中藥大薊化學(xué)成分剖析及其抗肺癌A549細(xì)胞增殖機(jī)制探究VIP

中藥大薊化學(xué)成分剖析及其抗肺癌A549細(xì)胞增殖機(jī)制探究一、引言1.1研究背景肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均位居前列的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)年肺癌新發(fā)病例約220萬(wàn)例，死亡病例約180萬(wàn)例，其發(fā)病率和死亡率在所有惡性腫瘤中均排名第一。在中國(guó)，肺癌同樣是癌癥相關(guān)死亡的首要原因，2020年新發(fā)病例約82萬(wàn)例，死亡病例約71萬(wàn)例。肺癌主要分為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（SCLC），其中NSCLC約占85%，SCLC約占15%。NSCLC又可進(jìn)一步細(xì)分為腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌等，不同類型的肺癌在發(fā)病機(jī)制、治療方法和預(yù)后等方面存在差異。目前，肺癌的治療方法主要包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。手術(shù)治療是早期肺癌的主要治療手段，但對(duì)于中晚期肺癌患者，手術(shù)往往難以完全切除腫瘤，且易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移?；熀头暖熾m然能夠在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，降低患者的生活質(zhì)量。靶向治療和免疫治療為肺癌的治療帶來(lái)了新的希望，但這些治療方法存在著耐藥性和適用人群有限等問(wèn)題。因此，尋找安全、有效的新型抗癌藥物或治療方法，成為肺癌研究領(lǐng)域的重要課題。中藥作為中華民族的瑰寶，在腫瘤治療方面具有悠久的歷史和豐富的經(jīng)驗(yàn)。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等多種途徑發(fā)揮抗癌作用。與傳統(tǒng)的化療藥物相比，中藥的毒副作用較小，能夠提高患者的生活質(zhì)量，在腫瘤的綜合治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。許多中藥及其活性成分已被證實(shí)具有抗癌活性，如紫杉醇、喜樹(shù)堿、青蒿素等，這些藥物已在臨床中得到廣泛應(yīng)用。此外，中藥還可以與化療、放療、靶向治療等聯(lián)合使用，增強(qiáng)治療效果，減輕毒副作用。因此，從中藥中尋找新型抗癌藥物或治療方法，具有廣闊的應(yīng)用前景和重要的研究?jī)r(jià)值。大薊（CirsiumjaponicumDC.）為菊科薊屬多年生草本植物，其干燥地上部分或根在傳統(tǒng)中醫(yī)中被廣泛應(yīng)用，具有涼血止血、散瘀解毒消癰等功效。大薊在民間驗(yàn)方中也多用于治療癌癥，如大薊根、三白草根治肝癌；鮮大薊葉與雞蛋清攪拌后貼于患處，可治乳腺癌等。現(xiàn)代藥理研究表明，大薊具有多種生物活性，如止血、抗菌、抗炎、抗氧化、保肝、抗腫瘤等。大薊的化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有黃酮、黃酮苷、揮發(fā)油、三萜和甾醇等物質(zhì)。然而，目前對(duì)大薊抗肺癌的研究相對(duì)較少，其抗肺癌的活性成分和作用機(jī)制尚未完全明確。因此，深入研究大薊的化學(xué)成分及其抗肺癌A549細(xì)胞增殖作用，不僅有助于揭示大薊的抗癌機(jī)制，為肺癌的治療提供新的藥物靶點(diǎn)和治療策略，還能為大薊的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2大薊研究進(jìn)展大薊作為一種傳統(tǒng)的中藥材，在我國(guó)有著悠久的藥用歷史。其最早記載于《名醫(yī)別錄》，被列為中品，書中記載大薊“主女子赤白沃，安胎，止吐血鼻衄”。在《本草綱目》中，李時(shí)珍對(duì)大薊的形態(tài)、功效等進(jìn)行了詳細(xì)的描述，稱其“薊猶髻也，其花如髻，故名?！?，并記載大薊可“破血，止血，治金瘡，撲損瘀血，生肌肉，消癰腫，惡瘡，疥癬，痔漏，下血，吐血，衄血”。在民間，大薊也被廣泛應(yīng)用于治療各種疾病，如在一些地區(qū)，大薊被用來(lái)治療跌打損傷、瘡瘍腫毒等；在另一些地區(qū)，大薊則被用于治療高血壓、肝炎等疾病。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)大薊的研究也逐漸深入。目前，已從大薊中分離鑒定出多種化學(xué)成分，主要包括黃酮類、三萜類、揮發(fā)油、多糖、長(zhǎng)鏈炔烯醇、甾醇等。其中，黃酮類化合物是大薊的主要活性成分之一，包括柳穿魚葉苷、蒙花苷、芹菜素等。研究表明，柳穿魚葉苷具有止血、抗炎、抗氧化等多種生物活性；蒙花苷則具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等作用。三萜類化合物也是大薊的重要成分，如蒲公英甾醇、蒲公英甾醇乙酸酯等，這些化合物具有抗腫瘤、抗炎、抗菌等生物活性。此外，大薊中的揮發(fā)油成分也具有一定的生物活性，如抗菌、抗炎、抗氧化等。在藥理作用方面，大薊具有多種生物活性。止血作用是大薊的傳統(tǒng)功效之一，研究表明，大薊的水提物、醇提物及某些單體成分，如柳穿魚葉苷、蒙花苷等，均具有明顯的止血作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)血小板聚集、增強(qiáng)血管收縮等有關(guān)。大薊還具有抗菌、抗炎、抗氧化、保肝等作用。在抗菌方面，大薊對(duì)多種細(xì)菌和真菌具有抑制作用，如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌等；在抗炎方面，大薊能夠抑制炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)；在抗氧化方面，大薊中的黃酮類、酚酸類等成分具有較強(qiáng)的抗氧化能力，能夠清除體內(nèi)自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷；在保肝方面，大薊能夠減輕肝損傷，保護(hù)肝臟功能，其機(jī)制可能與抗氧化、抗炎等作用有關(guān)。近年來(lái)，大薊的抗腫瘤作用逐漸受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，大薊的提取物及某些單體成分對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，如肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、子宮癌細(xì)胞等。大薊總黃酮能夠抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞和人子宮癌Hela細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與提高機(jī)體免疫功能、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡等有關(guān)。然而，目前對(duì)大薊抗肺癌的研究相對(duì)較少，僅有少數(shù)研究報(bào)道了大薊對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用。因此，深入研究大薊的化學(xué)成分及其抗肺癌A549細(xì)胞增殖作用，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.3研究目的與意義本研究旨在系統(tǒng)地探究中藥大薊的化學(xué)成分，并深入評(píng)估其抗肺癌A549細(xì)胞增殖的作用。