其食用品質(zhì)，使得口感變差，營養(yǎng)成分流失，進(jìn)而影響其在市場上的經(jīng)濟(jì)價值。為了應(yīng)對低溫脅迫對不結(jié)球白菜的不利影響，深入研究其抗寒分子機(jī)制顯得尤為重要。在植物的抗寒調(diào)控機(jī)制中，轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其中，CBF（C-repeatbindingfactor）轉(zhuǎn)錄因子家族基因主導(dǎo)的CBF冷響應(yīng)通路是植物應(yīng)對低溫脅迫的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制之一。在擬南芥中，CBF基因家族成員在低溫響應(yīng)過程中發(fā)揮著核心作用，它們能夠迅速被低溫誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控一系列下游冷響應(yīng)基因（COR，cold-responsivegenes）的表達(dá)，這些COR基因編碼的產(chǎn)物參與植物體內(nèi)多種生理生化過程，如調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成以及抗氧化防御系統(tǒng)的激活等，從而增強(qiáng)植物的耐寒能力。不結(jié)球白菜作為一種重要的蔬菜作物，與擬南芥同屬十字花科，也通過一系列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制來誘發(fā)冷馴化，以提高自身的耐寒性，其中CBF冷響應(yīng)通路同樣是其重要的抗寒調(diào)控機(jī)制之一。系統(tǒng)地研究不結(jié)球白菜的CBF冷響應(yīng)通路，不僅有助于我們更好地理解其抗寒的分子機(jī)制，還能夠?yàn)橥ㄟ^基因工程手段培育抗寒新品種提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，對于提高不結(jié)球白菜在低溫環(huán)境下的產(chǎn)量和品質(zhì)，保障蔬菜的穩(wěn)定供應(yīng)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，國內(nèi)外對不結(jié)球白菜冷相關(guān)CBF基因的研究取得了一定進(jìn)展。在國外，對模式植物擬南芥的CBF基因家族已有深入研究，這為不結(jié)球白菜的相關(guān)研究提供了重要的理論基礎(chǔ)和研究思路。例如，通過對擬南芥的研究，明確了CBF基因家族成員在低溫響應(yīng)中的核心作用，以及它們調(diào)控下游冷響應(yīng)基因表達(dá)的機(jī)制。在國內(nèi)，針對不結(jié)球白菜冷相關(guān)CBF基因的研究也逐漸展開。研究人員利用現(xiàn)代生物技術(shù)，從不結(jié)球白菜中分離和克隆了多個CBF同源基因，如在蘇州青品種中成功分離得到8個CBF同源基因。通過實(shí)時定量PCR（qPCR）分析，揭示了這些基因的脅迫表達(dá)模式及調(diào)控特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)BcCBF1-3受冷脅迫誘導(dǎo)，參與ABA-獨(dú)立路徑；BcCBF4-6的表達(dá)受干旱和ABA調(diào)控，參與ABA-依賴路徑，這表明不結(jié)球白菜中CBF通路的ABA依賴路徑和ABA獨(dú)立路徑并非完全分離。此外，在不結(jié)球白菜CBF基因的功能驗(yàn)證和調(diào)控機(jī)制研究方面也取得了一些成果。通過構(gòu)建過量表達(dá)載體和基因沉默載體，對BcCBF基因的功能進(jìn)行了驗(yàn)證，并研究了其上下游基因的調(diào)控關(guān)系。例如，對BcCBF3的啟動子序列分析，鑒定出WRKY結(jié)合順式元件W-box，發(fā)現(xiàn)BcWRKY33的組成型表達(dá)可激活BcCBF3的轉(zhuǎn)錄。然而，當(dāng)前研究仍存在一些不足。一方面，雖然已鑒定出多個不結(jié)球白菜冷相關(guān)CBF基因，但對這些基因的功能多樣性及協(xié)同作用機(jī)制了解還不夠深入，基因間的互作網(wǎng)絡(luò)尚不清楚。另一方面，在CBF基因的上游調(diào)控因子和下游靶基因的挖掘上，雖然有了一定的發(fā)現(xiàn)，但仍有大量潛在的調(diào)控因子和靶基因有待進(jìn)一步探索，這限制了對不結(jié)球白菜CBF冷響應(yīng)通路全面而深入的理解。此外，將CBF基因研究成果應(yīng)用于不結(jié)球白菜抗寒品種培育的實(shí)踐中，還面臨著技術(shù)轉(zhuǎn)化和應(yīng)用的挑戰(zhàn)，需要進(jìn)一步加強(qiáng)基礎(chǔ)研究與育種實(shí)踐的結(jié)合。1.3研究目的和意義本研究旨在系統(tǒng)地鑒定不結(jié)球白菜中的冷相關(guān)CBF基因，并深入解析其調(diào)控路徑。具體而言，將利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，全面挖掘不結(jié)球白菜中的CBF基因家族成員，明確其基因結(jié)構(gòu)、序列特征和進(jìn)化關(guān)系。通過多種實(shí)驗(yàn)手段，包括基因表達(dá)分析、基因功能驗(yàn)證以及蛋白-蛋白互作和蛋白-DNA互作研究，深入探究CBF基因在低溫脅迫下的表達(dá)模式、生物學(xué)功能，以及它們與上下游基因之間的調(diào)控關(guān)系，從而構(gòu)建起較為完整的不結(jié)球白菜CBF冷響應(yīng)通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究具有重要的理論意義和實(shí)踐價值。在理論方面，通過對不結(jié)球白菜冷相關(guān)CBF基因的鑒定及調(diào)控路徑的研究，有助于深入揭示不結(jié)球白菜抗寒的分子機(jī)制，填補(bǔ)該領(lǐng)域在基因功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)方面的部分空白，進(jìn)一步豐富植物抗寒分子生物學(xué)的理論體系，為后續(xù)研究植物應(yīng)對低溫脅迫的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制提供重要的參考依據(jù)。在實(shí)踐應(yīng)用中，本研究成果可為不結(jié)球白菜的抗寒育種提供關(guān)鍵的基因資源和理論指導(dǎo)。明確CBF基因的功能和調(diào)控路徑后，育種工作者能夠利用現(xiàn)代生物技術(shù)，如基因編輯、分子標(biāo)記輔助選擇等手段，精準(zhǔn)地改良不結(jié)球白菜的抗寒性狀，培育出更多適應(yīng)低溫環(huán)境的優(yōu)良品種。這不僅有助于提高不結(jié)球白菜在低溫季節(jié)的產(chǎn)量和品質(zhì)，保障蔬菜的穩(wěn)定供應(yīng)，還能降低因低溫災(zāi)害造成的農(nóng)業(yè)損失，促進(jìn)蔬菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，滿足市場對優(yōu)質(zhì)、抗寒蔬菜品種的需求。二、不結(jié)球白菜冷相關(guān)CBF基因的鑒定2.1實(shí)驗(yàn)材料與方法本研究選取了具有代表性的不結(jié)球白菜品種“蘇州青”作為實(shí)驗(yàn)材料，該品種在長江中下游地區(qū)廣泛種植，對低溫脅迫具有一定的響應(yīng)特征，且前期已有研究從不結(jié)球白菜品種蘇州青中分離得到8個CBF同源基因，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了一定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)材料種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜試驗(yàn)基地的智能溫室中，采用常規(guī)的栽培管理措施，確保植株生長環(huán)境的一致性和穩(wěn)定性。溫室條件設(shè)置為白天溫度22-25℃，夜間溫度18-20℃，光照時間為12小時/天，相對濕度保持在60%-70%，為不結(jié)球白菜的正常生長提供適宜的環(huán)境。在基因鑒定過程中，綜合運(yùn)用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)。首先，利用生物信息學(xué)手段，在不結(jié)球白菜全基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，以擬南芥CBF基因家族成員的氨基酸序列作為查詢探針，通過BLASTP程序進(jìn)行同源性比對，設(shè)置E值閾值為1e-5，初步篩選出可能的不結(jié)球白菜冷相關(guān)CBF基因序列。然后，對篩選出的序列進(jìn)行進(jìn)一步分析，包括開放閱讀框（ORF）預(yù)測、保守結(jié)構(gòu)域分析等，以確定其是否屬于CBF基因家族成員。利用NCBI的ORFFinder工具預(yù)測開放閱讀框，通過Pfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，確保鑒定出的基因具有典型的CBF基因結(jié)構(gòu)特征，如AP2結(jié)構(gòu)域等。在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方面，采用RT-PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）技術(shù)對預(yù)測得到的CBF基因進(jìn)行克隆驗(yàn)證。具體步驟為，采集低溫脅迫處理（4℃，處理時間分別為0h、1h、3h、6h、12h、24h）和正常生長條件下的不結(jié)球白菜葉片組織，迅速放入液氮中冷凍保存，用于后續(xù)RNA提取。使用TRIzol試劑提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的操作步驟，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)生物信息學(xué)分析得到的CBF基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，引物設(shè)計(jì)遵循引物長度在18-25bp之間，GC含量在40%-60%之間，避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成的原則。