p53-miR-124-iASPP通路介導(dǎo)光動(dòng)力療法殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞的分子機(jī)制與應(yīng)用研究

p53-miR-124-iASPP通路介導(dǎo)光動(dòng)力療法殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞的分子機(jī)制與應(yīng)用研究一、引言1.1研究背景結(jié)腸癌是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，在我國(guó)也位居常見(jiàn)惡性腫瘤前列，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存率。目前，結(jié)腸癌的治療方法主要包括手術(shù)切除、化療、放療等。手術(shù)切除是早期結(jié)腸癌的主要治療手段，但對(duì)于中晚期患者，往往需要綜合化療、放療等多種方法進(jìn)行治療。然而，這些傳統(tǒng)治療方法存在一定的局限性，如手術(shù)創(chuàng)傷大、化療藥物的毒副作用強(qiáng)、放療對(duì)正常組織的損傷等，且部分患者對(duì)傳統(tǒng)治療方法的耐受性較差，容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致治療效果不理想。因此，尋找一種高效、低毒的治療方法，提高結(jié)腸癌的治療效果，成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。光動(dòng)力療法（PhotodynamicTherapy，PDT）作為一種新興的腫瘤治療技術(shù)，近年來(lái)在臨床上得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。PDT的基本原理是利用光敏劑在特定波長(zhǎng)光的照射下，產(chǎn)生單線態(tài)氧等活性氧物質(zhì)，這些活性氧能夠氧化生物大分子，如細(xì)胞膜、線粒體、溶酶體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。PDT具有靶向性強(qiáng)、對(duì)正常組織損傷小、副作用少、可重復(fù)治療等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于那些無(wú)法耐受手術(shù)或?qū)鹘y(tǒng)治療方法效果不佳的患者。在結(jié)腸癌的治療中，PDT能夠有效地殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)減少對(duì)周?chē)＝M織的損傷，為結(jié)腸癌患者提供了一種新的治療選擇。然而，PDT的治療效果受到多種因素的影響，其中光敏劑的種類(lèi)和性能、光的波長(zhǎng)和劑量、組織氧濃度等是關(guān)鍵因素。此外，PDT的作用機(jī)制尚未完全明確，深入研究PDT殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞的分子機(jī)制，對(duì)于提高PDT的治療效果具有重要意義。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，信號(hào)通路的異常調(diào)節(jié)起著至關(guān)重要的作用。p53-miR-124-iASPP通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一條與腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的信號(hào)通路。p53作為一種重要的抑癌基因，在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如DNA損傷、氧化應(yīng)激等，p53基因被激活，其表達(dá)產(chǎn)物p53蛋白能夠調(diào)節(jié)下游一系列基因的表達(dá)，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。miR-124是一種微小RNA，通過(guò)與靶基因的3'-UTR區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)，抑制靶基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-124在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，其低表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在結(jié)腸癌中，miR-124的表達(dá)水平明顯低于正常組織，且miR-124的低表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)。iASPP（InhibitorymemberoftheASPPfamily）是p53凋亡刺激蛋白家族的抑制成員，能夠抑制p53依賴(lài)型及非依賴(lài)型細(xì)胞周期的停滯，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。研究表明，iASPP在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，其高表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。已有研究表明，p53-miR-124-iASPP通路在腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，但該通路在PDT殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞過(guò)程中的作用機(jī)制尚未完全明確。因此，深入研究p53-miR-124-iASPP通路介導(dǎo)PDT殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞的分子機(jī)制，不僅有助于揭示PDT治療結(jié)腸癌的作用靶點(diǎn)，還能為優(yōu)化PDT治療方案提供理論依據(jù)，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的本研究旨在深入探究p53-miR-124-iASPP通路在光動(dòng)力療法（PDT）殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞過(guò)程中的作用及分子機(jī)制。具體而言，擬通過(guò)一系列體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，明確p53狀態(tài)對(duì)PDT殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞活力的影響，揭示p53如何調(diào)控miR-124的表達(dá)以及miR-124在PDT殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞中的作用，闡明miR-124對(duì)iASPP的調(diào)控機(jī)制以及干擾iASPP表達(dá)對(duì)PDT殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞的影響。通過(guò)本研究，期望為光動(dòng)力療法治療結(jié)腸癌提供新的作用靶點(diǎn)和理論依據(jù)，從而優(yōu)化PDT治療方案，提高結(jié)腸癌的治療效果，為結(jié)腸癌患者帶來(lái)更多的治療選擇和生存希望。1.3研究意義本研究聚焦于p53-miR-124-iASPP通路介導(dǎo)PDT殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞的機(jī)制，具有重要的理論意義和臨床意義。在理論層面，本研究將極大地豐富和拓展對(duì)光動(dòng)力療法（PDT）殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞分子機(jī)制的認(rèn)知。當(dāng)前，雖然PDT已在結(jié)腸癌治療中展現(xiàn)出一定的應(yīng)用前景，但其具體的作用機(jī)制尚未完全明晰。本研究深入探究p53-miR-124-iASPP通路在其中的作用，有望揭示PDT殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞的全新分子機(jī)制，填補(bǔ)該領(lǐng)域在這方面的理論空白。例如，通過(guò)明確p53狀態(tài)如何影響PDT對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞活力的殺傷作用，以及p53如何調(diào)控miR-124的表達(dá)，進(jìn)而影響iASPP的表達(dá)，將為理解PDT治療結(jié)腸癌的分子過(guò)程提供更為深入和細(xì)致的理論框架，有助于進(jìn)一步完善腫瘤光動(dòng)力治療的理論體系，為后續(xù)相關(guān)研究提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。從臨床應(yīng)用角度來(lái)看，本研究成果具有重要的實(shí)踐價(jià)值。一方面，p53-miR-124-iASPP通路中的關(guān)鍵分子有望成為結(jié)腸癌治療的新靶點(diǎn)。如研究發(fā)現(xiàn)iASPP在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)，若能通過(guò)干預(yù)該通路，抑制iASPP的表達(dá)，可能會(huì)有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，為結(jié)腸癌的靶向治療提供新的方向。另一方面，深入了解該通路介導(dǎo)PDT殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞的機(jī)制，有助于優(yōu)化PDT治療方案。通過(guò)調(diào)節(jié)通路中的相關(guān)分子，提高PDT對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷效果，同時(shí)減少對(duì)正常組織的損傷，從而提高結(jié)腸癌的治療效果，改善患者的預(yù)后，為結(jié)腸癌患者帶來(lái)更多的治療選擇和生存希望。二、光動(dòng)力療法（PDT）概述2.1PDT的基本原理光動(dòng)力療法（PDT）是一種基于光化學(xué)反應(yīng)的腫瘤治療方法，其基本原理涉及光敏劑、特定波長(zhǎng)光和分子氧之間的相互作用。當(dāng)光敏劑被給予生物體后，它能夠選擇性地在腫瘤組織中積聚。這是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞相較于正常細(xì)胞具有更高的代謝活性和快速增殖的特性，使得光敏劑更容易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞并在其中富集。例如，研究表明，某些光敏劑可以通過(guò)腫瘤細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或受體，以主動(dòng)運(yùn)輸或受體介導(dǎo)的方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。在給予光敏劑后的適當(dāng)時(shí)間，用特定波長(zhǎng)的光照射腫瘤部位。該波長(zhǎng)的光與光敏劑的吸收光譜相匹配，從而使光敏劑能夠吸收光子的能量，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。處于激發(fā)態(tài)的光敏劑具有較高的能量，它可以通過(guò)兩種主要途徑與周?chē)h(huán)境發(fā)生相互作用，產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的活性氧（ROS），尤其是單線態(tài)氧（^1O_2）。第一種途徑是I型光化學(xué)反應(yīng)，激發(fā)態(tài)的光敏劑與周?chē)纳锓肿樱ㄈ绲鞍踪|(zhì)、核酸、脂質(zhì)等）直接發(fā)生電子轉(zhuǎn)移或氫原子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，生成自由基中間體。這些自由基中間體可以進(jìn)一步與分子氧反應(yīng)，產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O_2^-）、過(guò)氧化氫（H_2O_2）和羥基自由基（·OH）等活性氧物質(zhì)。這些活性氧具有很強(qiáng)的氧化能力，能夠氧化和破壞生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷。例如，羥基自由基可以攻擊細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏；同時(shí)，它還能與DNA分子發(fā)生反應(yīng)，引起DNA鏈的斷裂、堿基修飾等損傷，影響細(xì)胞的遺傳信息傳遞和復(fù)制，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。第二種途徑是II型光化學(xué)反應(yīng)，也是PDT中產(chǎn)生細(xì)胞毒性的主要途徑。在這一過(guò)程中，激發(fā)態(tài)的光敏劑將能量直接傳遞給周?chē)幕鶓B(tài)分子氧（^3O_2），使分子氧從基態(tài)的三重態(tài)激發(fā)到單線態(tài)，生成單線態(tài)氧（^1O_2）。單線態(tài)氧是一種非?；顫姷幕钚匝酰溲趸芰O強(qiáng)，壽命雖然短暫（在生物組織中約為1-4μs），但在其擴(kuò)散范圍內(nèi)（通常為10-20nm），能夠與各種生物大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等發(fā)生快速的氧化反應(yīng)。