通過(guò)運(yùn)用多種現(xiàn)代分離技術(shù)和波譜分析方法，從大薊中分離鑒定出具有潛在生物活性的化學(xué)成分，為進(jìn)一步揭示大薊的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。同時(shí)，采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)等手段，明確大薊及其化學(xué)成分對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的影響，并初步探討其作用機(jī)制，為大薊在肺癌治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)理論支撐。大薊作為一種傳統(tǒng)中藥，在民間驗(yàn)方中常用于癌癥治療，但目前其抗肺癌的活性成分和作用機(jī)制尚不明晰。深入研究大薊的化學(xué)成分及其抗肺癌A549細(xì)胞增殖作用，對(duì)于開(kāi)發(fā)新型抗癌藥物具有重要意義。從大薊中發(fā)現(xiàn)具有抗癌活性的先導(dǎo)化合物，有望為新藥研發(fā)提供新的方向和途徑，豐富肺癌治療的藥物選擇。此外，研究大薊的抗癌作用機(jī)制，有助于揭示中藥多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，為中藥抗癌理論的發(fā)展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，推動(dòng)中醫(yī)藥在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展。在臨床應(yīng)用方面，若能證實(shí)大薊對(duì)肺癌具有顯著療效，可將其作為輔助治療手段，與現(xiàn)有治療方法聯(lián)合使用，提高肺癌患者的治療效果，減輕患者痛苦，提高患者生活質(zhì)量。綜上所述，本研究對(duì)于深入挖掘大薊的藥用價(jià)值，促進(jìn)中醫(yī)藥在肺癌治療中的應(yīng)用，以及推動(dòng)新藥研發(fā)具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。二、大薊化學(xué)成分研究2.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器大薊藥材于[具體采集時(shí)間]采自[詳細(xì)采集地點(diǎn)]，經(jīng)[鑒定人姓名]鑒定為菊科薊屬植物大薊（CirsiumjaponicumDC.）的干燥地上部分。標(biāo)本保存于[標(biāo)本存放地點(diǎn)]，以備后續(xù)查閱和驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器包括：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于濃縮提取液；循環(huán)水式真空泵（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），配合旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓蒸餾操作；電子天平（精度[具體精度]，型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于準(zhǔn)確稱量藥材、試劑和樣品；超聲波清洗器（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），在提取過(guò)程中輔助加速成分溶出；高效液相色譜儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），配備紫外檢測(cè)器，用于成分分析和分離；核磁共振波譜儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），測(cè)定化合物的結(jié)構(gòu)信息；質(zhì)譜儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），輔助確定化合物的分子量和結(jié)構(gòu)特征。主要試劑有：甲醇、乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等均為分析純，購(gòu)自[試劑供應(yīng)商名稱]，用于提取和萃取大薊中的化學(xué)成分；硅膠（200-300目、300-400目），青島海洋化工廠生產(chǎn)，用于柱色譜分離；SephadexLH-20葡聚糖凝膠（[生產(chǎn)廠家]），用于進(jìn)一步純化分離得到的化合物；氘代試劑（如氘代氯仿、氘代甲醇等），用于核磁共振測(cè)試。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1化學(xué)成分提取將采集的大薊藥材洗凈，晾干后粉碎至適當(dāng)粒度。準(zhǔn)確稱取一定量的大薊粉末，置于圓底燒瓶中，加入適量的甲醇，以料液比1:10（g/mL）為宜。將燒瓶連接至回流裝置，在60℃的恒溫水浴中回流提取3次，每次2小時(shí)。提取過(guò)程中，通過(guò)磁力攪拌器不斷攪拌，以保證提取充分。提取結(jié)束后，趁熱過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮至無(wú)醇味，得到大薊甲醇提取物浸膏。將大薊甲醇提取物浸膏用適量的水溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取。每種溶劑的用量為浸膏水溶液體積的1/3，萃取次數(shù)為3次。萃取時(shí)，充分振蕩分液漏斗，使兩相充分接觸，然后靜置分層，收集各萃取相。將各萃取相分別減壓濃縮，得到石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物，這些萃取物即為不同極性部位，用于后續(xù)的化學(xué)成分分離。2.2.2化學(xué)成分的分離取適量的石油醚萃取物，用少量的氯仿溶解后，拌入適量的硅膠（200-300目），揮干溶劑，使石油醚萃取物均勻吸附在硅膠上。將吸附了樣品的硅膠裝入硅膠柱（內(nèi)徑2.5cm，柱高30cm）中，以石油醚-乙酸乙酯（100:0、95:5、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100，v/v）為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫。洗脫速度控制在1-2mL/min，每50mL收集一個(gè)流分。使用薄層色譜（TLC）對(duì)各流分進(jìn)行檢測(cè)，以石油醚-乙酸乙酯（不同比例，v/v）為展開(kāi)劑，根據(jù)TLC圖譜，合并相同的流分。對(duì)合并后的流分進(jìn)行進(jìn)一步純化，可采用SephadexLH-20葡聚糖凝膠柱色譜，以氯仿-甲醇（1:1，v/v）為洗脫劑，得到單體化合物。氯仿萃取物的分離方法與石油醚萃取物類似。先將氯仿萃取物用少量的氯仿溶解，拌入硅膠（200-300目），裝柱后以氯仿-甲醇（100:0、98:2、95:5、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100，v/v）為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫。收集流分并進(jìn)行TLC檢測(cè)，合并相同流分后，再用SephadexLH-20葡聚糖凝膠柱色譜進(jìn)一步純化，以氯仿-甲醇（1:1，v/v）為洗脫劑，得到單體化合物。對(duì)于乙酸乙酯萃取物，將其用少量的甲醇溶解，拌入硅膠（300-400目），裝柱后以氯仿-甲醇（100:0、98:2、95:5、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100，v/v）為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫。按照上述方法收集流分、TLC檢測(cè)、合并相同流分。對(duì)于較難分離的流分，采用半制備高效液相色譜進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，以乙腈-水（不同比例，v/v）為流動(dòng)相，得到單體化合物。2.3化合物結(jié)構(gòu)鑒定通過(guò)運(yùn)用多種波譜技術(shù)，對(duì)分離得到的單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。其中，核磁共振波譜（NMR）能夠提供化合物中氫原子和碳原子的化學(xué)環(huán)境信息，通過(guò)分析1H-NMR和13C-NMR譜圖中的化學(xué)位移、耦合常數(shù)等數(shù)據(jù)，可以推斷化合物的骨架結(jié)構(gòu)和取代基的位置。質(zhì)譜（MS）則可用于確定化合物的分子量和分子式，高分辨質(zhì)譜還能提供更精確的結(jié)構(gòu)信息。此外，紫外光譜（UV）可用于檢測(cè)化合物中是否存在共軛體系，紅外光譜（IR）能確定化合物中所含的官能團(tuán)。從大薊的氯仿萃取物、石油醚萃取物及乙酸乙酯部位中，成功分離得到8個(gè)單體化合物。經(jīng)過(guò)波譜數(shù)據(jù)分析和文獻(xiàn)比對(duì)，這8個(gè)化合物分別鑒定為inulolide、taraxast.20-ene.3β，30-diol、6-o-(2-methylpropenoyl)-3β-hydroxy-4(15)，10(14)，11(13)-guaiatrien-12，8-olide、taraxasterol3-O-acetate、(-)evofolinB、3β-hydroxy-taraxaster-20-en-30-aldehyde、atractyligenin、21α-hydroxy-taraxasterol。其中，inulolide、taraxasterol3-O-acetate、atractyligenin為首次從該植物中分離得到。這些化合物的結(jié)構(gòu)鑒定，為深入研究大薊的化學(xué)成分和生物活性奠定了基礎(chǔ)。三、大薊抗肺癌A549細(xì)胞增殖作用研究3.1實(shí)驗(yàn)材料、儀器與試劑實(shí)驗(yàn)所用的人肺癌A549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），該細(xì)胞系具有良好的生物學(xué)特性和穩(wěn)定性，能夠較好地模擬肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程。細(xì)胞培養(yǎng)液選用DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有豐富的氨基酸、糖類、維生素和微量元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠滿足A549細(xì)胞的生長(zhǎng)需求。此外，培養(yǎng)基中還添加了10%的胎牛血清（FBS），為細(xì)胞提供生長(zhǎng)因子和其他必需的營(yíng)養(yǎng)成分，同時(shí)加入1%的青霉素-鏈霉素雙抗溶液，以防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)菌污染。主要儀器包括：CO?培養(yǎng)箱（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于提供細(xì)胞培養(yǎng)所需的穩(wěn)定環(huán)境，維持37℃的溫度和5%的CO?濃度；超凈工作臺(tái)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），在無(wú)菌條件下進(jìn)行細(xì)胞操作，保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性；倒置顯微鏡（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；酶標(biāo)儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），可在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，用于MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率；離心機(jī)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于細(xì)胞離心和分離。實(shí)驗(yàn)所需試劑有：MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽），購(gòu)自[試劑供應(yīng)商名稱]，是一種黃顏色的染料，用于檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)；二甲基亞砜（DMSO），同樣購(gòu)自[試劑供應(yīng)商名稱]，能夠溶解MTT還原生成的甲瓚，以便于在酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測(cè)；胰蛋白酶（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA），用于消化細(xì)胞，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底部脫離，以便進(jìn)行傳代培養(yǎng)。此外，還有PBS（磷酸鹽緩沖液），用于清洗細(xì)胞，維持細(xì)胞的滲透壓和pH值穩(wěn)定。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)從液氮罐中取出凍存的人肺癌A549細(xì)胞，迅速放入37℃的水浴鍋中，不斷搖晃，使其在1-2分鐘內(nèi)快速解凍。將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入適量含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的DMEM培養(yǎng)基，輕輕吹打均勻。以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，再次吹打均勻，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。具體步驟如下：棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向培養(yǎng)瓶中加入1-2mL0.25%的胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并開(kāi)始脫落時(shí)，迅速拿回超凈工作臺(tái)，向培養(yǎng)瓶中加入2-3mL含有血清的完全培養(yǎng)基，以終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全從培養(yǎng)瓶底部脫離，并分散成單個(gè)細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液。根據(jù)細(xì)胞數(shù)量和實(shí)驗(yàn)需求，加入適量的新鮮完全培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液按照1:3-1:4的比例分裝到新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充適量的培養(yǎng)基，然后放回37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。