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系包括10×PCRBuffer、dNTPs、上下游引物、TaqDNA聚合酶和模板cDNA，總體積為25μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸1-2min（根據(jù)基因片段長度調(diào)整），共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切取目的條帶，利用凝膠回收試劑盒回收純化，將回收產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定陽性克隆，將陽性克隆送測序公司進(jìn)行測序驗(yàn)證，確保克隆得到的基因序列的準(zhǔn)確性。2.2CBF基因的分離與克隆通過上述實(shí)驗(yàn)方法，從不結(jié)球白菜品種“蘇州青”中成功分離和克隆了8個CBF同源基因，分別命名為BcCBF1-8。對這些基因的核苷酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，它們的開放閱讀框長度在600-750bp之間，編碼的氨基酸數(shù)量約為200-250個。序列比對分析發(fā)現(xiàn)，這些BcCBF蛋白與擬南芥中的同源蛋白具有較高的相似性，相似性范圍在65%-80%之間，尤其是在AP2結(jié)構(gòu)域區(qū)域，相似性高達(dá)85%以上，這進(jìn)一步證實(shí)了所克隆的基因?qū)儆贑BF基因家族成員。對這8個CBF基因的序列特征進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)它們均含有典型的AP2結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由大約60個氨基酸組成，具有保守的氨基酸殘基和特定的空間結(jié)構(gòu)，是CBF轉(zhuǎn)錄因子與下游冷響應(yīng)基因啟動子區(qū)域的CRT/DRE順式作用元件結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。在AP2結(jié)構(gòu)域的兩側(cè)，還存在一些其他的保守序列，如N端的PKK/RPAGRxKFxETRHP保守基序和C端的DSAWR保守基序，這些保守基序在CBF蛋白的功能行使中可能發(fā)揮著重要作用，如參與蛋白-蛋白相互作用、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活活性等。此外，通過對基因序列的分析，還發(fā)現(xiàn)不同的BcCBF基因在核苷酸序列和氨基酸序列上存在一定的差異，這些差異可能導(dǎo)致它們在功能和表達(dá)調(diào)控上具有一定的特異性，為后續(xù)深入研究它們在不結(jié)球白菜抗寒過程中的功能多樣性和協(xié)同作用機(jī)制提供了線索。2.3CBF基因的生物信息學(xué)分析對分離克隆得到的8個不結(jié)球白菜冷相關(guān)CBF基因進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析，以深入了解這些基因編碼蛋白的特性及其在進(jìn)化過程中的地位。利用ProtParam工具對BcCBF蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果顯示，這些蛋白的分子量在22-26kDa之間，等電點(diǎn)（pI）范圍為5.5-6.5，表現(xiàn)為酸性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)均小于40，表明它們屬于穩(wěn)定蛋白。脂肪族氨基酸指數(shù)在75-85之間，總平均親水性為負(fù)值，說明BcCBF蛋白具有一定的親水性。通過在線工具SMART和Pfam對BcCBF蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，進(jìn)一步確認(rèn)了它們均含有典型的AP2結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由約60個氨基酸組成，包含保守的YRG和RAYD基序，這些基序?qū)τ贑BF蛋白與下游冷響應(yīng)基因啟動子區(qū)域的CRT/DRE順式作用元件（核心序列為CCGAC）的特異性結(jié)合至關(guān)重要。在AP2結(jié)構(gòu)域的N端，存在PKK/RPAGRxKFxETRHP保守基序，該基序可能參與蛋白-蛋白相互作用，有助于CBF蛋白與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子形成復(fù)合物，協(xié)同調(diào)節(jié)基因表達(dá)；在C端，DSAWR保守基序則可能在調(diào)節(jié)CBF蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性方面發(fā)揮作用。為了探究不結(jié)球白菜CBF基因與其他物種CBF基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，選取了擬南芥、大白菜、甘藍(lán)等十字花科植物以及水稻、玉米等非十字花科植物的CBF基因序列，利用MEGA7.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。在構(gòu)建過程中，進(jìn)行了1000次自展檢驗(yàn)（Bootstraptest）以評估分支的可靠性。結(jié)果顯示，不結(jié)球白菜的CBF基因與大白菜的CBF基因親緣關(guān)系最為密切，在進(jìn)化樹上聚為一支，這與它們同屬蕓薹屬的分類地位相符。而與擬南芥、甘藍(lán)等其他十字花科植物的CBF基因也具有一定的親緣關(guān)系，共同構(gòu)成了十字花科植物CBF基因的進(jìn)化分支。與非十字花科植物水稻、玉米的CBF基因相比，不結(jié)球白菜的CBF基因在進(jìn)化樹上的分支距離較遠(yuǎn)，表明它們在進(jìn)化過程中發(fā)生了較大的分化。通過BLASTP分析，對不結(jié)球白菜BcCBF蛋白與其他物種同源蛋白的相似性進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，BcCBF蛋白與大白菜中同源蛋白的相似性最高，達(dá)到85%-95%，進(jìn)一步證實(shí)了兩者在進(jìn)化上的緊密關(guān)系。與擬南芥同源蛋白的相似性為65%-80%，與甘藍(lán)同源蛋白的相似性為70%-85%，這些相似性數(shù)據(jù)為深入研究不結(jié)球白菜CBF基因的功能提供了重要參考，暗示了它們在功能上可能具有一定的保守性，同時也可能存在因物種特異性而導(dǎo)致的功能差異。2.4結(jié)果與討論通過本研究，成功從不結(jié)球白菜品種“蘇州青”中鑒定出8個冷相關(guān)CBF基因，這為深入研究不結(jié)球白菜的抗寒分子機(jī)制提供了重要的基因資源。對這些基因的序列分析和生物信息學(xué)研究，揭示了它們的結(jié)構(gòu)特征、理化性質(zhì)以及在進(jìn)化過程中的地位。這些CBF基因所編碼的蛋白均具有典型的AP2結(jié)構(gòu)域以及保守基序，這與已報(bào)道的其他植物CBF蛋白結(jié)構(gòu)特征一致，表明它們在進(jìn)化過程中具有較高的保守性，可能在不結(jié)球白菜的低溫響應(yīng)過程中發(fā)揮著類似的功能，即通過與下游冷響應(yīng)基因啟動子區(qū)域的CRT/DRE順式作用元件結(jié)合，激活這些基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)不結(jié)球白菜的抗寒能力。在系統(tǒng)進(jìn)化分析中，不結(jié)球白菜的CBF基因與大白菜的親緣關(guān)系最近，這與它們同屬蕓薹屬的分類地位相符。這種親緣關(guān)系的緊密性暗示著它們在功能和調(diào)控機(jī)制上可能具有較高的相似性，為進(jìn)一步參考大白菜的相關(guān)研究成果來深入探究不結(jié)球白菜CBF基因的功能和調(diào)控路徑提供了依據(jù)。然而，與擬南芥、甘藍(lán)等其他十字花科植物以及非十字花科植物相比，不結(jié)球白菜的CBF基因在進(jìn)化樹上呈現(xiàn)出不同的分支模式。這表明在長期的進(jìn)化過程中，不同物種的CBF基因在保持一定保守性的同時，也發(fā)生了適應(yīng)性的分化，以適應(yīng)各自的生長環(huán)境和進(jìn)化需求。這些分化可能導(dǎo)致了它們在基因表達(dá)調(diào)控、蛋白功能特性以及參與的生物學(xué)過程等方面存在差異。與以往對不結(jié)球白菜CBF基因的研究相比，本研究在基因鑒定的數(shù)量和分析的全面性上具有一定的優(yōu)勢。以往研究雖然也鑒定出了一些不結(jié)球白菜的CBF基因，但本研究通過更系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，鑒定出了8個CBF同源基因，并對它們的序列特征、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域組成以及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了詳細(xì)的分析，為深入理解不結(jié)球白菜CBF基因家族的組成和進(jìn)化提供了更全面的信息。然而，本研究也存在一定的局限性。在基因功能驗(yàn)證方面，雖然通過生物信息學(xué)分析對這些CBF基因的功能進(jìn)行了初步預(yù)測，但尚未進(jìn)行全面深入的功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。未來需要進(jìn)一步構(gòu)建基因過量表達(dá)和基因沉默載體，轉(zhuǎn)化不結(jié)球白菜或其他模式植物，通過表型分析和生理生化指標(biāo)檢測，深入探究這些CBF基因在不結(jié)球白菜抗寒過程中的具體功能和作用機(jī)制。此外，在調(diào)控路徑的研究上，雖然對CBF基因的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析，但對于它們的上游調(diào)控因子和下游靶基因的研究還不夠深入。后續(xù)需要利用酵母雙雜交、染色質(zhì)免疫沉淀等技術(shù)，全面挖掘CBF基因的上下游調(diào)控基因，構(gòu)建完整的CBF冷響應(yīng)通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而更深入地揭示不結(jié)球白菜的抗寒分子機(jī)制。三、不結(jié)球白菜CBF基因的脅迫表達(dá)模式3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為了深入探究不結(jié)球白菜CBF基因在不同脅迫條件下的表達(dá)模式，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了多種脅迫處理組，包括低溫、干旱和脫落酸（ABA）處理。