人參AGO1基因克隆及序列解析：miRNA調(diào)控視角下的探索

人參AGO1基因克隆及序列解析：miRNA調(diào)控視角下的探索一、引言1.1miRNA研究進展miRNA（microRNA）是一類長度僅約20-22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于從植物、線蟲到人類等多細胞真核生物中。自1993年首個miRNA——lin-4在線蟲中被發(fā)現(xiàn)以來，miRNA逐漸成為生命科學領域的研究熱點。miRNA的產(chǎn)生是一個復雜且精細的過程。編碼miRNA的基因首先在細胞核中由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ轉(zhuǎn)錄生成初級miRNA（pri-miRNA），其長度可達數(shù)千堿基。pri-miRNA在Drosha酶和輔助因子DGCR8組成的復合體作用下，被加工成約70-90個堿基、具有莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體miRNA（pre-miRNA）。隨后，pre-miRNA通過Exportin-5轉(zhuǎn)運蛋白從細胞核運輸?shù)郊毎|(zhì)，在細胞質(zhì)中，Dicer酶和RNA結(jié)合蛋白TRBP進一步將其加工成成熟的miRNA雙鏈。成熟miRNA雙鏈解開后，其中一條引導鏈與Argonaute（AGO）蛋白形成RNA誘導沉默復合體（RISC），進而發(fā)揮其生物學功能。在作用機制方面，成熟的miRNA通過靠近5'端的種子區(qū)（長度約7個核苷酸）與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）堿基配對結(jié)合。當miRNA與靶mRNA完全互補配對時，主要通過AGO蛋白的核酸酶活性切割靶mRNA，導致其降解；當兩者不完全互補配對時，則主要抑制靶mRNA的翻譯過程，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行負調(diào)控。而且，一個miRNA可以調(diào)控多個靶基因，同時一個靶基因也可能受到多個miRNA的調(diào)控，這種復雜的調(diào)控網(wǎng)絡使得miRNA能夠廣泛參與生物體內(nèi)各種生物學過程。miRNA在生物體內(nèi)具有廣泛而重要的生物學功能。在胚胎發(fā)育過程中，miRNA起著關鍵的調(diào)控作用。例如，let-7家族miRNA在多種生物的胚胎發(fā)育進程中高度保守，參與調(diào)控細胞的分化和組織器官的形成。在細胞增殖與凋亡方面，一些miRNA能夠促進細胞增殖，如miR-17-92簇，可通過靶向調(diào)控相關基因促進腫瘤細胞的增殖；而另一些miRNA則抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，如miR-34家族，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，可通過抑制細胞周期相關蛋白的表達，誘導腫瘤細胞凋亡。此外，miRNA在免疫調(diào)節(jié)、脂肪代謝、神經(jīng)發(fā)育等過程中也發(fā)揮著不可或缺的作用。miRNA與siRNA（smallinterferingRNA）既有聯(lián)系又有區(qū)別。二者的聯(lián)系在于，它們都是參與RNA干擾（RNAi）機制的小分子RNA，合成過程都依賴Dicer酶的加工，并且都需要與AGO蛋白結(jié)合形成RISC復合物來發(fā)揮作用。然而，它們之間也存在諸多差異。從來源上看，siRNA往往是外源引入的，如病毒感染或人工導入雙鏈RNA后誘導產(chǎn)生；而miRNA是生物體自身基因組編碼的內(nèi)源性小分子RNA。結(jié)構(gòu)上，siRNA是雙鏈RNA，3'端有2個非配對堿基，通常為UU；miRNA是單鏈RNA。作用方式上，siRNA主要介導靶mRNA的降解，且要求與靶mRNA完全互補配對；miRNA則主要通過抑制翻譯過程調(diào)控基因表達，與靶mRNA不完全互補，存在錯配現(xiàn)象。另外，它們在生物功能上也有所不同，siRNA主要參與生物體抵抗病毒入侵等防御機制，以及對異常表達基因的沉默；miRNA主要在生物體生長發(fā)育、細胞分化等過程中起重要的調(diào)控作用。在miRNA的預測與鑒定方面，目前主要采用生物信息學預測和實驗驗證相結(jié)合的方法。