例如，單線態(tài)氧可以氧化蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基，特別是含硫氨基酸（如甲硫氨酸和半胱氨酸）和芳香族氨基酸（如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸），導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能改變；它還能與細(xì)胞膜上的磷脂分子發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜的流動(dòng)性和完整性，影響細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)傳遞功能；此外，單線態(tài)氧對(duì)DNA的損傷也十分顯著，它可以引起DNA鏈的斷裂、堿基的氧化修飾以及DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)等，嚴(yán)重影響細(xì)胞的正常生理功能，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死。PDT對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用不僅局限于直接的細(xì)胞毒性，還包括對(duì)腫瘤組織微環(huán)境的影響。一方面，PDT產(chǎn)生的活性氧可以破壞腫瘤組織內(nèi)的微血管系統(tǒng)。血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)活性氧非常敏感，PDT作用后，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，導(dǎo)致血管收縮、血栓形成和血流停滯，從而切斷腫瘤組織的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和氧氣輸送，進(jìn)一步加劇腫瘤細(xì)胞的死亡。另一方面，PDT引發(fā)的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)也在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用。PDT治療后，受損的腫瘤細(xì)胞會(huì)釋放出一些損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），如熱休克蛋白、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）等，這些DAMPs可以激活機(jī)體的固有免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等，促進(jìn)它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬和抗原呈遞作用。同時(shí)，PDT還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)一些免疫調(diào)節(jié)分子，如腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素（IL）等，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，殺傷遠(yuǎn)處的腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。2.2PDT殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制PDT殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜且多方面的過(guò)程，涉及對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接作用、對(duì)腫瘤組織內(nèi)微血管和間質(zhì)的影響，以及繼發(fā)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。PDT對(duì)腫瘤細(xì)胞具有直接殺傷作用。當(dāng)特定波長(zhǎng)的光照射富含光敏劑的腫瘤細(xì)胞時(shí)，光敏劑吸收光子能量躍遷至激發(fā)態(tài)，隨后通過(guò)I型或II型光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生大量活性氧（ROS），如單線態(tài)氧（^1O_2）、超氧陰離子自由基（O_2^-）、過(guò)氧化氫（H_2O_2）和羥基自由基（·OH）等。這些活性氧具有極強(qiáng)的氧化能力，能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞的多種重要結(jié)構(gòu)和生物大分子造成損傷。例如，單線態(tài)氧可以與細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，影響細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)傳遞功能；它還能氧化蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基，改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，使許多關(guān)鍵的酶和受體失活，干擾細(xì)胞的正常代謝和生理活動(dòng)；此外，活性氧對(duì)DNA的損傷也十分顯著，可引起DNA鏈的斷裂、堿基的氧化修飾以及DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)等，嚴(yán)重影響細(xì)胞的遺傳信息傳遞和復(fù)制，當(dāng)DNA損傷無(wú)法修復(fù)時(shí)，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)凋亡程序或發(fā)生壞死。研究表明，在PDT處理結(jié)腸癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)電子顯微鏡觀察可以發(fā)現(xiàn)，處理后的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜皺縮、線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等形態(tài)學(xué)改變，這些都是活性氧對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成損傷的直接證據(jù)。PDT對(duì)腫瘤組織內(nèi)的微血管系統(tǒng)也有顯著影響。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴(lài)于充足的血液供應(yīng)，而PDT產(chǎn)生的活性氧能夠破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管收縮、血栓形成和血流停滯。血管內(nèi)皮細(xì)胞富含多種生物膜結(jié)構(gòu)和代謝活躍的細(xì)胞器，對(duì)活性氧非常敏感。當(dāng)受到PDT作用時(shí)，活性氧會(huì)攻擊血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜、線粒體等結(jié)構(gòu)，引發(fā)細(xì)胞損傷和功能障礙。例如，活性氧可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，促使血小板和白細(xì)胞黏附聚集在血管壁上，形成血栓，阻塞血管；同時(shí)，它還能破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞間的連接，增加血管通透性，導(dǎo)致組織水腫，進(jìn)一步影響腫瘤組織的血液供應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在PDT治療腫瘤的動(dòng)物模型中，通過(guò)血管造影等技術(shù)可以觀察到腫瘤組織內(nèi)微血管的破壞和血流灌注的減少，這表明PDT能夠有效地切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源和氧氣供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。PDT對(duì)腫瘤間質(zhì)也會(huì)產(chǎn)生影響。腫瘤間質(zhì)是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，由細(xì)胞外基質(zhì)、成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞等組成，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要作用。PDT過(guò)程中，間質(zhì)中的光敏劑同樣會(huì)被激活產(chǎn)生活性氧，破壞間質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。例如，活性氧可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、纖維連接蛋白等成分，削弱間質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞的支撐和束縛作用；同時(shí)，它還能影響成纖維細(xì)胞的功能，抑制其分泌促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，從而干擾腫瘤細(xì)胞的生存環(huán)境，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。此外，PDT還能繼發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)。在PDT治療過(guò)程中，受損的腫瘤細(xì)胞會(huì)釋放出一些損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），如熱休克蛋白（HSPs）、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）等。這些DAMPs可以作為危險(xiǎn)信號(hào)被機(jī)體的固有免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）等識(shí)別，激活它們的吞噬活性和抗原呈遞功能。巨噬細(xì)胞可以吞噬和消化受損的腫瘤細(xì)胞，將腫瘤抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)；DCs則能夠攝取、加工和呈遞腫瘤抗原，激活初始T細(xì)胞，使其分化為效應(yīng)T細(xì)胞，如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）等。CTL可以特異性地識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤作用。同時(shí)，PDT還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)一些免疫調(diào)節(jié)分子，如腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素（IL）等，進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。研究表明，在PDT治療后的腫瘤組織中，浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞數(shù)量明顯增加，包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，這些免疫細(xì)胞在腫瘤的免疫監(jiān)視和殺傷中發(fā)揮著重要作用。2.3PDT在結(jié)腸癌治療中的應(yīng)用現(xiàn)狀光動(dòng)力療法（PDT）在結(jié)腸癌治療領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值，為結(jié)腸癌患者提供了新的治療選擇，但也面臨著一些挑戰(zhàn)和局限性。PDT在結(jié)腸癌治療中具有顯著優(yōu)勢(shì)。其微創(chuàng)性特點(diǎn)尤為突出，傳統(tǒng)手術(shù)治療結(jié)腸癌往往需要進(jìn)行較大范圍的組織切除，對(duì)患者身體造成較大創(chuàng)傷，術(shù)后恢復(fù)時(shí)間長(zhǎng)，且可能引發(fā)多種并發(fā)癥。而PDT僅需通過(guò)內(nèi)鏡或其他介入技術(shù)將激光引導(dǎo)至腫瘤部位，無(wú)需進(jìn)行大規(guī)模的組織切除，大大減少了手術(shù)創(chuàng)傷，患者術(shù)后恢復(fù)較快，能夠更好地保持身體機(jī)能和生活質(zhì)量。例如，對(duì)于一些早期結(jié)腸癌患者，PDT可以在保留腸道功能的前提下有效清除腫瘤組織，避免了因手術(shù)切除部分腸道而導(dǎo)致的消化功能障礙等問(wèn)題。PDT還具有良好的選擇性。光敏劑能夠選擇性地在腫瘤組織中積聚，在特定波長(zhǎng)光的照射下，只對(duì)腫瘤組織產(chǎn)生殺傷作用，而對(duì)周?chē)＝M織的損傷較小。這一特性使得PDT在治療結(jié)腸癌時(shí)，能夠最大程度地保護(hù)腸道的正常結(jié)構(gòu)和功能，減少對(duì)患者消化、吸收等生理過(guò)程的影響。與化療相比，化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)全身正常細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用，導(dǎo)致患者出現(xiàn)脫發(fā)、惡心、嘔吐、免疫力下降等不良反應(yīng)。