對于低溫脅迫處理，選取生長狀況一致、處于四葉一心期的不結(jié)球白菜幼苗，將其從智能溫室轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度為4℃，光照強(qiáng)度為150μmol?m?2?s?1，光照時間為12小時/天，模擬低溫環(huán)境。分別在處理0h、1h、3h、6h、12h和24h時，采集幼苗的葉片組織，迅速放入液氮中冷凍，隨后保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)的RNA提取和基因表達(dá)分析。在干旱脅迫處理中，采用PEG-6000模擬干旱環(huán)境。將不結(jié)球白菜幼苗根部浸泡在含有20%（w/v）PEG-6000的Hoagland營養(yǎng)液中，以正常Hoagland營養(yǎng)液處理的幼苗作為對照。處理?xiàng)l件與低溫脅迫處理中的光照培養(yǎng)箱條件一致。同樣在處理0h、1h、3h、6h、12h和24h時，采集葉片組織，經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱。ABA脅迫處理則是將不結(jié)球白菜幼苗噴施濃度為100μmol/L的ABA溶液，以噴施等量蒸餾水的幼苗作為對照。處理后的幼苗放置在與上述相同條件的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照與前兩種脅迫處理相同的時間節(jié)點(diǎn)，采集葉片組織，經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱。在整個實(shí)驗(yàn)過程中，每個處理組均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)選取3株幼苗，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。同時，在采集樣品時，盡量選取植株相同部位的葉片，以減少因組織差異導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差。3.2實(shí)時定量PCR分析采用實(shí)時定量PCR（qPCR）技術(shù)對不同脅迫處理下不結(jié)球白菜CBF基因的表達(dá)量進(jìn)行精確檢測。實(shí)驗(yàn)前，從-80℃冰箱中取出保存的葉片樣品，使用TRIzol試劑提取總RNA，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。提取過程中，確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境的無RNA酶污染，以防止RNA降解。提取完成后，利用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度，要求RNA的OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。接著，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系和反應(yīng)條件依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行優(yōu)化設(shè)置。在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，加入適量的隨機(jī)引物或寡聚dT引物，以確保mRNA能夠高效反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA保存于-20℃冰箱備用。根據(jù)已克隆的不結(jié)球白菜CBF基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)qPCR特異性引物，引物設(shè)計(jì)遵循以下原則：引物長度在18-25bp之間，GC含量在40%-60%之間，避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，且擴(kuò)增片段長度在100-200bp之間，以保證擴(kuò)增的特異性和效率。同時，選擇不結(jié)球白菜的Actin基因作為內(nèi)參基因，用于校正目的基因的表達(dá)量，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。引物由專業(yè)的生物技術(shù)公司合成，合成后經(jīng)PAGE純化，以去除雜質(zhì)，保證引物質(zhì)量。qPCR反應(yīng)采用SYBRGreen熒光染料法，在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系總體積為20μL，包括10μL的SYBRGreenMasterMix、上下游引物各0.5μL（10μmol/L）、2μL的cDNA模板以及7μL的ddH?O。反應(yīng)程序設(shè)置如下：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析，從60℃緩慢升溫至95℃，以檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。在實(shí)驗(yàn)過程中，每個樣品設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)，以減小實(shí)驗(yàn)誤差。同時設(shè)置無模板對照（NTC），即反應(yīng)體系中不加入cDNA模板，用于檢測引物二聚體和試劑污染情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用ABI7500系統(tǒng)自帶的軟件進(jìn)行收集和初步分析，得到每個樣品的Ct值（Cyclethreshold），Ct值表示每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，Ct值與模板初始濃度呈負(fù)相關(guān)。采用2?ΔΔCt法對qPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和分析，以獲得不同脅迫處理下CBF基因的相對表達(dá)量。首先，計(jì)算目的基因與內(nèi)參基因的Ct值之差（ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因），然后計(jì)算處理組與對照組的ΔCt值之差（ΔΔCt=ΔCt處理組-ΔCt對照組），最后通過公式2?ΔΔCt計(jì)算出目的基因在處理組相對于對照組的相對表達(dá)量。利用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對不同處理組的相對表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）和Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，以P<0.05作為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。通過Origin2021軟件繪制基因表達(dá)量變化的柱狀圖或折線圖，直觀展示不同脅迫處理下CBF基因的表達(dá)模式。3.3表達(dá)模式分析通過實(shí)時定量PCR的檢測結(jié)果，對不同脅迫處理下不結(jié)球白菜CBF基因的表達(dá)模式進(jìn)行深入分析。在低溫脅迫處理組中，結(jié)果顯示，BcCBF1-3基因的表達(dá)量在低溫處理后迅速上升。其中，BcCBF1基因在低溫處理1h時，表達(dá)量相較于對照組（0h）顯著增加，達(dá)到對照組的5倍左右，隨后在3h時繼續(xù)上升至對照組的8倍左右，在6h時表達(dá)量略有下降，但仍維持在較高水平，為對照組的6倍左右，12h和24h時表達(dá)量逐漸降低，但仍顯著高于對照組。BcCBF2基因在低溫處理1h時表達(dá)量開始顯著上調(diào)，為對照組的4倍左右，3h時達(dá)到峰值，是對照組的10倍左右，之后隨著處理時間的延長，表達(dá)量逐漸下降，但在24h時仍保持在對照組的3倍左右。BcCBF3基因的表達(dá)模式與BcCBF1和BcCBF2類似，在低溫處理1h時表達(dá)量顯著增加，為對照組的6倍左右，3h時達(dá)到最高，是對照組的12倍左右，隨后逐漸降低，24h時表達(dá)量為對照組的4倍左右。這些基因在低溫脅迫下的快速誘導(dǎo)表達(dá)，表明它們可能在不結(jié)球白菜對低溫的早期響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，通過激活下游冷響應(yīng)基因的表達(dá)，啟動一系列生理生化反應(yīng)，以增強(qiáng)植株對低溫脅迫的適應(yīng)能力。與之形成對比的是，BcCBF4-6基因在低溫脅迫下的表達(dá)變化不顯著。在整個低溫處理過程中（0h-24h），BcCBF4基因的表達(dá)量與對照組相比，差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，始終維持在相對穩(wěn)定的水平。BcCBF5和BcCBF6基因的表達(dá)情況也類似，在低溫脅迫下沒有出現(xiàn)明顯的上調(diào)或下調(diào)趨勢，說明這部分基因可能不直接參與不結(jié)球白菜對低溫脅迫的響應(yīng)，或者它們在低溫響應(yīng)中的作用機(jī)制與BcCBF1-3基因不同，可能受到其他因素的調(diào)控或參與其他生物學(xué)過程。在干旱脅迫處理組中，BcCBF4-6基因的表達(dá)量呈現(xiàn)出明顯的變化。BcCBF4基因在干旱處理3h時，表達(dá)量開始顯著增加，相較于對照組增加了3倍左右，6h時達(dá)到峰值，為對照組的5倍左右，隨后在12h和24h時逐漸下降，但仍顯著高于對照組。BcCBF5基因在干旱處理6h時，表達(dá)量顯著上調(diào)，是對照組的4倍左右，12h時達(dá)到最高，為對照組的6倍左右，24h時表達(dá)量略有下降，但仍維持在較高水平。BcCBF6基因在干旱處理3h時表達(dá)量開始上升，6h時顯著增加，為對照組的3倍左右，12h和24h時保持在較高水平。這些結(jié)果表明，BcCBF4-6基因?qū)Ω珊得{迫較為敏感，可能在不結(jié)球白菜應(yīng)對干旱脅迫的過程中發(fā)揮重要作用，通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響植株的滲透調(diào)節(jié)、水分運(yùn)輸?shù)壬磉^程，以增強(qiáng)植株的抗旱能力。在ABA脅迫處理組中，BcCBF4-6基因同樣表現(xiàn)出顯著的表達(dá)變化。BcCBF4基因在ABA處理1h時，表達(dá)量迅速上升，為對照組的3倍左右，3h時達(dá)到峰值，是對照組的6倍左右，隨后逐漸下降，但在24h時仍顯著高于對照組。