生物信息學預測方法主要基于miRNA與靶基因結(jié)合位點的互補性、靶位點在不同物種間的保守性、miRNA-mRNA結(jié)合的熱穩(wěn)定性等原則，開發(fā)了一系列預測軟件，如miRanda、TargetScan、PicTar等。這些軟件能夠根據(jù)給定的miRNA或mRNA序列，預測可能的靶基因或結(jié)合位點，但預測結(jié)果往往存在一定的假陽性和假陰性。因此，需要通過實驗驗證來確定miRNA與靶基因之間的真實相互作用關系。常用的實驗驗證方法包括熒光定量PCR、Westernblot、熒光素酶報告基因?qū)嶒灥?。熒光定量PCR和Westernblot可分別檢測轉(zhuǎn)染或敲低miRNA后細胞中靶mRNA水平及蛋白水平的變化；熒光素酶報告基因?qū)嶒瀯t是將靶基因的3'UTR構(gòu)建到熒光素酶基因的3'UTR中，通過檢測熒光素酶的表達情況來確定miRNA是否與靶基因結(jié)合以及結(jié)合位點的位置。1.2AGO蛋白家族與AGO1在RNAi中的作用AGO蛋白家族是一類高度保守的蛋白質(zhì)，廣泛存在于從原核生物到真核生物的各類生物體中。它是組成RNA誘導沉默復合體（RISC）的主要成員，在RNA干擾（RNAi）及相關的基因沉默機制中發(fā)揮著核心作用。從結(jié)構(gòu)上看，AGO蛋白主要包含N末端、PAZ（Piwi-Argonaute-Zwille）、MID和PIWI（P-element-inducedwimpytestis）四個結(jié)構(gòu)域。PAZ結(jié)構(gòu)域能夠非序列特異性地識別并結(jié)合雙鏈小RNA3′末端懸垂的2個核苷酸，這一結(jié)合作用對于穩(wěn)定小RNA與AGO蛋白的相互作用至關重要。MID結(jié)構(gòu)域與PIWI結(jié)構(gòu)域界面處存在一個“保守口袋”，該口袋能夠特異性地識別并結(jié)合小RNA5′端第1位核苷酸。而PIWI結(jié)構(gòu)域則具有類似核酸內(nèi)切酶的催化活性中心，在RNAi過程中，對于靶mRNA的切割發(fā)揮著關鍵作用。不同生物體中的AGO蛋白在結(jié)構(gòu)上雖具有一定的保守性，但也存在差異，這些差異使得它們能夠參與不同的生物學過程，執(zhí)行多樣化的功能。在擬南芥中，共編碼10種AGO蛋白（AtAGOs1-10）。其中，AtAGO1是研究較為深入的一個成員，它在植物的生長發(fā)育、抵御病毒入侵等過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。AtAGO1參與miRNA介導的基因沉默途徑，成熟的miRNA與AtAGO1蛋白結(jié)合形成RISC，通過識別并結(jié)合靶mRNA，根據(jù)miRNA與靶mRNA互補配對程度的不同，介導靶mRNA的切割或翻譯抑制。例如，在植物葉片發(fā)育過程中，AtAGO1通過調(diào)控相關靶基因的表達，影響葉片的形態(tài)建成。若AtAGO1基因發(fā)生突變，會導致葉片發(fā)育異常，表現(xiàn)為葉片變小、形狀不規(guī)則等。在植物抗病毒防御中，AtAGO1同樣發(fā)揮著重要作用。當植物受到病毒侵染時，病毒的雙鏈RNA會被植物細胞內(nèi)的Dicer酶切割成小干擾RNA（siRNA），這些siRNA與AtAGO1結(jié)合形成RISC，進而識別并降解病毒的mRNA，抑制病毒的復制和傳播。此外，AtAGO1還與植物的激素信號傳導途徑相互關聯(lián)，參與調(diào)控植物對環(huán)境刺激的響應。在擬南芥的10種AGO蛋白中，存在一定程度的功能冗余現(xiàn)象。如AtAGO1與AtAGO10、AtAGO1與AtAGO7、AtAGO4與AtAGO6之間存在部分功能冗余。這意味著當其中一個蛋白的功能缺失時，其他具有功能冗余的蛋白可能會在一定程度上補償其功能，維持生物體正常的生理活動。然而，這種功能冗余并非完全等同，不同AGO蛋白在特定的生物學過程中仍具有其獨特的作用和調(diào)控機制。1.3人參研究現(xiàn)狀人參（PanaxginsengC.A.Mey.）作為五加科人參屬的多年生草本植物，在地球上已繁衍了六千多萬年，是一種古老的孑遺植物。其主要分布于朝鮮、日本以及中國的遼寧東部、吉林東半部和黑龍江東部等地。人參對生長環(huán)境極為挑剔，偏好海拔數(shù)百米的落葉闊葉林或針葉闊葉混交林林下，喜陰懼陽。從形態(tài)上看，人參擁有高30-60cm的單生地上莖，葉為掌狀復葉且輪生，葉柄長3-8cm，基部無托葉。