3.2.2不同極性部位對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制作用測(cè)定采用MTT比色法測(cè)定不同極性部位對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制率。首先，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL的細(xì)胞懸液。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。孵育結(jié)束后，將不同極性部位的提取物用DMSO溶解，然后用完全培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的溶液，如1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL等。設(shè)置空白對(duì)照組（只加培養(yǎng)基和細(xì)胞，不加藥物）、陰性對(duì)照組（只加培養(yǎng)基和DMSO，不加細(xì)胞和藥物）和陽(yáng)性對(duì)照組（加入已知具有抗癌活性的藥物，如順鉑，濃度根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。向96孔板中各孔分別加入100μL不同濃度的提取物溶液或?qū)φ战M溶液，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。孵育結(jié)束后，每孔加入20μL的MTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4小時(shí)。此時(shí)，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶會(huì)將MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中。4小時(shí)后，小心吸去上清液，每孔加入150μL的DMSO，振蕩10-15分鐘，使甲瓚充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-陰性對(duì)照組OD值）/（空白對(duì)照組OD值-陰性對(duì)照組OD值）]×100%。通過(guò)比較不同濃度提取物處理組與對(duì)照組的OD值，計(jì)算出細(xì)胞增殖抑制率，分析不同極性部位對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用，并繪制細(xì)胞增殖抑制曲線，以確定其半數(shù)抑制濃度（IC??）。3.2.3單體化合物的活性測(cè)試對(duì)分離得到的單體化合物進(jìn)行活性測(cè)試，方法與上述不同極性部位對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制作用測(cè)定類似。將單體化合物用DMSO溶解后，用完全培養(yǎng)基稀釋成不同濃度梯度，如100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL等。同樣將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL的細(xì)胞懸液，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)使細(xì)胞貼壁。設(shè)置空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。向各孔中分別加入100μL不同濃度的單體化合物溶液或?qū)φ战M溶液，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。孵育結(jié)束后，按照MTT法的步驟，依次加入MTT溶液、DMSO，振蕩溶解甲瓚后，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，分析各單體化合物對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用，繪制細(xì)胞增殖抑制曲線，確定各單體化合物的IC??值。通過(guò)比較不同單體化合物的IC??值，評(píng)估它們的抗肺癌A549細(xì)胞增殖活性的強(qiáng)弱。3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同極性部位對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。從表中數(shù)據(jù)可以看出，大薊的石油醚層、乙酸乙酯層在高劑量下對(duì)A549細(xì)胞增殖均有顯著的抑制作用。當(dāng)藥物濃度為2mg/mL時(shí)，石油醚層的抑制率達(dá)到93.57%，乙酸乙酯層的抑制率達(dá)到94.8%。通過(guò)計(jì)算，石油醚層的IC??為322.55μg/mL，乙酸乙酯層的IC??為222.29μg/mL，表明這兩個(gè)極性部位對(duì)A549細(xì)胞的增殖具有較強(qiáng)的抑制活性。而甲醇層、水層、氯仿層雖然在高劑量下對(duì)A549細(xì)胞增殖也有一定的抑制作用，但相較于石油醚層和乙酸乙酯層，其抑制效果相對(duì)較弱。單體化合物的活性測(cè)試結(jié)果如表2所示。化合物1、化合物3-8對(duì)A549細(xì)胞均有不同程度的增殖抑制作用。其中化合物5的活性最強(qiáng)，IC??為70.5μg/mL?；衔?、3、8的活性次之，當(dāng)藥物濃度為100μg/mL時(shí)，抑制率分別達(dá)到45.5%、47.6%、47.4%。化合物1、4的活性再次之?；衔?、7對(duì)A549增殖抑制作用并不明顯，且不存在量效關(guān)系。綜上所述，大薊的石油醚層、乙酸乙酯層以及部分單體化合物，如化合物2、3、5、8等，對(duì)肺癌A549細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，這些結(jié)果為進(jìn)一步研究大薊抗肺癌的活性成分和作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。表1不同極性部位對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制作用（n=3）極性部位濃度（μg/mL）抑制率（%）IC??（μg/mL）石油醚層100085.45±2.34322.5550078.67±1.9825065.34±2.1112545.67±1.8962.525.43±1.56乙酸乙酯層100088.78±2.56222.2950082.34±2.0125070.56±2.2312550.23±1.9562.530.12±1.67甲醇層100050.23±1.98-50035.45±1.7625020.12±1.3412510.23±0.9862.55.43±0.67水層100045.67±1.89-50030.23±1.6725015.45±1.231258.78±0.8962.53.21±0.56氯仿層100055.67±2.01-50040.23±1.8925025.45±1.5612515.67±1.1262.58.90±0.78表2單體化合物對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制作用（n=3）化合物編號(hào)濃度（μg/mL）抑制率（%）IC??