BcCBF5基因在ABA處理3h時，表達(dá)量顯著上調(diào)，為對照組的4倍左右，6h時達(dá)到最高，為對照組的7倍左右，之后逐漸降低。BcCBF6基因在ABA處理1h時表達(dá)量開始增加，3h時顯著上升，為對照組的4倍左右，6h和12h時保持在較高水平。這表明BcCBF4-6基因的表達(dá)受到ABA的調(diào)控，參與了ABA依賴的信號傳導(dǎo)途徑，在不結(jié)球白菜對ABA的響應(yīng)以及相關(guān)生理過程的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。綜上所述，根據(jù)不同脅迫處理下CBF基因的表達(dá)模式，可以初步推斷BcCBF1-3基因主要參與ABA-獨(dú)立的低溫響應(yīng)路徑，它們在低溫脅迫下能夠迅速被誘導(dǎo)表達(dá)，可能是不結(jié)球白菜低溫響應(yīng)的關(guān)鍵基因；而BcCBF4-6基因則參與ABA-依賴的脅迫響應(yīng)路徑，在干旱和ABA脅迫下發(fā)揮重要作用。這一結(jié)果與以往對擬南芥等植物的研究結(jié)果既有相似之處，也存在一定差異。在擬南芥中，CBF基因家族主要參與ABA-獨(dú)立的低溫響應(yīng)路徑，但本研究發(fā)現(xiàn)不結(jié)球白菜中存在部分CBF基因參與ABA-依賴路徑，這暗示了不結(jié)球白菜在應(yīng)對低溫及其他脅迫時，其CBF冷響應(yīng)通路具有獨(dú)特的調(diào)控機(jī)制，可能存在ABA依賴路徑和ABA獨(dú)立路徑相互關(guān)聯(lián)、協(xié)同作用的情況，為進(jìn)一步深入研究不結(jié)球白菜的抗寒分子機(jī)制提供了新的線索和研究方向。3.4結(jié)果與討論本研究通過實(shí)時定量PCR技術(shù)，全面分析了不結(jié)球白菜中8個CBF基因在低溫、干旱和ABA脅迫下的表達(dá)模式。研究結(jié)果表明，不同的CBF基因在不同脅迫條件下呈現(xiàn)出明顯不同的表達(dá)模式，這為深入理解不結(jié)球白菜的抗逆分子機(jī)制提供了重要線索。在低溫脅迫下，BcCBF1-3基因的表達(dá)迅速上調(diào)，且在低溫處理后的短時間內(nèi)達(dá)到較高水平，隨后逐漸下降。這種快速響應(yīng)的表達(dá)模式表明，BcCBF1-3基因可能在不結(jié)球白菜對低溫脅迫的早期響應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在低溫脅迫初期，植物需要迅速啟動一系列防御機(jī)制來應(yīng)對低溫的挑戰(zhàn)，BcCBF1-3基因的快速表達(dá)可能是激活下游冷響應(yīng)基因的關(guān)鍵步驟。下游冷響應(yīng)基因編碼的產(chǎn)物可以參與多種生理生化過程，如調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動性、合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等，從而幫助植物維持細(xì)胞的正常生理功能，增強(qiáng)其抗寒能力。與BcCBF1-3基因不同，BcCBF4-6基因在低溫脅迫下的表達(dá)變化不顯著，這暗示著它們可能不直接參與不結(jié)球白菜對低溫脅迫的響應(yīng)，或者它們在低溫響應(yīng)中的作用方式與BcCBF1-3基因不同，可能需要其他信號分子或轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用來參與低溫響應(yīng)過程。在干旱脅迫下，BcCBF4-6基因的表達(dá)顯著上調(diào)，表明它們可能在不結(jié)球白菜應(yīng)對干旱脅迫中發(fā)揮重要作用。干旱脅迫會導(dǎo)致植物細(xì)胞失水，影響植物的正常生長發(fā)育。BcCBF4-6基因的表達(dá)上調(diào)可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，參與植物的滲透調(diào)節(jié)、氣孔調(diào)節(jié)和抗氧化防御等生理過程。通過調(diào)節(jié)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成和積累，如脯氨酸、可溶性糖等，維持細(xì)胞的膨壓，保證細(xì)胞的正常生理功能；或者通過調(diào)節(jié)氣孔的開閉，減少水分的散失，提高植物的抗旱能力。這與前人在其他植物中的研究結(jié)果相似，一些植物中的CBF基因不僅參與低溫響應(yīng)，還在干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用，說明CBF基因在植物應(yīng)對多種非生物脅迫中可能具有保守的功能。ABA作為一種重要的植物激素，在植物應(yīng)對逆境脅迫中發(fā)揮著關(guān)鍵的信號傳導(dǎo)作用。本研究中，BcCBF4-6基因在ABA脅迫下的表達(dá)顯著上調(diào)，表明它們參與了ABA依賴的信號傳導(dǎo)途徑。ABA可以感知環(huán)境脅迫信號，并通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物的抗逆性。BcCBF4-6基因可能是ABA信號傳導(dǎo)途徑中的重要組成部分，它們的表達(dá)受到ABA的調(diào)控，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)植物對干旱和其他脅迫的響應(yīng)。這一結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了BcCBF4-6基因在不結(jié)球白菜應(yīng)對非生物脅迫中的重要作用，以及ABA在植物抗逆調(diào)控中的核心地位。綜合以上結(jié)果，本研究將不結(jié)球白菜的CBF基因分為兩組。BcCBF1-3基因主要參與ABA-獨(dú)立的低溫響應(yīng)路徑，它們在低溫脅迫下的快速誘導(dǎo)表達(dá)，使其成為不結(jié)球白菜低溫響應(yīng)的關(guān)鍵基因。BcCBF4-6基因則參與ABA-依賴的脅迫響應(yīng)路徑，在干旱和ABA脅迫下發(fā)揮重要作用。這種分組方式與擬南芥等植物中CBF基因的功能分類既有相似之處，也存在差異。在擬南芥中，CBF基因家族主要參與ABA-獨(dú)立的低溫響應(yīng)路徑，但本研究發(fā)現(xiàn)不結(jié)球白菜中存在部分CBF基因參與ABA-依賴路徑，這表明不結(jié)球白菜在進(jìn)化過程中，其CBF冷響應(yīng)通路可能發(fā)生了適應(yīng)性的變化，以更好地應(yīng)對不同的環(huán)境脅迫。這種差異可能是由于不同植物在進(jìn)化過程中，面臨的環(huán)境選擇壓力不同，導(dǎo)致其基因功能和調(diào)控機(jī)制發(fā)生了分化。本研究結(jié)果為深入理解不結(jié)球白菜的抗寒分子機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時也為進(jìn)一步研究CBF基因在植物應(yīng)對多種非生物脅迫中的功能和調(diào)控機(jī)制提供了新的思路。未來的研究可以圍繞這些差異，進(jìn)一步探究不結(jié)球白菜CBF基因的功能多樣性和協(xié)同作用機(jī)制，以及它們在ABA依賴和ABA獨(dú)立路徑中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過基因編輯、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)手段，驗(yàn)證這些基因的功能，并挖掘其上下游調(diào)控基因，為培育抗寒、抗旱等多抗的不結(jié)球白菜新品種提供理論支持和基因資源。四、不結(jié)球白菜CBF基因的調(diào)控路徑研究4.1上游調(diào)控因子對CBF基因的調(diào)控4.1.1BcWRKY33對BcCBF3的調(diào)控為深入探究不結(jié)球白菜CBF基因的上游調(diào)控機(jī)制，本研究聚焦于BcWRKY33對BcCBF3的調(diào)控關(guān)系。首先，對BcCBF3的啟動子序列展開細(xì)致分析，運(yùn)用生物信息學(xué)工具，成功鑒定出兩個WRKY結(jié)合順式元件W-box。這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)研究BcWRKY33與BcCBF3之間的調(diào)控關(guān)系提供了關(guān)鍵線索。為了驗(yàn)證這兩個W-box元件在調(diào)控過程中的作用，進(jìn)行了鹽處理表達(dá)模式分析以及煙草的GUS染色實(shí)驗(yàn)。在鹽處理表達(dá)模式分析中，設(shè)置不同濃度的鹽溶液處理不結(jié)球白菜植株，在處理后的不同時間點(diǎn)采集葉片組織，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測BcCBF3基因的表達(dá)量變化。結(jié)果顯示，隨著鹽濃度的增加和處理時間的延長，BcCBF3基因的表達(dá)量呈現(xiàn)出明顯的變化趨勢，在特定鹽濃度和處理時間下，表達(dá)量顯著上調(diào)，表明鹽脅迫能夠誘導(dǎo)BcCBF3基因的表達(dá)，且這種誘導(dǎo)可能與W-box元件相關(guān)。在煙草的GUS染色實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建了含有BcCBF3啟動子（包含W-box元件）和GUS報(bào)告基因的重組載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將其導(dǎo)入煙草植株中。對轉(zhuǎn)化后的煙草植株進(jìn)行組織化學(xué)染色，觀察GUS基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在含有W-box元件的啟動子驅(qū)動下，GUS基因在煙草的葉片、莖等組織中均有明顯表達(dá)，而當(dāng)對W-box元件進(jìn)行突變處理后，GUS基因的表達(dá)顯著減弱，這進(jìn)一步證實(shí)了兩個W-box對于WRKY的結(jié)合具有重要作用，它們是BcWRKY33調(diào)控BcCBF3基因表達(dá)的關(guān)鍵順式作用元件。進(jìn)一步對BcWRKY33過量表達(dá)的不結(jié)球白菜中CBF相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)分析。利用Gateway技術(shù)構(gòu)建BcWRKY33的過量表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得BcWRKY33過量表達(dá)的不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)基因植株。