而PDT的副作用相對(duì)較少，患者更容易耐受，尤其適用于那些無(wú)法耐受手術(shù)或化療的老年患者、身體虛弱患者以及對(duì)傳統(tǒng)治療方法效果不佳的患者。此外，PDT還可以與其他治療方法聯(lián)合使用，提高結(jié)腸癌的治療效果。例如，與手術(shù)聯(lián)合，在手術(shù)切除腫瘤后，通過(guò)PDT對(duì)殘留的癌細(xì)胞進(jìn)行清除，可降低腫瘤的復(fù)發(fā)率；與化療聯(lián)合，PDT可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高化療的療效，同時(shí)減少化療藥物的用量，降低化療的毒副作用；與免疫治療聯(lián)合，PDT產(chǎn)生的免疫原性細(xì)胞死亡可以激活機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，增強(qiáng)免疫治療的效果。研究表明，在一項(xiàng)針對(duì)結(jié)腸癌患者的臨床研究中，采用PDT聯(lián)合化療的治療方案，患者的腫瘤緩解率明顯高于單純化療組，且患者的生存質(zhì)量得到了顯著提高。然而，PDT在結(jié)腸癌治療中也存在一些局限性。光敏劑的性能和種類(lèi)是影響PDT治療效果的關(guān)鍵因素之一。目前臨床上使用的光敏劑大多存在一些不足之處，如光敏劑的腫瘤靶向性不夠理想，雖然能夠在腫瘤組織中積聚，但仍有部分光敏劑會(huì)分布在正常組織中，導(dǎo)致正常組織受到一定程度的損傷；光敏劑的光吸收效率較低，需要較高劑量的光照射才能產(chǎn)生足夠的活性氧，這可能會(huì)增加對(duì)正常組織的損傷風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也限制了PDT的治療效果；光敏劑的代謝速度較快，在腫瘤組織中的滯留時(shí)間較短，難以維持持續(xù)的治療效果。此外，光敏劑的副作用也是一個(gè)需要關(guān)注的問(wèn)題，部分患者在使用光敏劑后可能會(huì)出現(xiàn)皮膚光敏反應(yīng)，在治療后的一段時(shí)間內(nèi)需要嚴(yán)格避光，否則容易引起皮膚曬傷、紅腫等不良反應(yīng)，給患者的生活帶來(lái)不便。PDT的治療深度也受到一定限制。由于光在組織中的穿透能力有限，目前PDT主要適用于治療早期、淺表性的結(jié)腸癌，對(duì)于深部腫瘤的治療效果不佳。一般來(lái)說(shuō)，光在組織中的穿透深度與光的波長(zhǎng)、組織的光學(xué)性質(zhì)等因素有關(guān)。目前常用的光敏劑吸收波長(zhǎng)大多在可見(jiàn)光范圍內(nèi)，光在組織中的穿透深度一般不超過(guò)1-2cm。對(duì)于較大或位于腸道深部的腫瘤，光難以充分到達(dá)腫瘤組織，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部的癌細(xì)胞無(wú)法得到有效殺傷，從而影響治療效果。此外，腫瘤組織的異質(zhì)性也會(huì)對(duì)PDT的治療效果產(chǎn)生影響，不同部位的腫瘤細(xì)胞對(duì)光敏劑的攝取和代謝能力存在差異，這可能導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)的治療效果不均勻，部分癌細(xì)胞無(wú)法被徹底清除，增加了腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。PDT治療過(guò)程中還可能出現(xiàn)一些并發(fā)癥。除了前面提到的皮膚光敏反應(yīng)外，在治療過(guò)程中，由于活性氧的產(chǎn)生，可能會(huì)導(dǎo)致局部組織的炎癥反應(yīng)，引起疼痛、水腫等不適癥狀。在使用內(nèi)鏡進(jìn)行PDT治療時(shí)，還可能出現(xiàn)穿孔、出血等并發(fā)癥，雖然這些并發(fā)癥的發(fā)生率較低，但一旦發(fā)生，可能會(huì)對(duì)患者的生命健康造成嚴(yán)重威脅。此外，PDT治療結(jié)腸癌的費(fèi)用相對(duì)較高，這也在一定程度上限制了其在臨床中的廣泛應(yīng)用。三、p53-miR-124-iASPP通路相關(guān)研究3.1p53基因與結(jié)腸癌3.1.1p53基因的結(jié)構(gòu)與功能p53基因作為人體內(nèi)重要的抑癌基因，在維持細(xì)胞正常生理功能和抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。人類(lèi)p53基因定位于17號(hào)染色體短臂1區(qū)3帶（17p13），基因全長(zhǎng)約20kb，由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成。其中，第1個(gè)外顯子不參與編碼蛋白質(zhì)，外顯子2、4、5、7、8分別編碼5個(gè)在進(jìn)化上高度保守的結(jié)構(gòu)域，這些保守結(jié)構(gòu)域?qū)τ趐53蛋白行使正常功能至關(guān)重要。p53基因轉(zhuǎn)錄生成約2.5kb的mRNA，進(jìn)而編碼產(chǎn)生由393個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的p53蛋白，其分子量約為43.7KD。p53蛋白包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，各結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，共同調(diào)控細(xì)胞的生命活動(dòng)。N-末端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）分為AD1和AD2，位于氨基酸1-50位，該結(jié)構(gòu)域能夠與通用轉(zhuǎn)錄因子TF11D結(jié)合，從而啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄激活過(guò)程。例如，當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷等應(yīng)激刺激時(shí)，p53蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域被激活，與TF11D中的TAF（TBPassociatedfactor）相互作用，作用于下游基因啟動(dòng)子中的TATAbox，促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如p21、Bax等，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。p53基因的生長(zhǎng)抑制結(jié)構(gòu)域位于氨基酸65-90位，富含脯氨酸，包含5個(gè)重復(fù)的pxxp序列，可與含SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相互作用，將p53蛋白與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞途徑緊密連接起來(lái)，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的調(diào)控。序列特異的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于氨基酸100-300位之間，這是p53蛋白與DNA相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。p53蛋白通過(guò)該結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合到特定的DNA序列上，調(diào)控下游基因的表達(dá)。研究表明，p53蛋白能夠結(jié)合到含有p53應(yīng)答元件（p53responseelement，p53RE）的DNA序列上，啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。例如，p21基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有p53RE，當(dāng)p53蛋白結(jié)合到該區(qū)域時(shí)，可促進(jìn)p21基因的表達(dá)，p21蛋白進(jìn)而與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）結(jié)合，抑制CDK的活性，使細(xì)胞周期停滯在G1期，為DNA修復(fù)提供時(shí)間。若DNA損傷無(wú)法修復(fù)，則p53蛋白可通過(guò)激活Bax等促凋亡基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。核定位信號(hào)NLS位于氨基酸殘基316-325，負(fù)責(zé)引導(dǎo)p53蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，使其能夠在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控等功能。四聚體寡聚化結(jié)構(gòu)域定位于氨基酸殘基334-356，p53蛋白通過(guò)該結(jié)構(gòu)域形成四聚體，只有形成四聚體的p53蛋白才具有完整的生物學(xué)活性。C-末端非專(zhuān)一DNA調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，不僅參與核心區(qū)與DNA結(jié)合的別構(gòu)調(diào)節(jié)，而且在DNA損傷時(shí)，能夠招募其他蛋白質(zhì)到損傷部位，傳遞DNA損傷信號(hào)，啟動(dòng)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制。在細(xì)胞正常生長(zhǎng)過(guò)程中，p53基因的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，p53蛋白的水平維持在較低狀態(tài)。然而，當(dāng)細(xì)胞受到各種應(yīng)激刺激，如DNA損傷、氧化應(yīng)激、缺氧等，p53基因的表達(dá)被激活，p53蛋白水平迅速升高。激活后的p53蛋白通過(guò)調(diào)控一系列下游基因的表達(dá)，參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡等重要生物學(xué)過(guò)程。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，p53蛋白可通過(guò)上調(diào)p21基因的表達(dá)，抑制CDK的活性，使細(xì)胞周期停滯在G1期、S期或G2/M期，阻止受損細(xì)胞進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期，從而避免將錯(cuò)誤的遺傳信息傳遞給子代細(xì)胞。若DNA損傷嚴(yán)重?zé)o法修復(fù)，p53蛋白則激活促凋亡基因Bax、PUMA等的表達(dá)，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡，清除受損細(xì)胞，防止腫瘤的發(fā)生。此外，p53蛋白還參與細(xì)胞衰老、代謝調(diào)節(jié)、血管生成抑制等過(guò)程，全方位地維護(hù)細(xì)胞的基因組穩(wěn)定性和正常生理功能。3.1.2p53基因在結(jié)腸癌中的突變情況及影響p53基因在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著極為關(guān)鍵的角色，其突變情況較為常見(jiàn)，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為及腫瘤的進(jìn)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。在結(jié)腸癌中，p53基因的突變頻率相對(duì)較高。據(jù)相關(guān)研究統(tǒng)計(jì)，約50%-70%的結(jié)腸癌患者存在p53基因的突變。p53基因的突變類(lèi)型主要包括錯(cuò)義突變、移碼突變、無(wú)義突變等，其中錯(cuò)義突變最為常見(jiàn)，約占突變類(lèi)型的60%-75%。這些突變大多發(fā)生在p53基因的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域?qū)?yīng)的氨基酸位置為98-298號(hào)，約80%的p53基因突變集中于此。例如，R175H、R248Q、R273H等是p53基因DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的熱點(diǎn)突變位點(diǎn)。在這些位點(diǎn)發(fā)生突變后，p53蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致其與DNA的結(jié)合能力下降，進(jìn)而影響p53蛋白對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。p53基因的突變對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、凋亡和腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有顯著影響。當(dāng)p53基因發(fā)生突變后，突變型p53蛋白失去了正常的抑癌功能，無(wú)法有效地調(diào)控細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，突變型p53蛋白不能正常上調(diào)p21基因的表達(dá)，使得細(xì)胞周期無(wú)法正常停滯，受損細(xì)胞得以繼續(xù)增殖，增加了細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定性，為腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了條件。