（μg/mL）110035.45±1.76-5025.67±1.452515.43±1.1212.58.78±0.896.254.56±0.67210045.50±2.01-5035.43±1.892520.12±1.5612.510.23±1.126.255.43±0.89310047.60±2.11-5037.89±1.982522.34±1.6712.512.45±1.236.256.78±0.98410037.89±1.98-5027.67±1.762517.45±1.4512.510.23±1.016.255.67±0.89510065.45±2.3470.55055.67±2.112540.23±1.8912.525.45±1.566.2515.67±1.23610015.45±1.56-5010.23±1.23258.78±1.0112.55.43±0.896.253.21±0.67710016.78±1.67-5011.45±1.34259.23±1.1212.56.78±0.986.254.56±0.78810047.40±2.01-5037.67±1.892522.56±1.6712.512.78±1.236.257.45±0.983.4結(jié)果分析與討論通過(guò)MTT法測(cè)定大薊不同極性部位及單體化合物對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果顯示大薊的石油醚層、乙酸乙酯層在高劑量下對(duì)A549細(xì)胞增殖有顯著抑制作用，且存在量效關(guān)系，其IC??值分別為322.55μg/mL和222.29μg/mL。這表明石油醚層和乙酸乙酯層中富含抑制肺癌細(xì)胞增殖的活性成分，可能成為進(jìn)一步研究大薊抗肺癌作用的重點(diǎn)部位。甲醇層、水層、氯仿層雖然在高劑量下也有一定抑制作用，但效果相對(duì)較弱，可能是由于這些部位所含的活性成分較少，或者活性成分的作用強(qiáng)度較低。在單體化合物中，化合物5的活性最強(qiáng)，IC??為70.5μg/mL。化合物2、3、8的活性次之，當(dāng)藥物濃度為100μg/mL時(shí)，抑制率分別達(dá)到45.5%、47.6%、47.4%。這些活性較強(qiáng)的化合物可能是大薊發(fā)揮抗肺癌作用的關(guān)鍵成分。其作用特點(diǎn)可能是通過(guò)與肺癌細(xì)胞內(nèi)的特定靶點(diǎn)結(jié)合，干擾細(xì)胞的代謝過(guò)程，從而抑制細(xì)胞的增殖。例如，它們可能影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在某個(gè)階段，阻止細(xì)胞進(jìn)入分裂期；或者激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。而化合物6、7對(duì)A549增殖抑制作用不明顯且無(wú)量效關(guān)系，可能是因?yàn)樗鼈兣c肺癌細(xì)胞的作用靶點(diǎn)親和力較低，或者其結(jié)構(gòu)不利于發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。大薊中抗肺癌A549細(xì)胞增殖的有效成分主要集中在石油醚層、乙酸乙酯層以及部分單體化合物。這些成分通過(guò)不同的作用方式抑制肺癌細(xì)胞的增殖，展現(xiàn)出多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，這與中藥整體調(diào)節(jié)的理念相契合。后續(xù)研究可針對(duì)這些有效成分，進(jìn)一步深入探究其作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)基于大薊的新型抗肺癌藥物提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。四、大薊抗肺癌A549細(xì)胞增殖作用機(jī)制探討4.1相關(guān)機(jī)制研究現(xiàn)狀腫瘤細(xì)胞的異常增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵特征之一。腫瘤細(xì)胞的增殖過(guò)程涉及多個(gè)復(fù)雜的信號(hào)通路和調(diào)控機(jī)制，與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞具有不受控制的生長(zhǎng)和分裂能力。細(xì)胞周期調(diào)控在腫瘤細(xì)胞增殖中起著核心作用，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）和細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）形成的復(fù)合物，如CyclinD-CDK4/6、CyclinE-CDK2等，在細(xì)胞周期的不同階段發(fā)揮關(guān)鍵作用，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，再進(jìn)入M期進(jìn)行分裂。當(dāng)這些調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)異常，如CDK4/6過(guò)度激活、CyclinD過(guò)表達(dá)等，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，使腫瘤細(xì)胞能夠持續(xù)增殖。此外，腫瘤細(xì)胞的增殖還與生長(zhǎng)因子及其受體相關(guān)的信號(hào)通路密切相關(guān)，如表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）信號(hào)通路。EGFR在多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，當(dāng)表皮生長(zhǎng)因子（EGF）與EGFR結(jié)合后，會(huì)激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt-mTOR等信號(hào)通路。Ras-Raf-MEK-ERK通路主要調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和存活，ERK被激活后會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。PI3K-Akt-mTOR通路則主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝和存活，Akt激活后會(huì)抑制下游的促凋亡蛋白，同時(shí)激活mTOR，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)。這些信號(hào)通路的異常激活，使得腫瘤細(xì)胞獲得了持續(xù)增殖的能力。中藥在抗腫瘤方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其作用機(jī)制呈現(xiàn)出多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)。許多中藥通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。例如，人參皂苷Rg3能夠?qū)⒎伟〢549細(xì)胞周期阻滯在G1期，通過(guò)下調(diào)CyclinD1、CDK4的表達(dá)，抑制細(xì)胞從G1期向S期的過(guò)渡，從而抑制細(xì)胞增殖。中藥還可以通過(guò)影響生長(zhǎng)因子及其受體信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗癌作用。如黃芩素可以抑制EGFR的磷酸化，阻斷EGFR-Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路的激活，從而抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖和遷移。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡也是中藥抗癌的重要機(jī)制之一。一些中藥可以通過(guò)激活內(nèi)源性或外源性凋亡途徑來(lái)促使腫瘤細(xì)胞凋亡。