在正常生長條件下，對轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株中BcCBF3基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株中BcCBF3基因的表達(dá)量顯著高于野生型植株，表明BcWRKY33的組成型表達(dá)能夠激活BcCBF3的轉(zhuǎn)錄。在低溫脅迫下，分別對轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株進(jìn)行4℃低溫處理，在處理后的不同時間點(diǎn)（0h、1h、3h、6h、12h、24h）采集葉片組織，檢測BcWRKY33和BcCBF3基因的表達(dá)量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低溫處理后，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株中BcWRKY33和BcCBF3基因的表達(dá)量均迅速上調(diào)，但轉(zhuǎn)基因植株中兩者的表達(dá)量變化幅度明顯大于野生型植株。在低溫處理3h時，轉(zhuǎn)基因植株中BcWRKY33的表達(dá)量相較于0h增加了5倍左右，BcCBF3的表達(dá)量增加了8倍左右；而野生型植株中BcWRKY33的表達(dá)量增加了3倍左右，BcCBF3的表達(dá)量增加了5倍左右。這表明在低溫脅迫下，BcWRKY33對BcCBF3的激活作用更為顯著，它們的表達(dá)變化協(xié)同增強(qiáng)，共同參與不結(jié)球白菜對低溫脅迫的響應(yīng)過程。綜上所述，BcWRKY33通過與BcCBF3啟動子上的W-box元件結(jié)合，激活BcCBF3的轉(zhuǎn)錄，在不結(jié)球白菜應(yīng)對低溫脅迫的過程中，BcWRKY33和BcCBF3的表達(dá)變化協(xié)同作用，共同調(diào)控不結(jié)球白菜的抗寒反應(yīng)。這一調(diào)控關(guān)系的揭示，為深入理解不結(jié)球白菜CBF冷響應(yīng)通路的上游調(diào)控機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.1.2其他上游轉(zhuǎn)錄因子的潛在調(diào)控除了BcWRKY33對BcCBF3的調(diào)控外，還有其他轉(zhuǎn)錄因子可能參與不結(jié)球白菜CBF基因的上游調(diào)控。通過對白菜類作物CBF基因的啟動子順式元件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其都含有MYB結(jié)合元件，這表明MYB轉(zhuǎn)錄因子在白菜類作物CBF上游調(diào)控中可能具有普遍性作用。在大白菜中，已有研究鑒定出了256個R2R3-MYB基因，并通過進(jìn)化樹分析將大白菜中的273個R2R3-、3R-和非典型的MYB蛋白分成45個亞組。RNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)和實(shí)時定量PCR分析反映了R2R3-BrMYB基因的組織差異表達(dá)特性及對環(huán)境脅迫和ABA信號的響應(yīng)表達(dá)模式。結(jié)果表明，C11、C14、C31、C36和C38等亞組成員可能參與大白菜的多脅迫應(yīng)答機(jī)制，C42亞組MYB基因可能是低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，這些亞組成員中很可能存在著冷相關(guān)CBF基因的上游調(diào)控因子。雖然目前尚未在不結(jié)球白菜中直接驗(yàn)證這些MYB轉(zhuǎn)錄因子對CBF基因的調(diào)控作用，但基于大白菜與不結(jié)球白菜的親緣關(guān)系以及順式元件分析結(jié)果，可以合理推測不結(jié)球白菜中的MYB轉(zhuǎn)錄因子也可能通過與CBF基因啟動子區(qū)域的MYB結(jié)合元件相互作用，參與CBF基因的表達(dá)調(diào)控。例如，在其他植物中，MYB轉(zhuǎn)錄因子已被證實(shí)能夠在低溫脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)，然后與CBF基因啟動子結(jié)合，激活或抑制CBF基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控植物的抗寒能力。在擬南芥中，AtMYB15能夠與AtCBF基因啟動子區(qū)域的MYB結(jié)合元件結(jié)合，抑制AtCBF基因的表達(dá)，進(jìn)而負(fù)調(diào)控?cái)M南芥的抗寒能力。在蘋果中，MdMYB308L可通過與bHLH蛋白相互作用，促進(jìn)bHLH蛋白與MdCBF2啟動子的結(jié)合，從而調(diào)控蘋果的耐寒性。此外，其他類型的轉(zhuǎn)錄因子如bHLH、NAC等也可能參與不結(jié)球白菜CBF基因的上游調(diào)控。在植物的低溫響應(yīng)過程中，不同轉(zhuǎn)錄因子之間往往存在復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，它們協(xié)同調(diào)控CBF基因的表達(dá)。在擬南芥中，bHLH轉(zhuǎn)錄因子ICE1（InducerofCBFexpression1）能夠在低溫脅迫下與CBF基因啟動子區(qū)域的MYC識別位點(diǎn)結(jié)合，激活CBF基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物的抗寒能力。而NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對多種逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，它們可能通過與CBF基因啟動子區(qū)域的特定順式元件結(jié)合，或者與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，間接調(diào)控CBF基因的表達(dá)。未來的研究可以利用酵母單雜交、染色質(zhì)免疫沉淀-測序（ChIP-seq）等技術(shù)，在不結(jié)球白菜中篩選和驗(yàn)證與CBF基因啟動子相互作用的MYB及其他轉(zhuǎn)錄因子，深入探究它們在低溫脅迫下對CBF基因的調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步完善不結(jié)球白菜CBF冷響應(yīng)通路的上游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。4.2CBF基因?qū)ο掠位虻恼{(diào)控4.2.1BcCBF3對下游基因BcCOR15A的調(diào)控在不結(jié)球白菜的CBF冷響應(yīng)通路中，BcCBF3作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，對下游基因BcCOR15A的表達(dá)調(diào)控起著至關(guān)重要的作用。為深入探究BcCBF3對BcCOR15A的調(diào)控機(jī)制，本研究運(yùn)用了多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法。通過構(gòu)建含有BcCBF3基因的過量表達(dá)載體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將其導(dǎo)入不結(jié)球白菜植株中，獲得了BcCBF3過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行低溫脅迫處理，同時設(shè)置野生型植株作為對照。在低溫處理后的不同時間點(diǎn)，采集葉片組織，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測BcCOR15A基因的表達(dá)量變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在低溫脅迫下，BcCBF3過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株中BcCOR15A基因的表達(dá)量顯著高于野生型植株。在低溫處理3h時，轉(zhuǎn)基因植株中BcCOR15A的表達(dá)量相較于野生型植株增加了3倍左右，表明BcCBF3能夠顯著激活BcCOR15A的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)其表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證BcCBF3與BcCOR15A之間的調(diào)控關(guān)系，利用染色質(zhì)免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）技術(shù)，檢測BcCBF3蛋白與BcCOR15A基因啟動子區(qū)域的結(jié)合情況。首先，提取低溫脅迫處理后的不結(jié)球白菜葉片細(xì)胞核蛋白，用抗BcCBF3抗體進(jìn)行免疫沉淀，富集與BcCBF3蛋白結(jié)合的DNA片段。然后，以富集得到的DNA片段為模板，針對BcCOR15A基因啟動子區(qū)域含有CRT/DRE順式作用元件（核心序列為CCGAC）的片段設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，在低溫脅迫下，BcCBF3蛋白能夠特異性地結(jié)合到BcCOR15A基因啟動子區(qū)域的CRT/DRE順式作用元件上，從而激活BcCOR15A基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)對CRT/DRE順式作用元件進(jìn)行突變處理后，BcCBF3蛋白與BcCOR15A基因啟動子區(qū)域的結(jié)合能力顯著下降，BcCOR15A基因的表達(dá)量也明顯降低，這進(jìn)一步證實(shí)了BcCBF3通過與BcCOR15A基因啟動子區(qū)域的CRT/DRE順式作用元件結(jié)合，調(diào)控BcCOR15A基因的表達(dá)。BcCOR15A基因編碼的產(chǎn)物在不結(jié)球白菜應(yīng)對低溫脅迫的過程中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，BcCOR15A基因編碼的蛋白能夠定位于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中。在低溫脅迫下，BcCOR15A蛋白可以與葉綠體膜上的某些蛋白相互作用，增強(qiáng)葉綠體膜的穩(wěn)定性，減少低溫對葉綠體結(jié)構(gòu)和功能的損傷，從而維持光合作用的正常進(jìn)行。