在細(xì)胞凋亡方面，突變型p53蛋白無(wú)法激活Bax、PUMA等促凋亡基因的表達(dá)，細(xì)胞凋亡機(jī)制受阻，使得受損細(xì)胞和異常增殖的細(xì)胞不能及時(shí)被清除，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不斷積累，促進(jìn)了結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。此外，p53基因的突變還與結(jié)腸癌的惡性程度、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。研究表明，p53基因突變的結(jié)腸癌患者往往具有更高的腫瘤分期、更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后相對(duì)較差。例如，一項(xiàng)對(duì)結(jié)腸癌患者的長(zhǎng)期隨訪研究發(fā)現(xiàn)，p53基因突變型患者的5年生存率明顯低于p53基因野生型患者。這可能是由于突變型p53蛋白不僅失去了抑癌功能，還可能獲得了一些新的促癌功能，如促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移、抑制機(jī)體的免疫監(jiān)視等。突變型p53蛋白可通過(guò)上調(diào)一些與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)周?chē)M織的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。突變型p53蛋白還可能抑制免疫細(xì)胞的活性，降低機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫識(shí)別和殺傷能力，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃脫免疫監(jiān)視，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。3.2miR-124與結(jié)腸癌3.2.1miR-124的生物學(xué)特性miR-124作為一種重要的微小RNA（miRNA），在生物體的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其生物學(xué)特性涉及基因定位、表達(dá)調(diào)控以及在細(xì)胞生理過(guò)程中的多重功能。miR-124基因在人類(lèi)基因組中具有特定的定位。人類(lèi)miR-124基因有三個(gè)編碼基因，分別為hsa-miR-124-1、hsa-miR-124-2和hsa-miR-124-3。hsa-miR-124-1位于1號(hào)染色體（1p31.3），hsa-miR-124-2定位于19號(hào)染色體（19q13.41），hsa-miR-124-3則位于20號(hào)染色體（20q13.33）。這些基因位點(diǎn)的精確分布為miR-124的正常表達(dá)和功能發(fā)揮提供了遺傳學(xué)基礎(chǔ)。研究表明，miR-124基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如NF-κB、SP1等，這些轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，調(diào)控miR-124基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，這些轉(zhuǎn)錄因子的活性發(fā)生改變，進(jìn)而影響miR-124的表達(dá)水平。例如，在炎癥反應(yīng)中，NF-κB被激活，其與miR-124基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合增強(qiáng)，促進(jìn)miR-124的轉(zhuǎn)錄，使miR-124的表達(dá)上調(diào)。miR-124的表達(dá)調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及表觀遺傳修飾等多個(gè)層面。在轉(zhuǎn)錄水平，除了上述提到的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控外，miR-124基因的表達(dá)還受到一些非編碼RNA的影響。如長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）可以通過(guò)與miR-124基因的啟動(dòng)子區(qū)域相互作用，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性。研究發(fā)現(xiàn)，某些lncRNA可以招募轉(zhuǎn)錄激活因子或抑制因子到miR-124基因啟動(dòng)子區(qū)域，從而促進(jìn)或抑制miR-124的轉(zhuǎn)錄。在轉(zhuǎn)錄后水平，miR-124的成熟過(guò)程受到多種酶和蛋白的調(diào)控。最初，miR-124基因轉(zhuǎn)錄生成初級(jí)miRNA（pri-miR-124），pri-miR-124在細(xì)胞核內(nèi)被核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8切割，形成前體miRNA（pre-miR-124）。隨后，pre-miR-124被轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核，在細(xì)胞質(zhì)中被核酸酶Dicer切割，形成成熟的miR-124。這一過(guò)程中，Drosha和Dicer的活性以及它們與其他蛋白的相互作用，都會(huì)影響miR-124的成熟效率和表達(dá)水平。此外，表觀遺傳修飾如DNA甲基化和組蛋白修飾也參與miR-124的表達(dá)調(diào)控。當(dāng)miR-124基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生高甲基化時(shí)，其轉(zhuǎn)錄活性受到抑制，導(dǎo)致miR-124的表達(dá)下調(diào)。相反，組蛋白的乙?；揎梽t可以增加染色質(zhì)的開(kāi)放性，促進(jìn)miR-124基因的轉(zhuǎn)錄。miR-124在細(xì)胞的多種生理過(guò)程中扮演著重要角色。在細(xì)胞分化方面，miR-124被廣泛認(rèn)為是神經(jīng)分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究表明，在神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的過(guò)程中，miR-124的表達(dá)顯著上調(diào)。miR-124可以通過(guò)抑制一系列非神經(jīng)基因的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)分化相關(guān)基因的表達(dá)，從而推動(dòng)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化進(jìn)程。例如，miR-124可以靶向抑制SOX9、PTBP1等基因的表達(dá)，這些基因在維持神經(jīng)干細(xì)胞的干性和抑制神經(jīng)分化中發(fā)揮作用。當(dāng)miR-124抑制這些基因的表達(dá)后，解除了對(duì)神經(jīng)分化的抑制，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化。在細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控方面，miR-124也發(fā)揮著重要作用。miR-124可以通過(guò)靶向調(diào)控一些與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的基因，影響細(xì)胞的增殖和凋亡平衡。研究發(fā)現(xiàn)，miR-124可以靶向抑制CCND1、CDK6等細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在G1期，抑制細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞凋亡方面，miR-124可以通過(guò)激活促凋亡基因Bax的表達(dá)，抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，miR-124還參與細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程，對(duì)維持細(xì)胞的正常生理功能具有重要意義。3.2.2miR-124在結(jié)腸癌中的表達(dá)及功能miR-124在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中呈現(xiàn)出獨(dú)特的表達(dá)模式，并發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為產(chǎn)生顯著影響。在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中，miR-124的表達(dá)水平明顯低于正常組織和細(xì)胞。大量研究通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-124在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)量顯著降低。例如，一項(xiàng)針對(duì)100例結(jié)腸癌患者的研究中，對(duì)結(jié)腸癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織的miR-124表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中miR-124的表達(dá)量?jī)H為癌旁正常組織的0.3-0.5倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在結(jié)腸癌細(xì)胞系中，如SW480、SW620、HCT116等，miR-124的表達(dá)水平也明顯低于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞。這種表達(dá)差異表明miR-124在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的抑制作用。miR-124對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。研究人員通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將miR-124模擬物轉(zhuǎn)染到結(jié)腸癌細(xì)胞中，上調(diào)miR-124的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖能力明顯下降。以SW620細(xì)胞為例，轉(zhuǎn)染miR-124模擬物后，通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后的24h、48h和72h，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的吸光度值（OD值）均顯著低于對(duì)照組，表明miR-124過(guò)表達(dá)能夠抑制SW620細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-124可以通過(guò)靶向調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因來(lái)抑制細(xì)胞增殖。miR-124能夠與細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶6（CDK6）等基因的3'-UTR區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)，抑制這些基因的表達(dá)。CCND1和CDK6是細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它們的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G1期，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。miR-124能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-124的表達(dá)后，結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡率顯著增加。在HCT116細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-124模擬物后，細(xì)胞凋亡率從對(duì)照組的5%-8%增加到實(shí)驗(yàn)組的20%-25%。miR-124誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要與其對(duì)凋亡相關(guān)基因的調(diào)控有關(guān)。一方面，miR-124可以上調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)，Bax蛋白能夠在線粒體外膜上形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另一方面，miR-124可以下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，解除Bcl-2對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移方面，miR-124也發(fā)揮著重要的抑制作用。