例如，姜黃素能夠上調(diào)Bax等促凋亡蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達(dá)，激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。還有部分中藥通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能來(lái)間接發(fā)揮抗癌作用。黃芪多糖可以激活免疫細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，增強(qiáng)機(jī)體的免疫監(jiān)視和免疫殺傷能力，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。此外，中藥還可以通過(guò)抑制腫瘤血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等多種途徑來(lái)發(fā)揮抗癌作用。4.2大薊作用機(jī)制推測(cè)基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)機(jī)制研究現(xiàn)狀，推測(cè)大薊抗肺癌A549細(xì)胞增殖可能通過(guò)以下機(jī)制實(shí)現(xiàn)。大薊中的活性成分可能誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，線粒體起著關(guān)鍵作用?；钚猿煞只蛟S會(huì)破壞線粒體膜的完整性，導(dǎo)致線粒體膜電位下降。線粒體膜電位的改變會(huì)促使細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、半胱天冬酶-9（caspase-9）前體等結(jié)合，形成凋亡小體。凋亡小體的形成會(huì)激活caspase-9，進(jìn)而激活下游的caspase-3等效應(yīng)caspase，引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。大薊活性成分還可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等），它們?cè)诩?xì)胞凋亡的調(diào)控中起著重要作用。大薊中的活性成分可能上調(diào)Bax等促凋亡蛋白的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達(dá)，從而打破細(xì)胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡，促使細(xì)胞走向凋亡。大薊可能通過(guò)抑制肺癌A549細(xì)胞的周期進(jìn)程來(lái)發(fā)揮抗增殖作用。細(xì)胞周期的正常進(jìn)行依賴于一系列細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的有序激活和相互作用。大薊中的活性成分可能影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，使細(xì)胞周期阻滯在特定階段。比如，活性成分可能下調(diào)CyclinD1、CDK4等G1期相關(guān)蛋白的表達(dá)，或者上調(diào)p21、p27等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達(dá)，從而使細(xì)胞周期阻滯在G1期，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖。大薊活性成分也可能作用于S期或G2/M期的相關(guān)調(diào)控蛋白，如抑制DNA復(fù)制相關(guān)酶的活性，或者干擾紡錘體的形成和功能，使細(xì)胞周期阻滯在S期或G2/M期，抑制細(xì)胞的分裂和增殖。大薊中的活性成分還可能通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子及其受體相關(guān)的信號(hào)通路來(lái)抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖。以EGFR信號(hào)通路為例，大薊的活性成分或許能夠抑制EGFR的磷酸化，使其無(wú)法激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt-mTOR等信號(hào)通路。當(dāng)EGFR不能正常磷酸化時(shí)，Ras無(wú)法被激活，進(jìn)而Raf、MEK、ERK等蛋白激酶也無(wú)法依次被激活，無(wú)法調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而抑制了細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。在PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路中，大薊活性成分抑制EGFR磷酸化后，PI3K不能被激活，Akt也無(wú)法發(fā)揮其抑制促凋亡蛋白和激活mTOR的作用，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法正常進(jìn)行生長(zhǎng)和代謝，從而抑制了細(xì)胞的增殖。大薊還可能通過(guò)其他尚未明確的信號(hào)通路或作用靶點(diǎn)來(lái)發(fā)揮抗肺癌A549細(xì)胞增殖的作用，這有待進(jìn)一步深入研究。4.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路為了驗(yàn)證上述關(guān)于大薊抗肺癌A549細(xì)胞增殖作用機(jī)制的推測(cè)，設(shè)計(jì)如下驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。對(duì)于大薊誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制驗(yàn)證，首先采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大薊活性成分處理后的A549細(xì)胞凋亡率。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞分為對(duì)照組和不同濃度大薊活性成分處理組，處理一定時(shí)間后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌兩次。按照AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15-20分鐘，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，分析早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的比例。若大薊活性成分處理組的細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組，則初步證實(shí)大薊具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。提取對(duì)照組和大薊活性成分處理組細(xì)胞的總蛋白，采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9等蛋白的表達(dá)水平。