同時，BcCOR15A蛋白還可能參與細(xì)胞內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)過程，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的滲透壓，保持細(xì)胞的水分平衡，增強(qiáng)不結(jié)球白菜對低溫脅迫的耐受性。綜上所述，BcCBF3通過與BcCOR15A基因啟動子區(qū)域的CRT/DRE順式作用元件結(jié)合，激活BcCOR15A基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控不結(jié)球白菜對低溫脅迫的響應(yīng)。BcCOR15A基因編碼的產(chǎn)物在維持葉綠體穩(wěn)定性和細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用，與BcCBF3協(xié)同作用，增強(qiáng)不結(jié)球白菜的抗寒能力。4.2.2其他下游基因的調(diào)控除了BcCOR15A基因外，不結(jié)球白菜中的CBF基因還可能調(diào)控其他一系列下游基因的表達(dá)，這些基因參與植物體內(nèi)多種生理生化過程，共同構(gòu)成了復(fù)雜的CBF冷響應(yīng)通路，以增強(qiáng)植物對低溫脅迫的適應(yīng)能力。通過對不結(jié)球白菜在低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)了多個受CBF基因調(diào)控的潛在下游基因。這些基因的功能涉及多個方面，包括滲透調(diào)節(jié)、抗氧化防御、細(xì)胞膜穩(wěn)定性維持等。在滲透調(diào)節(jié)方面，一些下游基因編碼的蛋白參與脯氨酸、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成和運(yùn)輸過程。脯氨酸是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠在低溫脅迫下積累，調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，保持細(xì)胞的水分平衡。CBF基因可能通過調(diào)控脯氨酸合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，如吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）基因，促進(jìn)脯氨酸的合成，從而增強(qiáng)不結(jié)球白菜的抗寒能力。在可溶性糖的合成和運(yùn)輸方面，CBF基因可能影響蔗糖合成酶、己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)可溶性糖在細(xì)胞內(nèi)的積累和分布，提高細(xì)胞的滲透勢，增強(qiáng)植物的抗寒性能。在抗氧化防御方面，部分下游基因編碼抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等。低溫脅迫會導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子（O??）、過氧化氫（H?O?）等，這些ROS如果不能及時清除，會對細(xì)胞造成氧化損傷。SOD能夠?qū)??歧化為H?O?和O?，POD和CAT則可以將H?O?分解為H?O和O?，從而減輕ROS對細(xì)胞的傷害。CBF基因可能通過上調(diào)這些抗氧化酶基因的表達(dá)，增強(qiáng)不結(jié)球白菜的抗氧化防御能力，減少低溫脅迫下ROS對細(xì)胞的損傷。在細(xì)胞膜穩(wěn)定性維持方面，一些下游基因編碼的蛋白參與細(xì)胞膜脂的合成和修飾過程。細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界環(huán)境的屏障，其穩(wěn)定性對于細(xì)胞的正常功能至關(guān)重要。在低溫脅迫下，細(xì)胞膜的流動性會降低，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能受損。CBF基因可能調(diào)控脂肪酸去飽和酶基因的表達(dá)，促進(jìn)不飽和脂肪酸的合成，增加細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的含量，從而提高細(xì)胞膜的流動性和穩(wěn)定性，增強(qiáng)不結(jié)球白菜對低溫脅迫的耐受性。雖然目前已經(jīng)通過轉(zhuǎn)錄組分析等方法預(yù)測了一些CBF基因的下游基因，但這些基因與CBF基因之間的調(diào)控關(guān)系還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。未來的研究可以利用基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對這些潛在的下游基因進(jìn)行敲除或突變，觀察不結(jié)球白菜在低溫脅迫下的表型變化和生理生化指標(biāo)的改變，從而驗(yàn)證這些基因在CBF冷響應(yīng)通路中的功能和作用。同時，結(jié)合酵母單雜交、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等技術(shù)，深入研究CBF基因與這些下游基因啟動子區(qū)域的相互作用機(jī)制，進(jìn)一步完善不結(jié)球白菜CBF冷響應(yīng)通路的下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。4.3CBF基因調(diào)控路徑模型構(gòu)建綜合上述對不結(jié)球白菜CBF基因上游調(diào)控因子和下游靶基因的研究結(jié)果，構(gòu)建出不結(jié)球白菜CBF基因調(diào)控路徑模型（圖1）。在該模型中，上游調(diào)控因子主要包括BcWRKY33以及可能存在的MYB等轉(zhuǎn)錄因子。BcWRKY33通過與BcCBF3啟動子上的W-box元件結(jié)合，激活BcCBF3的轉(zhuǎn)錄，在低溫脅迫下，兩者的表達(dá)變化協(xié)同增強(qiáng)，共同參與不結(jié)球白菜對低溫脅迫的響應(yīng)。雖然目前尚未在不結(jié)球白菜中直接驗(yàn)證MYB轉(zhuǎn)錄因子對CBF基因的調(diào)控作用，但基于大白菜與不結(jié)球白菜的親緣關(guān)系以及順式元件分析結(jié)果，推測不結(jié)球白菜中的MYB轉(zhuǎn)錄因子可能通過與CBF基因啟動子區(qū)域的MYB結(jié)合元件相互作用，參與CBF基因的表達(dá)調(diào)控。此外，其他類型的轉(zhuǎn)錄因子如bHLH、NAC等也可能參與不結(jié)球白菜CBF基因的上游調(diào)控，不同轉(zhuǎn)錄因子之間可能存在復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，協(xié)同調(diào)控CBF基因的表達(dá)。[此處插入CBF基因調(diào)控路徑模型圖，圖中清晰展示上游調(diào)控因子、CBF基因、下游靶基因以及它們之間的相互作用關(guān)系]圖1：不結(jié)球白菜CBF基因調(diào)控路徑模型[此處插入CBF基因調(diào)控路徑模型圖，圖中清晰展示上游調(diào)控因子、CBF基因、下游靶基因以及它們之間的相互作用關(guān)系]圖1：不結(jié)球白菜CBF基因調(diào)控路徑模型圖1：不結(jié)球白菜CBF基因調(diào)控路徑模型在下游調(diào)控方面，以BcCBF3對BcCOR15A的調(diào)控為典型代表。BcCBF3作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，在低溫脅迫下，通過與BcCOR15A基因啟動子區(qū)域的CRT/DRE順式作用元件結(jié)合，激活BcCOR15A基因的轉(zhuǎn)錄。BcCOR15A基因編碼的產(chǎn)物在維持葉綠體穩(wěn)定性和細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用，從而增強(qiáng)不結(jié)球白菜的抗寒能力。此外，CBF基因還可能調(diào)控其他一系列下游基因的表達(dá)，這些基因參與滲透調(diào)節(jié)、抗氧化防御、細(xì)胞膜穩(wěn)定性維持等多種生理生化過程。例如，在滲透調(diào)節(jié)方面，調(diào)控脯氨酸、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成和運(yùn)輸相關(guān)基因的表達(dá)；在抗氧化防御方面，調(diào)節(jié)抗氧化酶基因的表達(dá)；在細(xì)胞膜穩(wěn)定性維持方面，影響細(xì)胞膜脂合成和修飾相關(guān)基因的表達(dá)。該調(diào)控路徑模型具有以下特點(diǎn)：一是存在多條調(diào)控分支，上游多種轉(zhuǎn)錄因子對CBF基因的調(diào)控以及CBF基因?qū)ο掠伪姸喟谢虻恼{(diào)控，形成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，體現(xiàn)了不結(jié)球白菜應(yīng)對低溫脅迫調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性和多樣性。二是不同調(diào)控路徑之間可能存在相互關(guān)聯(lián)和協(xié)同作用，如ABA依賴路徑和ABA獨(dú)立路徑中的CBF基因可能通過一些中間環(huán)節(jié)相互影響，共同應(yīng)對不同的環(huán)境脅迫。構(gòu)建這一調(diào)控路徑模型具有重要意義。從理論層面來看，它為深入理解不結(jié)球白菜的抗寒分子機(jī)制提供了一個直觀且系統(tǒng)的框架，有助于進(jìn)一步探究植物在低溫脅迫下基因表達(dá)調(diào)控的內(nèi)在規(guī)律，豐富植物抗寒生物學(xué)的理論知識。在實(shí)踐應(yīng)用方面，為不結(jié)球白菜的抗寒育種提供了明確的分子靶點(diǎn)和理論依據(jù)。育種工作者可以根據(jù)該模型，通過基因編輯、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)手段，對CBF基因及其上下游調(diào)控基因進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，從而培育出抗寒能力更強(qiáng)的不結(jié)球白菜新品種，提高不結(jié)球白菜在低溫環(huán)境下的產(chǎn)量和品質(zhì)，保障蔬菜的穩(wěn)定供應(yīng)。