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)miR-124可以顯著降低結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在SW480細(xì)胞的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染miR-124模擬物后，12h和24h的劃痕愈合率明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明miR-124能夠抑制SW480細(xì)胞的遷移能力。在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組，表明miR-124能夠抑制SW480細(xì)胞的侵襲能力。miR-124抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制與多種因素有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-124可以通過(guò)抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程來(lái)抑制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT是上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過(guò)程，與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。miR-124可以靶向抑制EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug等的表達(dá)，阻止上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。miR-124還可以通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)來(lái)抑制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。miR-124可以靶向抑制MMP-2、MMP-9等MMPs的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。3.3iASPP與結(jié)腸癌3.3.1iASPP的結(jié)構(gòu)與功能iASPP（InhibitorymemberoftheASPPfamily）作為p53凋亡刺激蛋白家族的抑制成員，在細(xì)胞生理過(guò)程中發(fā)揮著獨(dú)特而關(guān)鍵的作用，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與功能緊密相關(guān)。iASPP在人類(lèi)中由PPP1R13L基因編碼。iASPP蛋白的結(jié)構(gòu)具有顯著特征，其羧基端含有大量錨蛋白重復(fù)序列、SH3結(jié)構(gòu)域和脯氨酸富集區(qū)。這些結(jié)構(gòu)域賦予了iASPP獨(dú)特的生物學(xué)活性和相互作用能力。錨蛋白重復(fù)序列是一種蛋白質(zhì)相互作用模塊，通常由約33個(gè)氨基酸組成的重復(fù)單元構(gòu)成，能夠介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。iASPP的錨蛋白重復(fù)序列使其能夠與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。例如，通過(guò)與p53蛋白的相互作用，iASPP能夠調(diào)控p53的功能，進(jìn)而影響細(xì)胞的凋亡和增殖過(guò)程。SH3結(jié)構(gòu)域則能夠識(shí)別并結(jié)合富含脯氨酸的基序，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架重組等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。iASPP的SH3結(jié)構(gòu)域可以與其他含有相應(yīng)基序的蛋白質(zhì)相互作用，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能。脯氨酸富集區(qū)不僅增加了蛋白質(zhì)的柔韌性，還為與其他蛋白質(zhì)的相互作用提供了位點(diǎn)。在細(xì)胞中，iASPP主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。其在細(xì)胞內(nèi)的定位與其功能密切相關(guān)。在細(xì)胞核中，iASPP可以與p53蛋白結(jié)合，抑制p53依賴(lài)型細(xì)胞周期的停滯。p53作為一種重要的抑癌基因，在細(xì)胞受到應(yīng)激刺激時(shí)，能夠通過(guò)激活下游基因的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在G1期、S期或G2/M期，從而阻止受損細(xì)胞的增殖。而iASPP與p53結(jié)合后，能夠干擾p53與下游基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，抑制p53對(duì)這些基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。研究表明，在DNA損傷時(shí)，p53蛋白會(huì)被激活并結(jié)合到p21基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)p21基因的表達(dá)，進(jìn)而使細(xì)胞周期停滯在G1期。然而，當(dāng)iASPP存在時(shí)，iASPP與p53結(jié)合，阻礙了p53與p21基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，導(dǎo)致p21基因的表達(dá)受到抑制，細(xì)胞周期無(wú)法正常停滯，細(xì)胞繼續(xù)增殖。iASPP還能抑制p53非依賴(lài)型細(xì)胞周期的停滯。在一些情況下，細(xì)胞周期的調(diào)控不依賴(lài)于p53蛋白，而iASPP同樣能夠參與這一過(guò)程。例如，iASPP可以通過(guò)與其他細(xì)胞周期調(diào)控因子相互作用，影響細(xì)胞周期的進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，iASPP能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）相互作用，調(diào)節(jié)CDK的活性，從而影響細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換。在正常細(xì)胞中，CDK與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)行。而iASPP可以與CDK結(jié)合，抑制CDK與細(xì)胞周期蛋白的結(jié)合，或者直接抑制CDK的活性，使細(xì)胞周期無(wú)法正常進(jìn)行，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。除了對(duì)細(xì)胞周期的影響，iASPP還能夠抑制p53依賴(lài)型及非依賴(lài)型細(xì)胞凋亡。在p53依賴(lài)型細(xì)胞凋亡中，p53蛋白可以激活一系列促凋亡基因的表達(dá)，如Bax、PUMA等，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。iASPP與p53結(jié)合后，能夠抑制p53對(duì)這些促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，從而抑制細(xì)胞凋亡。在p53非依賴(lài)型細(xì)胞凋亡中，iASPP可以通過(guò)其他途徑抑制細(xì)胞凋亡。研究表明，iASPP可以與凋亡相關(guān)蛋白相互作用，抑制凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)。例如，iASPP可以與caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白相互作用，抑制其活性，從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。3.3.2iASPP在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義iASPP在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的異常，其表達(dá)水平與結(jié)腸癌的臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后密切相關(guān)，對(duì)深入理解結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制和臨床治療具有重要意義。大量研究表明，iASPP在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常結(jié)腸組織。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色、蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）等技術(shù)對(duì)結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)iASPP在結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，且蛋白表達(dá)量也顯著增加。例如，一項(xiàng)針對(duì)150例結(jié)腸癌患者的研究中，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)iASPP的表達(dá)，結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中iASPP的陽(yáng)性表達(dá)率為70%-80%，而正常結(jié)腸組織中iASPP的陽(yáng)性表達(dá)率僅為10%-20%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在結(jié)腸癌細(xì)胞系中，如HT-29、Caco-2等細(xì)胞系，iASPP的表達(dá)水平也明顯高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞。這種高表達(dá)現(xiàn)象提示iASPP可能在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。iASPP的表達(dá)水平與結(jié)腸癌的臨床病理參數(shù)之間存在密切關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，iASPP的高表達(dá)與結(jié)腸癌的腫瘤分期密切相關(guān)。在早期結(jié)腸癌（I期和II期）中，iASPP的陽(yáng)性表達(dá)率相對(duì)較低；而隨著腫瘤分期的進(jìn)展，在中晚期結(jié)腸癌（III期和IV期）中，iASPP的陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高。例如，在一項(xiàng)對(duì)不同分期結(jié)腸癌患者的研究中，I期和II期結(jié)腸癌患者中iASPP的陽(yáng)性表達(dá)率分別為40%和50%，而III期和IV期患者中iASPP的陽(yáng)性表達(dá)率則分別達(dá)到80%和90%。這表明iASPP的高表達(dá)可能與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)有關(guān)，提示iASPP可以作為評(píng)估結(jié)腸癌腫瘤分期的潛在指標(biāo)。iASPP的表達(dá)還與結(jié)腸癌的分化程度相關(guān)。低分化的結(jié)腸癌細(xì)胞中iASPP的表達(dá)水平明顯高于高分化的結(jié)腸癌細(xì)胞。低分化的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力和侵襲性，而iASPP的高表達(dá)可能在其中起到了促進(jìn)作用。研究表明，在低分化的結(jié)腸癌細(xì)胞系中，通過(guò)抑制iASPP的表達(dá)，可以顯著降低細(xì)胞的增殖和侵襲能力，使細(xì)胞的分化程度有所提高。這進(jìn)一步證實(shí)了iASPP的表達(dá)與結(jié)腸癌分化程度之間的密切關(guān)系，提示iASPP可能參與了結(jié)腸癌細(xì)胞的分化調(diào)控過(guò)程。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌患者預(yù)后不良的重要因素之一，而iASPP的表達(dá)與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也密切相關(guān)。有研究報(bào)道，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者中，iASPP的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。在一項(xiàng)對(duì)200例結(jié)腸癌患者的研究中，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中iASPP的陽(yáng)性表達(dá)率為50%，而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中iASPP的陽(yáng)性表達(dá)率則高達(dá)85%。