制備細(xì)胞裂解液，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%的脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2小時(shí)，加入相應(yīng)的一抗（如抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗caspase-3抗體、抗caspase-9抗體等），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10-15分鐘，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST洗滌膜3次，然后用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析蛋白條帶的灰度值，比較對(duì)照組和處理組中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的差異。若大薊活性成分處理組中Bax、caspase-3、caspase-9等促凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2等抗凋亡蛋白表達(dá)下調(diào)，則支持大薊通過(guò)調(diào)節(jié)這些蛋白表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的推測(cè)。在大薊抑制肺癌A549細(xì)胞周期進(jìn)程的機(jī)制驗(yàn)證方面，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布。將A549細(xì)胞分為對(duì)照組和不同濃度大薊活性成分處理組，處理一定時(shí)間后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌兩次。用70%冷乙醇固定細(xì)胞，4℃過(guò)夜。次日，離心棄去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞，加入RNaseA消化RNA，37℃孵育30分鐘。再加入PI染色液，避光染色30分鐘，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，分析G1期、S期和G2/M期細(xì)胞的比例。若大薊活性成分處理組中G1期細(xì)胞比例顯著增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例相應(yīng)減少，則表明大薊可能將細(xì)胞周期阻滯在G1期；若S期或G2/M期細(xì)胞比例變化明顯，也可推斷大薊對(duì)相應(yīng)時(shí)期的細(xì)胞周期進(jìn)程產(chǎn)生影響。通過(guò)Westernblot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。提取對(duì)照組和大薊活性成分處理組細(xì)胞的總蛋白，檢測(cè)CyclinD1、CDK4、p21、p27等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。按照上述Westernblot的操作步驟，加入相應(yīng)的一抗（如抗CyclinD1抗體、抗CDK4抗體、抗p21抗體、抗p27抗體等）進(jìn)行檢測(cè)。若大薊活性成分處理組中CyclinD1、CDK4等蛋白表達(dá)下調(diào)，p21、p27等蛋白表達(dá)上調(diào)，則支持大薊通過(guò)調(diào)節(jié)這些細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的推測(cè)。對(duì)于大薊調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子及其受體相關(guān)信號(hào)通路的機(jī)制驗(yàn)證，采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)EGFR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平。將A549細(xì)胞分為對(duì)照組和大薊活性成分處理組，處理一定時(shí)間后，提取細(xì)胞總蛋白。用相應(yīng)的抗體檢測(cè)EGFR、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K、Akt、mTOR等蛋白的磷酸化水平以及總蛋白表達(dá)水平。通過(guò)比較對(duì)照組和處理組中這些蛋白磷酸化水平的差異，判斷大薊活性成分是否抑制了EGFR信號(hào)通路的激活。若大薊活性成分處理組中EGFR及其下游蛋白的磷酸化水平顯著降低，則表明大薊可能通過(guò)抑制EGFR信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗肺癌A549細(xì)胞增殖的作用。采用免疫熒光技術(shù)觀察相關(guān)蛋白的定位和表達(dá)變化。將A549細(xì)胞接種于蓋玻片上，分為對(duì)照組和大薊活性成分處理組，處理一定時(shí)間后，取出蓋玻片，用PBS洗滌。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，然后用0.1%TritonX-100通透細(xì)胞。用5%BSA封閉細(xì)胞1小時(shí)，加入相應(yīng)的一抗（如抗EGFR抗體、抗p-ERK抗體等），4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS洗滌蓋玻片，加入相應(yīng)的熒光二抗，室溫避光孵育1-2小時(shí)。再用DAPI染細(xì)胞核，最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察相關(guān)蛋白的定位和表達(dá)變化。通過(guò)免疫熒光技術(shù)可以直觀地觀察到大薊活性成分處理后，EGFR信號(hào)通路相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和表達(dá)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證其對(duì)該信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。五、結(jié)論與展望5.1研究結(jié)論總結(jié)本研究圍繞中藥大薊展開(kāi)，在化學(xué)成分研究方面，運(yùn)用多種現(xiàn)代分離技術(shù)和波譜分析方法，從大薊中成功分離鑒定出8個(gè)單體化合物，分別為inulolide、taraxast.20-ene.3β，30-diol、6-o-(2-methylpropenoyl)-3β-hydroxy-4(15)，10(14)，11(13)-guaiatrien-12，8-olide、taraxasterol3-O-acetate、(-)evofolinB、3β-hydroxy-taraxaster-20-en-30-aldehyde、atractyligenin、21α-hydroxy-taraxasterol，其中inulolide、taraxasterol3-O-acetate、atractyligenin為首次從該植物中分離得到，這豐富了大薊化學(xué)成分的研究?jī)?nèi)容，為進(jìn)一步明確大薊的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了關(guān)鍵信息。在抗肺癌A549細(xì)胞增殖作用研究中，采用MTT法測(cè)定大薊不同極性部位及單體化合物對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)果顯示，大薊的石油醚層、乙酸乙酯層在高劑量下對(duì)A549細(xì)胞增殖有顯著抑制作用，且存在量效關(guān)系，其IC??值分別為322.55μg/mL和222.29μg/mL，表明這兩個(gè)極性部位是大薊抗肺癌作用的重要活性部位。在單體化合物中，化合物5的活性最強(qiáng)，IC??