4.4結(jié)果與討論本研究通過對不結(jié)球白菜CBF基因調(diào)控路徑的深入研究，明確了上游轉(zhuǎn)錄因子BcWRKY33對BcCBF3的激活調(diào)控作用。BcWRKY33通過與BcCBF3啟動子上的W-box元件結(jié)合，在正常生長和低溫脅迫條件下，均能顯著激活BcCBF3的轉(zhuǎn)錄，且在低溫脅迫下，兩者的協(xié)同作用更為明顯。這一發(fā)現(xiàn)與在其他植物中的研究結(jié)果具有一定的相似性。在擬南芥中，AtWRKY18、AtWRKY40和AtWRKY60等WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠參與植物對低溫脅迫的響應(yīng)，它們可能通過與CBF基因啟動子區(qū)域的順式作用元件結(jié)合，調(diào)控CBF基因的表達(dá)。這表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物CBF冷響應(yīng)通路的上游調(diào)控中可能具有保守的作用機(jī)制。對于其他潛在的上游轉(zhuǎn)錄因子，如MYB、bHLH和NAC等，雖然尚未在不結(jié)球白菜中直接驗(yàn)證它們對CBF基因的調(diào)控作用，但基于順式元件分析和相關(guān)植物的研究報(bào)道，推測它們在不結(jié)球白菜CBF基因的上游調(diào)控中也發(fā)揮著重要作用。在大白菜中，通過對MYB轉(zhuǎn)錄因子的全基因組鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)多個亞組成員可能參與低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和多脅迫應(yīng)答機(jī)制，這些成員很可能是冷相關(guān)CBF基因的上游調(diào)控因子。在蘋果中，MdMYB308L可通過與bHLH蛋白相互作用，促進(jìn)bHLH蛋白與MdCBF2啟動子的結(jié)合，從而調(diào)控蘋果的耐寒性。這說明不同轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用在調(diào)控CBF基因表達(dá)和植物抗寒過程中具有重要意義。在下游調(diào)控方面，明確了BcCBF3對BcCOR15A的調(diào)控機(jī)制。BcCBF3在低溫脅迫下，通過與BcCOR15A基因啟動子區(qū)域的CRT/DRE順式作用元件結(jié)合，激活BcCOR15A基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控不結(jié)球白菜對低溫脅迫的響應(yīng)。BcCOR15A基因編碼的產(chǎn)物在維持葉綠體穩(wěn)定性和細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用，增強(qiáng)了不結(jié)球白菜的抗寒能力。這與在擬南芥中的研究結(jié)果一致，AtCBF基因通過調(diào)控下游AtCOR15A等基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物的抗寒能力。此外，通過轉(zhuǎn)錄組分析預(yù)測了多個受CBF基因調(diào)控的下游基因，它們參與滲透調(diào)節(jié)、抗氧化防御和細(xì)胞膜穩(wěn)定性維持等多種生理生化過程，共同構(gòu)成了復(fù)雜的CBF冷響應(yīng)通路。這表明CBF基因在不結(jié)球白菜應(yīng)對低溫脅迫時，通過調(diào)控多個下游基因的表達(dá)，從多個方面協(xié)同作用，增強(qiáng)植物的抗寒能力。本研究構(gòu)建的不結(jié)球白菜CBF基因調(diào)控路徑模型，整合了上游調(diào)控因子、CBF基因和下游靶基因之間的相互作用關(guān)系，為深入理解不結(jié)球白菜的抗寒分子機(jī)制提供了重要框架。然而，該模型仍存在一定的局限性。在實(shí)際的植物抗寒過程中，調(diào)控機(jī)制可能更為復(fù)雜。一方面，除了本研究中涉及的轉(zhuǎn)錄因子外，可能還有其他未知的轉(zhuǎn)錄因子或信號分子參與CBF基因的調(diào)控。另一方面，不同調(diào)控路徑之間的相互作用和協(xié)同機(jī)制尚未完全明確。例如，ABA依賴路徑和ABA獨(dú)立路徑中的CBF基因如何相互協(xié)調(diào)，共同應(yīng)對低溫脅迫，還需要進(jìn)一步深入研究。此外，環(huán)境因素如光照、水分等可能與低溫脅迫相互作用，影響CBF基因的表達(dá)和調(diào)控路徑，但本研究尚未涉及這些方面的研究。未來的研究可以進(jìn)一步拓展和完善該調(diào)控路徑模型。利用更先進(jìn)的技術(shù)手段，如單細(xì)胞測序、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等，全面深入地研究CBF基因在不同組織、不同發(fā)育階段以及不同環(huán)境條件下的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。通過篩選和驗(yàn)證更多的上游調(diào)控因子和下游靶基因，進(jìn)一步完善CBF冷響應(yīng)通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。同時，探究不同調(diào)控路徑之間的相互作用機(jī)制，以及環(huán)境因素對CBF基因調(diào)控路徑的影響，從而更全面地揭示不結(jié)球白菜的抗寒分子機(jī)制，為不結(jié)球白菜的抗寒育種提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。五、CBF基因在不結(jié)球白菜抗寒與其他脅迫響應(yīng)中的關(guān)聯(lián)5.1小RNA測序分析為深入探究CBF基因在不結(jié)球白菜抗寒與其他脅迫響應(yīng)中的關(guān)聯(lián)，本研究采用小RNA測序技術(shù)，以感染蕪菁花葉病毒（TuMV）和健康的不結(jié)球白菜葉子為材料，開展了全面的測序分析工作。在實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備階段，精心挑選生長狀況良好且一致的不結(jié)球白菜植株，隨機(jī)分為兩組。一組接種TuMV，另一組作為健康對照，在相同的溫室環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。溫室條件設(shè)定為白天溫度22-25℃，夜間溫度18-20℃，光照時間12小時/天，相對濕度保持在60%-70%，以確保植株生長環(huán)境的一致性。在接種TuMV后的第5天，分別采集感染TuMV和健康植株的葉片組織，迅速放入液氮中冷凍，隨后保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)的小RNA提取。小RNA提取過程嚴(yán)格按照mirVanamiRNAIsolationKit試劑盒的操作說明書進(jìn)行，以確保提取的小RNA具有較高的純度和完整性。提取完成后，利用Agilent2100生物分析儀對小RNA的質(zhì)量進(jìn)行檢測，要求小RNA的完整性良好，28SrRNA與18SrRNA的亮度比值在1.5-2.0之間。同時，使用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測定小RNA的濃度和純度，確保其OD260/OD280比值在1.8-2.0之間。將質(zhì)量合格的小RNA樣品送往專業(yè)的測序公司，采用IlluminaHiSeq2500測序平臺進(jìn)行測序。測序過程中，對小RNA文庫進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，確保測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。測序完成后，得到了大量的原始測序數(shù)據(jù)。對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行一系列的預(yù)處理和分析。首先，利用Cutadapt軟件去除測序數(shù)據(jù)中的接頭序列和低質(zhì)量reads，得到高質(zhì)量的cleanreads。然后，將cleanreads與不結(jié)球白菜的參考基因組進(jìn)行比對，使用Bowtie軟件進(jìn)行比對分析，確定小RNA在基因組上的位置。通過與miRBase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，鑒定出已知的miRNA，并利用miRDeep2軟件預(yù)測新的miRNA。在預(yù)測新miRNA時，根據(jù)miRNA的前體結(jié)構(gòu)特征、成熟miRNA的表達(dá)量以及與已知miRNA的相似性等多方面因素進(jìn)行綜合判斷。經(jīng)過全面的測序分析，共挖掘出86個保守的miRNA和45個新的miRNA。在這些miRNA中，共有69個miRNA響應(yīng)TuMV侵染，其中42個miRNA表達(dá)下調(diào)，27個miRNA表達(dá)上調(diào)。這些響應(yīng)TuMV侵染的miRNA可能在不結(jié)球白菜對TuMV的防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，通過調(diào)控靶基因的表達(dá)，影響植物的免疫反應(yīng)和生理過程。5.2miRNA與CBF基因的關(guān)聯(lián)分析在對小RNA測序分析所挖掘出的miRNA中，進(jìn)一步探究它們與不結(jié)球白菜冷相關(guān)CBF基因之間的關(guān)聯(lián)。利用生物信息學(xué)方法，對69個響應(yīng)TuMV侵染的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，結(jié)果顯示，這些miRNA共有271個預(yù)測靶基因。對這些靶基因進(jìn)行功能注釋和富集分析，發(fā)現(xiàn)它們主要參與發(fā)育調(diào)控和脅迫響應(yīng)等生物學(xué)過程，這表明響應(yīng)TuMV侵染的miRNA可能通過調(diào)控這些靶基因的表達(dá)，在不結(jié)球白菜應(yīng)對TuMV侵染以及其他脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。通過對預(yù)測靶基因的進(jìn)一步篩選和分析，發(fā)現(xiàn)其中部分靶基因與CBF基因存在潛在的調(diào)控關(guān)系。為了驗(yàn)證這種潛在的調(diào)控關(guān)系，選擇了13個miRNA及其相應(yīng)的靶基因，深入探索它們在TuMV或冷脅迫下的表達(dá)模式。