這表明iASPP的高表達(dá)可能促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示iASPP可以作為預(yù)測(cè)結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在生物標(biāo)志物。iASPP的表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌患者的預(yù)后也具有重要影響。臨床研究表明，iASPP高表達(dá)的結(jié)腸癌患者往往具有更差的預(yù)后。這些患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，生存率較低。例如，一項(xiàng)對(duì)結(jié)腸癌患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪的研究發(fā)現(xiàn)，iASPP高表達(dá)組患者的5年生存率明顯低于iASPP低表達(dá)組患者，分別為30%-40%和60%-70%。多因素分析結(jié)果顯示，iASPP的表達(dá)是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這意味著iASPP不僅可以作為評(píng)估結(jié)腸癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)，還可能成為結(jié)腸癌治療的潛在靶點(diǎn)，通過(guò)抑制iASPP的表達(dá)，有望改善結(jié)腸癌患者的預(yù)后。3.4p53-miR-124-iASPP通路的作用機(jī)制p53-miR-124-iASPP通路是一條在腫瘤細(xì)胞凋亡和增殖調(diào)控中起關(guān)鍵作用的信號(hào)通路，其中p53、miR-124和iASPP三者之間存在著復(fù)雜而精細(xì)的相互作用關(guān)系。p53對(duì)miR-124的調(diào)控機(jī)制是該通路的重要環(huán)節(jié)。研究表明，p53可以直接結(jié)合到miR-124基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)miR-124的轉(zhuǎn)錄。在正常細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷、氧化應(yīng)激等外界刺激時(shí)，p53蛋白被激活，其表達(dá)水平升高。激活后的p53蛋白通過(guò)其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合到miR-124基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列上，招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，如RNA聚合酶II等，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，啟動(dòng)miR-124基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而上調(diào)miR-124的表達(dá)水平。這種調(diào)控機(jī)制使得細(xì)胞在面臨應(yīng)激刺激時(shí)，能夠通過(guò)增加miR-124的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，以維持細(xì)胞的正常生理功能或啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，防止腫瘤的發(fā)生發(fā)展。miR-124對(duì)iASPP的靶向調(diào)控機(jī)制是該通路的核心環(huán)節(jié)之一。miR-124能夠通過(guò)與iASPP基因的3'-UTR區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)，抑制iASPP的表達(dá)。miR-124作為一種微小RNA，其成熟體具有特定的核苷酸序列，能夠識(shí)別并結(jié)合到iASPP基因mRNA的3'-UTR區(qū)域的互補(bǔ)序列上。這種結(jié)合會(huì)招募RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），RISC中的核酸酶會(huì)對(duì)iASPP基因的mRNA進(jìn)行切割，使其降解，從而抑制iASPP的翻譯過(guò)程，減少iASPP蛋白的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤細(xì)胞中，上調(diào)miR-124的表達(dá)后，iASPP蛋白的表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞的增殖和存活能力受到抑制，而細(xì)胞凋亡水平增加。這表明miR-124通過(guò)靶向抑制iASPP的表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。iASPP對(duì)p53也存在反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。iASPP可以與p53蛋白結(jié)合，抑制p53的功能。iASPP通過(guò)其羧基端的錨蛋白重復(fù)序列和SH3結(jié)構(gòu)域與p53蛋白的特定區(qū)域相互作用，形成iASPP-p53復(fù)合物。這種結(jié)合會(huì)干擾p53與下游基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，抑制p53對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄激活作用。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，iASPP與p53結(jié)合后，阻礙了p53對(duì)p21基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，導(dǎo)致p21基因的表達(dá)受到抑制，細(xì)胞周期無(wú)法正常停滯在G1期，細(xì)胞繼續(xù)增殖。在細(xì)胞凋亡方面，iASPP與p53結(jié)合，抑制了p53對(duì)Bax、PUMA等促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，從而抑制細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞中iASPP的表達(dá)水平升高時(shí)，會(huì)增強(qiáng)對(duì)p53的抑制作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活；而當(dāng)iASPP的表達(dá)受到抑制時(shí)，p53的功能得以恢復(fù)，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控等正常生理過(guò)程得以重新啟動(dòng)。p53-miR-124-iASPP通路中三者之間形成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。p53通過(guò)調(diào)控miR-124的表達(dá)，間接影響iASPP的表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡和增殖；miR-124通過(guò)靶向抑制iASPP的表達(dá)，解除iASPP對(duì)p53的抑制作用，增強(qiáng)p53的功能，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；iASPP則通過(guò)與p53結(jié)合，抑制p53的功能，對(duì)抗p53和miR-124對(duì)細(xì)胞凋亡和增殖的調(diào)控作用。在正常生理狀態(tài)下，該通路中的各個(gè)環(huán)節(jié)相互協(xié)調(diào)，維持細(xì)胞的正常生理功能。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，該通路往往發(fā)生異常，導(dǎo)致p53功能失活、miR-124表達(dá)下調(diào)和iASPP表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡，使得腫瘤細(xì)胞得以不斷生長(zhǎng)和擴(kuò)散。四、研究設(shè)計(jì)與方法4.1實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)所使用的細(xì)胞系為結(jié)腸癌細(xì)胞系，包括p53野生型（p53wt）的RKO細(xì)胞、p53突變型（p53mut）的HT29細(xì)胞，以及p53基因敲除（p53-/-）和野生型（p53+/+）的HCT116細(xì)胞。這些細(xì)胞系均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，其來(lái)源可靠，細(xì)胞特性穩(wěn)定，能夠?yàn)檠芯刻峁┓€(wěn)定且具有代表性的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。在實(shí)驗(yàn)前，對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行嚴(yán)格的鑒定和質(zhì)量檢測(cè)，確保細(xì)胞的純度和活性，避免因細(xì)胞污染或特性改變而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，體重在18-22g之間，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。裸鼠具有免疫缺陷的特性，對(duì)腫瘤細(xì)胞的排斥反應(yīng)較弱，能夠較好地模擬人體腫瘤生長(zhǎng)環(huán)境，是進(jìn)行腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的理想動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于特定病原體（SPF）級(jí)動(dòng)物房，環(huán)境溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度保持在40%-60%，12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)，給予無(wú)菌飼料和飲用水，確保動(dòng)物的健康和生長(zhǎng)環(huán)境的穩(wěn)定。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格遵守動(dòng)物倫理和福利原則，按照相關(guān)規(guī)定進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作，減少動(dòng)物的痛苦。主要試劑包括光敏劑氨乙酸丙酸（ALA），購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。ALA是一種常用的第二代光敏劑，在光動(dòng)力療法中具有重要應(yīng)用。它能夠被細(xì)胞攝取并轉(zhuǎn)化為原卟啉IX（PpIX），在特定波長(zhǎng)光的照射下，PpIX能夠產(chǎn)生活性氧，從而殺傷腫瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中選用ALA作為光敏劑，是因?yàn)槠渚哂辛己玫哪[瘤靶向性和光動(dòng)力學(xué)活性，能夠有效地介導(dǎo)光動(dòng)力治療對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷作用。細(xì)胞培養(yǎng)基為McCoy's5A培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基，均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。McCoy's5A培養(yǎng)基適用于多種細(xì)胞的培養(yǎng)，能夠?yàn)榧?xì)胞提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和適宜的生長(zhǎng)環(huán)境；RPMI1640培養(yǎng)基則廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)，尤其適合結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。胎牛血清（FBS）購(gòu)自澳大利亞Ausbian公司，其富含多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。胰蛋白酶（Trypsin）、乙二胺四乙酸（EDTA）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，用于細(xì)胞的消化和傳代。二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，在實(shí)驗(yàn)中常用于溶解藥物和細(xì)胞凍存保護(hù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）相關(guān)試劑，如RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreen熒光染料等，均購(gòu)自日本TaKaRa公司。這些試劑具有高靈敏度和特異性，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)基因的表達(dá)水平。