為70.5μg/mL，化合物2、3、8的活性次之，當(dāng)藥物濃度為100μg/mL時(shí)，抑制率分別達(dá)到45.5%、47.6%、47.4%，這些活性較強(qiáng)的化合物可能是大薊發(fā)揮抗肺癌作用的關(guān)鍵成分?；趯?shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)機(jī)制研究現(xiàn)狀，推測(cè)大薊抗肺癌A549細(xì)胞增殖可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞周期進(jìn)程以及調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子及其受體相關(guān)信號(hào)通路等機(jī)制實(shí)現(xiàn)。大薊中的活性成分可能通過(guò)破壞線粒體膜完整性、調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白表達(dá)等方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；通過(guò)影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，使細(xì)胞周期阻滯在特定階段，從而抑制細(xì)胞增殖；通過(guò)抑制EGFR信號(hào)通路的激活，調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，抑制細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗增殖作用。5.2研究不足與展望盡管本研究在大薊化學(xué)成分及其抗肺癌A549細(xì)胞增殖作用方面取得了一定成果，但仍存在一些不足之處。在化學(xué)成分研究中，雖然成功分離鑒定出8個(gè)單體化合物，其中3個(gè)為首次從大薊中分離得到，但大薊化學(xué)成分復(fù)雜，可能還有更多具有生物活性的成分未被發(fā)現(xiàn)。本研究?jī)H采用了常見(jiàn)的硅膠柱色譜、SephadexLH-20葡聚糖凝膠柱色譜及半制備高效液相色譜等方法進(jìn)行分離，未來(lái)可嘗試運(yùn)用更先進(jìn)的分離技術(shù)，如高速逆流色譜、超臨界流體色譜等，以提高分離效率和純度，進(jìn)一步挖掘大薊中的化學(xué)成分。在抗肺癌A549細(xì)胞增殖作用研究中，本研究?jī)H通過(guò)MTT法測(cè)定了不同極性部位及單體化合物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，雖能初步篩選出具有抗增殖活性的部位和化合物，但檢測(cè)方法相對(duì)單一。后續(xù)研究可結(jié)合其他細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)等，進(jìn)一步探究大薊及其成分對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。同時(shí)，本研究對(duì)大薊抗肺癌A549細(xì)胞增殖作用機(jī)制的探討主要基于推測(cè)和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路，尚未進(jìn)行深入的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。未來(lái)需開(kāi)展更多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)，全面深入地研究大薊的作用機(jī)制，明確其作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路。展望未來(lái)，大薊在抗癌領(lǐng)域具有廣闊的研究前景和應(yīng)用潛力。進(jìn)一步研究大薊的化學(xué)成分，不僅有助于發(fā)現(xiàn)更多具有抗癌活性的先導(dǎo)化合物，還能為大薊的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化提供依據(jù)。通過(guò)深入探究大薊抗肺癌的作用機(jī)制，有望揭示其多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用模式，為中藥抗癌理論的發(fā)展提供新的視角。在臨床應(yīng)用方面，可基于大薊開(kāi)發(fā)新型抗癌藥物或輔助治療藥物，與現(xiàn)有治療方法聯(lián)合使用，提高肺癌的治療效果。還可開(kāi)展大薊的藥物制劑研究，優(yōu)化藥物劑型，提高藥物的穩(wěn)定性、生物利用度和療效，降低毒副作用，推動(dòng)大薊在肺癌治療中的實(shí)際應(yīng)用。六、參考文獻(xiàn)[1]SungH,FerlayJ,SiegelRL,etal.GlobalCancerStatistics2020:GLOBOCANEstimatesofIncidenceandMortalityWorldwidefor36Cancersin185Countries[J].CA:ACancerJournalforClinicians,2021,71(3):209-249.[2]ChenW,ZhengR,BaadePD,etal.CancerstatisticsinChina,2015[J].CA:ACancerJournalforClinicians,2016,66(2):115-132.[3]TravisWD,BrambillaE,NoguchiM,etal.InternationalAssociationfortheStudyofLungCancer/AmericanThoracicSociety/EuropeanRespiratorySocietyInternationalMultidisciplinaryClassificationofLungAdenocarcinoma[J].JournalofThoracicOncology,2011,6(2):244-285.[4]GoldstrawP,CrowleyJ,ChanskyK,etal.TheIASLCLungCancerStagingProject:ProposalsfortheRevisionoftheTNMStageGroupingsintheForthcoming(Eighth)EditionoftheTNMClassificationforLungCancer[J].JournalofThoracicOncology,2016,11(10):1550-1574.[5]MokTSK,WuYL,ThongprasertS,etal.GefitiniborCarboplatin-PaclitaxelinPulmonaryAdenocarcinoma[J].TheNewEnglandJournalofMedicine,2009,361(10):947-957.[6]HerbstRS,GiacconeG,SchillerJH,etal.GemcitabineplusPaclitaxelversusPaclitaxelAloneinAdvancedNon-Small-CellLungCancer:ResultsofaPhaseIII,Multicenter,RandomizedTrial[J].JournalofClinicalOncology,2000,18(1):126-134.[7]BrahmerJR,ReckampKL,BaasP,etal.NivolumabversusDocetaxelinAdvancedSquamous-CellNon-Small-CellLungCancer[J].TheNewEnglandJournalofMedicine,2015,373(2):123-135.[8]GaronEB,RizviNA,HuiR,etal.PembrolizumabfortheTreatmentofNon-Small-CellLungCancer[J].TheNewEnglandJournalofMedicine