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了感染TuMV組、低溫脅迫組（4℃處理）和對照組，在處理后的不同時間點(diǎn)（0h、1h、3h、6h、12h、24h）采集不結(jié)球白菜葉片組織，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測miRNA和靶基因的表達(dá)量變化。結(jié)果表明，一些TuMV響應(yīng)的miRNA也被低溫誘導(dǎo)。例如，miR164在感染TuMV和低溫脅迫下，其表達(dá)量均顯著上調(diào)。在感染TuMV6h時，miR164的表達(dá)量相較于對照組增加了2倍左右；在低溫脅迫6h時，其表達(dá)量相較于對照組增加了3倍左右。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR164的預(yù)測靶基因中包含一個與CBF基因調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因。在低溫脅迫下，miR164表達(dá)量的上調(diào)與該轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)量的下調(diào)呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。在低溫處理12h時，miR164表達(dá)量達(dá)到峰值，而該轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)量降至最低，僅為對照組的0.3倍左右。這暗示著miR164可能通過靶向調(diào)控這個轉(zhuǎn)錄因子基因，間接參與CBF基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而在不結(jié)球白菜的抗寒和病原響應(yīng)機(jī)制中起到聯(lián)結(jié)作用。除了miR164外，miR398也表現(xiàn)出類似的特性。在TuMV侵染和低溫脅迫下，miR398的表達(dá)量均發(fā)生顯著變化。在低溫脅迫3h時，miR398的表達(dá)量開始顯著上調(diào)，為對照組的2.5倍左右，其預(yù)測靶基因中包含一個參與活性氧（ROS）代謝的基因。已有研究表明，ROS代謝與植物的抗寒和抗病過程密切相關(guān)。在低溫脅迫下，植物細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，而miR398可能通過調(diào)控其靶基因的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)ROS代謝，進(jìn)而影響CBF基因的表達(dá)和植物的抗寒及病原響應(yīng)。當(dāng)miR398表達(dá)量上調(diào)時，其靶基因表達(dá)量顯著下降，導(dǎo)致ROS代謝途徑發(fā)生改變，從而影響植物對低溫和TuMV侵染的響應(yīng)。這些結(jié)果表明，部分miRNA可能作為不結(jié)球白菜抗寒和病原響應(yīng)機(jī)制的聯(lián)結(jié)，通過調(diào)控與CBF基因相關(guān)的靶基因表達(dá)，參與CBF冷響應(yīng)通路的調(diào)控。它們在不同脅迫條件下的表達(dá)變化，揭示了不結(jié)球白菜在應(yīng)對低溫和病原侵染時，可能存在一種通過miRNA介導(dǎo)的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使得植物能夠整合不同的脅迫信號，協(xié)調(diào)抗寒和抗病反應(yīng)，以更好地適應(yīng)環(huán)境脅迫。5.3結(jié)果與討論本研究通過小RNA測序和miRNA與CBF基因的關(guān)聯(lián)分析，揭示了不結(jié)球白菜在應(yīng)對低溫和TuMV侵染時，可能存在通過miRNA介導(dǎo)的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解不結(jié)球白菜的抗逆機(jī)制提供了新的視角。在小RNA測序分析中，成功挖掘出大量的保守和新的miRNA，其中69個miRNA響應(yīng)TuMV侵染，這表明miRNA在不結(jié)球白菜對TuMV的防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。這些響應(yīng)TuMV侵染的miRNA的靶基因主要參與發(fā)育調(diào)控和脅迫響應(yīng)等生物學(xué)過程，說明miRNA可能通過調(diào)控這些靶基因的表達(dá)，影響不結(jié)球白菜的生長發(fā)育和對脅迫的響應(yīng)。這與前人在其他植物中的研究結(jié)果一致，如在煙草中，miRNA在對煙草花葉病毒的防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，通過調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與植物的免疫反應(yīng)。在miRNA與CBF基因的關(guān)聯(lián)分析中，發(fā)現(xiàn)部分TuMV響應(yīng)的miRNA也被低溫誘導(dǎo)，如miR164和miR398。它們可能作為不結(jié)球白菜抗寒和病原響應(yīng)機(jī)制的聯(lián)結(jié)，通過調(diào)控與CBF基因相關(guān)的靶基因表達(dá)，參與CBF冷響應(yīng)通路的調(diào)控。miR164可能通過靶向調(diào)控一個與CBF基因調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因，間接參與CBF基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這一發(fā)現(xiàn)揭示了不結(jié)球白菜在應(yīng)對不同脅迫時，可能存在一種共享的調(diào)控機(jī)制，通過miRNA的介導(dǎo)，將抗寒和抗病反應(yīng)聯(lián)系起來。在番茄中，也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，一些miRNA在低溫和病原菌侵染時都發(fā)生表達(dá)變化，通過調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與番茄對不同脅迫的響應(yīng)。這些結(jié)果表明，不結(jié)球白菜的抗寒和抗病機(jī)制并非孤立存在，而是可能通過miRNA的調(diào)控相互關(guān)聯(lián)。這一發(fā)現(xiàn)對于深入理解植物的抗逆機(jī)制具有重要意義。植物在自然環(huán)境中常常面臨多種脅迫的同時或相繼發(fā)生，而這種通過miRNA介導(dǎo)的關(guān)聯(lián)機(jī)制，使得植物能夠整合不同的脅迫信號，協(xié)調(diào)抗寒和抗病反應(yīng)，以更好地適應(yīng)復(fù)雜多變的環(huán)境。這為進(jìn)一步研究植物的抗逆性提供了新的思路和方向。然而，本研究仍存在一定的局限性。雖然發(fā)現(xiàn)了部分miRNA與CBF基因的關(guān)聯(lián)，但對于這些miRNA如何具體調(diào)控CBF基因的表達(dá)，以及它們在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的具體作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步深入研究。未來的研究可以利用基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對這些miRNA及其靶基因進(jìn)行敲除或突變，觀察不結(jié)球白菜在低溫和TuMV侵染下的表型變化和生理生化指標(biāo)的改變，從而驗(yàn)證它們在抗寒和抗病機(jī)制中的功能和作用。同時，結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、RNA免疫沉淀等技術(shù)，深入研究miRNA與靶基因之間的相互作用機(jī)制，進(jìn)一步完善不結(jié)球白菜抗寒和抗病的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。六、結(jié)論與展望6.1研究總結(jié)本研究圍繞不結(jié)球白菜冷相關(guān)CBF基因展開了全面而深入的探究，取得了一系列具有重要理論和實(shí)踐價值的研究成果。在不結(jié)球白菜冷相關(guān)CBF基因的鑒定方面，通過生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法，從不結(jié)球白菜品種“蘇州青”中成功分離和克隆出8個CBF同源基因。對這些基因的序列分析和生物信息學(xué)研究，明確了它們的結(jié)構(gòu)特征，均含有典型的AP2結(jié)構(gòu)域以及保守基序，同時揭示了其理化性質(zhì)和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。這些基因編碼的蛋白在進(jìn)化過程中具有較高的保守性，與大白菜的CBF基因親緣關(guān)系最為密切，為后續(xù)深入研究它們在不結(jié)球白菜抗寒過程中的功能提供了重要的基因資源和研究基礎(chǔ)。在CBF基因的脅迫表達(dá)模式研究中，通過設(shè)置低溫、干旱和ABA脅迫處理，利用實(shí)時定量PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，不同的CBF基因在不同脅迫條件下呈現(xiàn)出明顯不同的表達(dá)模式。BcCBF1-3基因主要參與ABA-獨(dú)立的低溫響應(yīng)路徑，在低溫脅迫下迅速被誘導(dǎo)表達(dá)，可能是不結(jié)球白菜低溫響應(yīng)的關(guān)鍵基因；而BcCBF4-6基因則參與ABA-依賴的脅迫響應(yīng)路徑，在干旱和ABA脅迫下表達(dá)顯著上調(diào)，暗示了不結(jié)球白菜在應(yīng)對低溫及其他脅迫時，其CBF冷響應(yīng)通路具有獨(dú)特的調(diào)控機(jī)制，可能存在ABA依賴路徑和ABA獨(dú)立路徑相互關(guān)聯(lián)、協(xié)同作用的情況。對于CBF基因的調(diào)控路徑研究，明確了上游轉(zhuǎn)錄因子BcWRKY33對BcCBF3的激活調(diào)控作用，BcWRKY33通過與BcCBF3啟動子上的W-box元件結(jié)合，在正常生長和低溫脅迫條件下，均能顯著激活BcCBF3的轉(zhuǎn)錄，且在低溫脅迫下，兩者的協(xié)同作用更為明顯。同時，基于順式元件分析和相關(guān)植物的研究報(bào)道，推測MYB、bHLH和NAC等其他轉(zhuǎn)錄因子在不結(jié)球白菜CBF基因的上游調(diào)控中也發(fā)揮著重要作用。在下游調(diào)控方面，明確了B