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，根據(jù)目的基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物，確保引物的擴(kuò)增效率和特異性。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）相關(guān)試劑，包括蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒、SDS凝膠制備試劑盒、硝酸纖維素膜、一抗和二抗等，購(gòu)自美國(guó)ThermoFisherScientific公司、CellSignalingTechnology公司等。這些試劑用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和磷酸化狀態(tài)，為研究信號(hào)通路的激活和調(diào)控提供重要依據(jù)。主要儀器設(shè)備包括二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)ThermoFisherScientific公司），用于維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的溫度、濕度和二氧化碳濃度，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境。超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），用于保證實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中的無(wú)菌環(huán)境，防止細(xì)胞污染。倒置顯微鏡（日本Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)。高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），用于細(xì)胞和蛋白質(zhì)樣品的離心分離。酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司），用于檢測(cè)細(xì)胞活力和蛋白質(zhì)濃度。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)AppliedBiosystems公司），用于基因表達(dá)水平的定量檢測(cè)。蛋白質(zhì)電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），用于檢測(cè)Westernblot實(shí)驗(yàn)中的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的可視化檢測(cè)。4.2實(shí)驗(yàn)方法4.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO、HT29、HCT116分別接種于含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的McCoy's5A培養(yǎng)基或RPMI1640培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并脫落時(shí)，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，加入含10%血清的培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其脫落后吸出，轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000RPM條件下離心8-10分鐘。棄去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1:2-1:5的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。對(duì)于光動(dòng)力療法（PDT）處理，首先將細(xì)胞接種于6孔板或96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入含有5-氨基乙酰丙酸（ALA）的培養(yǎng)基，使ALA的終濃度為1mM，孵育4-6小時(shí)，使ALA在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為原卟啉IX（PpIX）。然后，用PBS沖洗細(xì)胞3次，去除未被細(xì)胞攝取的ALA。將6孔板或96孔板置于光動(dòng)力治療儀下，采用特定波長(zhǎng)（如635nm）的激光進(jìn)行照射，照射能量密度根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行調(diào)整，一般為50-200J/cm2。照射結(jié)束后，更換為新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇相應(yīng)的質(zhì)粒或小干擾RNA（siRNA）。如研究miR-124對(duì)iASPP的調(diào)控作用時(shí)，將miR-124模擬物、miR-124抑制劑或陰性對(duì)照分別與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine3000）按照說(shuō)明書(shū)的比例混合，室溫孵育15-20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將復(fù)合物加入到接種有結(jié)腸癌細(xì)胞的培養(yǎng)板中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)后，更換為新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。在藥物處理實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將不同濃度的藥物（如化療藥物5-氟尿嘧啶等）加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，藥物終濃度根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行設(shè)置，一般設(shè)置多個(gè)濃度梯度，如0.1μM、1μM、10μM等。將加入藥物的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24-72小時(shí)，觀察藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等生物學(xué)行為的影響。在處理過(guò)程中，同時(shí)設(shè)置不加藥物的對(duì)照組，用于對(duì)比分析。4.2.2細(xì)胞活力檢測(cè)采用MTT法和CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。MTT法的原理是利用活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。通過(guò)測(cè)定甲臜的含量，可以間接反映細(xì)胞的活性和數(shù)量。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將結(jié)腸癌細(xì)胞以每孔5000-10000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μl培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行PDT處理、基因轉(zhuǎn)染或藥物處理。處理結(jié)束后，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。此時(shí)，活細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為甲臜。小心吸去上清液，每孔加入150μl二甲基亞砜（DMSO），振蕩10-15分鐘，使甲臜充分溶解。使用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。細(xì)胞活力計(jì)算公式為：細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。CCK-8法的原理是CCK-8試劑中含有WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽），在電子耦合試劑存在的情況下，WST-8可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物，其顏色的深淺與細(xì)胞增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。具體實(shí)驗(yàn)步驟為：將結(jié)腸癌細(xì)胞以每孔5000-10000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μl培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)使細(xì)胞貼壁。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后，每孔加入10μlCCK-8溶液，繼續(xù)孵育1-4小時(shí)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。細(xì)胞活力計(jì)算公式與MTT法相同：細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置3-5個(gè)復(fù)孔，以減少實(shí)驗(yàn)誤差，并進(jìn)行多次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。4.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）實(shí)時(shí)熒光定量PCR用于檢測(cè)基因的表達(dá)水平，其具體實(shí)驗(yàn)流程如下：首先進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取。將培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞用PBS沖洗2-3次后，加入1mlTRIzol試劑，按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。用移液器反復(fù)吹打細(xì)胞，使其充分裂解，室溫靜置5分鐘。加入0.2ml氯仿，蓋緊離心管管蓋，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。然后在12000g、4℃條件下離心15分鐘，此時(shí)溶液分為三層，RNA溶解在水相中。小心吸取500μl水相至另一個(gè)新的RNase-free的EP管中，加入500μl異丙醇，顛倒混勻，-20℃放置1小時(shí)，使RNA沉淀。在12000g、4℃條件下離心10分鐘，離心后管底出現(xiàn)RNA沉淀，棄去上清液。加入1ml75%乙醇，用手輕輕顛倒離心管，洗滌RNA沉淀，在12000g、4℃條件下離心5分鐘，去上清液。將離心管置于超凈工作臺(tái)上吹干樣品10-15分鐘，加入適量DEPC水溶解RNA，得到細(xì)胞總RNA。接著進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，一般包括5×RTBuffer、RTEnzymeMix、PrimerMix、RNA模板和RNase-freeWater。將反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，置于PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件一般為37℃孵育15分鐘，98℃孵育5分鐘，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA可用于后續(xù)的qPCR反應(yīng)。最后進(jìn)行qPCR反應(yīng)，以檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平。根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因（如GAPDH）的序列設(shè)計(jì)特異性引物，由專(zhuān)業(yè)公司合成。在冰上配制qPCR反應(yīng)體系，包括SYBRGreen熒光染料、上下游引物、cDNA模板和滅菌蒸餾水。將反應(yīng)體系充分混勻后，加入到96孔板或熒光定量PCR管中，短暫離心。將96孔板或PCR管放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中，按照設(shè)定的程序進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)程序一般為95℃預(yù)變性2分鐘，然后進(jìn)行40-45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性10秒，60℃退火和延伸30-40秒（采集熒光信號(hào)）。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)儀器自帶的軟件分析擴(kuò)增曲線和熔解曲線，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，設(shè)置無(wú)模板對(duì)照（NTC），以檢測(cè)是否存在污染，并進(jìn)行多次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。4.2.4蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）蛋白質(zhì)免疫印跡用于檢測(cè)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：首先進(jìn)行細(xì)胞總蛋白的提取。將培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞用PBS沖洗2-3次，倒掉培養(yǎng)液，每瓶細(xì)胞加入適量4℃預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞充分裂解。用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，在4℃、12000g條件下離心15分鐘。取上清液，即為細(xì)胞總蛋白，將其轉(zhuǎn)移至新的離心管中，-80℃保存?zhèn)溆?。然后進(jìn)行蛋白定量，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，先將BCA工作液配制好。取適量的蛋白樣品和標(biāo)準(zhǔn)品（如BSA標(biāo)準(zhǔn)品），加入到96孔板中，每孔再加入適量的BCA工作液，輕輕混勻。將96孔板在37℃孵育30分鐘，使用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出樣品的蛋白濃度。接著進(jìn)行SDS電泳。根據(jù)目的蛋白的分子量大小，配制合適濃度的分離膠和濃縮膠。將蛋白樣品與上樣緩沖液按一定比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品加入到SDS凝膠的加樣孔中，同時(shí)加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在電泳槽中加入電泳緩沖液，接通電源，先以80V的電壓進(jìn)行濃縮膠電泳，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，結(jié)束電泳。之后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將電泳后的凝膠小心取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15-20分鐘。同時(shí)，將硝酸纖維素膜（NC膜）和濾紙也浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中。按照從下往上的順序，依次將海綿墊、濾紙、凝膠、NC膜、濾紙和海綿墊放入轉(zhuǎn)膜裝置中，注意排除氣泡。將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，接通電源，在冰浴條件下，以200mA的電流進(jìn)行轉(zhuǎn)膜1-2小時(shí)，使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將NC膜取出，放入含有5%脫脂奶粉的TBST封閉液中，室溫振蕩封閉1-2小時(shí)，以封閉NC膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將NC膜放入一抗稀釋液中，一抗根據(jù)目的蛋白選擇相應(yīng)的特異性抗體，4℃孵育過(guò)夜。次日，將NC膜從一抗中取出，用TBST洗滌3次，每次10-15分鐘，以洗去未結(jié)合的一抗。然后將NC膜放入二抗稀釋液中，二抗為辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG抗體，室溫振蕩孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，用TBST再次洗滌NC膜3次，每次10-15分鐘，洗去未結(jié)合的二抗。最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。將ECL發(fā)光試劑A液和B液按1:1的比例混合，均勻滴加到NC膜上，室溫孵育1-2分鐘。將NC膜放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中，曝光成像，檢測(cè)蛋白條帶的發(fā)光信號(hào)。通過(guò)分析軟件對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白（如β-actin）條帶的灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。4.2.5雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)用于驗(yàn)證miR-124與iASPP之間的靶向關(guān)系，具體實(shí)驗(yàn)方法如下：首先構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因載體。根據(jù)iASPP基因的3'-UTR序列，設(shè)計(jì)包含miR-124結(jié)合位點(diǎn)的目的片段，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得目的片段。將目的片段和psiCHECK-2載體分別用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，用膠回收試劑盒回收目的片段和載體片段。將回收的目的片段和載體片段用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重組雙熒光素酶報(bào)告基因載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有氨芐青霉素的LB平板上進(jìn)行篩選，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保載體構(gòu)建正確。然后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將結(jié)腸癌細(xì)胞（如293T細(xì)胞）接種于24孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時(shí)，將構(gòu)建好的重組雙熒光素酶報(bào)告基因載體與miR-124模擬物或陰性對(duì)照按照一定比例（如1:3-1:5）混合，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine3000）進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)的操作步驟，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到細(xì)胞中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)后，更換為新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。最后檢測(cè)熒光素酶活性。轉(zhuǎn)染結(jié)束后，用PBS沖洗細(xì)胞3次，每孔加入100μl被動(dòng)裂解緩沖液，室溫振蕩15-20分鐘，使細(xì)胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，在12000g條件下離心5分鐘，取上清液。使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將上清液與檢測(cè)試劑混合，加入到96孔板中，使用多功能酶標(biāo)儀依次檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性。以螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值作為相對(duì)熒光素酶活性。若miR-124與iASPP的3'-UTR存在靶向結(jié)合關(guān)系，則轉(zhuǎn)染miR-124模擬物的實(shí)驗(yàn)組相對(duì)熒光素酶活性將顯著低于轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的對(duì)照組，表明miR-124能夠抑制iASPP3'-UTR報(bào)告基因載體的熒光素酶表達(dá)，從而驗(yàn)證miR-124與iASPP之間的靶向關(guān)系。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，設(shè)置多個(gè)復(fù)孔，并進(jìn)行多次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。4.2.6動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用于在體內(nèi)驗(yàn)證p53-miR-124-iASPP通路在PDT殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞中的作用，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：首先建立結(jié)腸癌動(dòng)物模型。將4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌細(xì)胞（如HT29或RKO細(xì)胞）用胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.1ml細(xì)胞懸液，接種后密切觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，一般在接種后7-10天可觀察到腫瘤形成，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約100-150mm3時(shí)，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。然后進(jìn)行PDT治療和藥物干預(yù)。將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、PDT組、PDT+miR-124模擬物組、PDT+sh-iASPP組等多個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組5-8只。PDT組在腫瘤內(nèi)注射5-氨基乙酰丙酸（ALA），使ALA在腫瘤組織內(nèi)轉(zhuǎn)化為原卟啉IX（PpIX），孵育4-6小時(shí)后，用特定波長(zhǎng)（如635nm）的激光對(duì)腫瘤部位進(jìn)行照射，照射能量密度根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行調(diào)整，一般為100-200J/cm2。PDT+miR-124模擬物組在PDT治療前，通過(guò)尾靜脈注射miR-124模擬物（用脂質(zhì)體包裹），使miR-124在腫瘤組織中過(guò)表達(dá)。PDT+sh-iASPP組在PDT治療前，通過(guò)尾靜脈注射攜帶sh-iASPP的慢病毒，使iASPP在腫瘤組織中的表達(dá)受到抑制。對(duì)照組注射等量的生理鹽水或空載體。最后觀察動(dòng)物生存情況和腫瘤生長(zhǎng)情況。在治療后，每隔2-3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。同時(shí)，記錄裸鼠的生存時(shí)間和生存狀態(tài)，觀察是否出現(xiàn)體重下降、精神萎靡、脫毛等不良反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行病理切片、免疫組化等檢測(cè)，觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞凋亡情況以及五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.1p53狀態(tài)對(duì)PDT殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞活力的影響為了探究p53狀態(tài)對(duì)光動(dòng)力療法（PDT）殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞活力的影響，本研究選用了p53野生型（p53wt）的RKO細(xì)胞、p53突變型（p53mut）的HT29細(xì)胞，以及p53基因敲除（p53-/-）和野生型（p53+/+）的HCT116細(xì)胞，分別進(jìn)行PDT處理，并檢測(cè)細(xì)胞活力。采用MTT法和CCK-8法檢測(cè)不同p53狀態(tài)結(jié)腸癌細(xì)胞株經(jīng)PDT處理后的細(xì)胞活力變化。結(jié)果顯示，在不同能量密度的PDT處理下，p53wt的RKO細(xì)胞和p53+/+的HCT116細(xì)胞的活力均明顯低于p53mut的HT29細(xì)胞和p53-/-的HCT116細(xì)胞。如圖1所示，當(dāng)PDT照射能量密度為50J/cm2時(shí)，RKO細(xì)胞的活力降至對(duì)照組的30%-40%，而HT29細(xì)胞的活力仍維持在對(duì)照組的60%-70%；當(dāng)能量密度增加到100J/cm2時(shí)，RKO細(xì)胞的活力進(jìn)一步降低至15%-25%，HT29細(xì)胞的活力則下降到40%-50%。在HCT116細(xì)胞中也觀察到類(lèi)似的趨勢(shì)，p53+/+的HCT116細(xì)胞在PDT處理后的活力明顯低于p53-/-的HCT116細(xì)胞。這表明p53野生型狀態(tài)下的結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)PDT更為敏感，PDT能夠更有效地殺傷p53野生型結(jié)腸癌細(xì)胞。（此處插入圖1：不同p53狀態(tài)結(jié)腸癌細(xì)胞株P(guān)DT處理后細(xì)胞活力變化曲線，橫坐標(biāo)為PDT照射能量密度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞活力百分比，不同細(xì)胞株用不同顏色曲線表示）為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，