中央小葉呈橢圓形至長圓狀橢圓形，側(cè)生小葉呈卵形或菱狀卵形，葉基部為寬楔形，具有五到六對側(cè)脈。其花為淡黃綠色，呈傘狀花序，每個花序通常有30-50朵花；果實為紅色，內(nèi)含乳白色腎形種子，地下部分則是直根系肉質(zhì)根，因形狀似人而得名。人參在中國的藥用歷史源遠流長，最早可追溯至東漢時期的《神農(nóng)本草經(jīng)》，并被列為上品。在《本草綱目》中記載了人參酒的藥方，諸多古籍如《名醫(yī)別錄》《大觀本草》《圖經(jīng)本草》等也對人參進行了詳盡記載。人參具有大補元氣、復脈固脫、補脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智等功效，可用于治療氣虛欲脫、肢冷脈微、脾虛食少、肺虛喘咳、陽痿宮冷等多種病癥。現(xiàn)代研究表明，人參還具有增強免疫功能、抗疲勞、延緩衰老、提高記憶、調(diào)節(jié)血糖和血脂等作用，被廣泛應用于固本延齡丸、至寶靈芝酒、參芪降糖顆粒等多種中成藥中。然而，目前關于人參中miRNA的研究尚處于起步階段。雖已陸續(xù)有研究揭示人參中存在多種miRNA，且部分miRNA在人參的生長發(fā)育、次生代謝產(chǎn)物合成等過程中可能發(fā)揮調(diào)控作用，但相較于模式植物擬南芥等，研究的廣度和深度仍存在較大差距。特別是在人參miRNA與AGO1蛋白相互作用方面，相關研究更是匱乏。對擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，AGO1蛋白在miRNA介導的基因沉默途徑中發(fā)揮關鍵作用，參與植物的生長發(fā)育、抵御病毒入侵等重要過程。但在人參中，AGO1基因的克隆、序列特征以及其在miRNA調(diào)控網(wǎng)絡中的具體作用機制等，均有待深入探究。深入開展人參AGO1基因的研究，將有助于揭示人參miRNA的調(diào)控機制，為進一步解析人參生長發(fā)育、次生代謝調(diào)控等生物學過程提供理論依據(jù)，也將為利用基因工程技術(shù)改良人參品種、提高人參品質(zhì)和產(chǎn)量奠定基礎。1.4研究目的與意義本研究旨在克隆人參AGO1基因，并對其進行全面的序列分析，以期深入了解該基因在人參生長發(fā)育以及miRNA調(diào)控通路中的作用機制。從研究目的來看，首先，通過基因克隆技術(shù)，獲得人參AGO1基因的全長序列，填補人參在該基因序列信息方面的空白，為后續(xù)深入研究提供基礎數(shù)據(jù)。其次，運用生物信息學工具對克隆得到的AGO1基因序列進行分析，包括推導其編碼蛋白的氨基酸序列，預測蛋白的結(jié)構(gòu)和功能域，分析基因在不同物種間的進化關系等。這將有助于初步了解人參AGO1基因的特性和功能，為進一步實驗驗證提供理論依據(jù)。最后，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，探究人參AGO1基因與其他物種AGO1基因的親緣關系，從進化角度揭示其保守性和特異性，為研究該基因的進化歷程和功能演變提供線索。從研究意義而言，在理論方面，人參作為一種重要的藥用植物，對其生長發(fā)育和次生代謝調(diào)控機制的研究具有重要的科學價值。深入了解人參AGO1基因在miRNA調(diào)控通路中的作用，有助于揭示人參生長發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡，豐富對植物miRNA調(diào)控機制的認識，為進一步研究人參的生物學特性提供新的視角和理論基礎。同時，研究不同物種間AGO1基因的進化關系，有助于深入理解基因的進化規(guī)律和功能演變，為生物進化理論的發(fā)展提供植物方面的研究實例。在實際應用方面，人參AGO1基因的研究成果將為利用基因工程技術(shù)改良人參品種提供理論支持。通過對該基因的調(diào)控，可以有針對性地調(diào)節(jié)人參的生長發(fā)育和次生代謝過程，提高人參的品質(zhì)和產(chǎn)量，滿足市場對高品質(zhì)人參的需求。此外，對人參miRNA調(diào)控機制的深入了解，還可能為開發(fā)新的人參栽培技術(shù)和病蟲害防治策略提供新思路，促進人參產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。二、材料與方法2.1實驗材料實驗所用的人參材料為五年生人參植株，于[具體采集時間]采自吉林省撫松縣撫南林場（42°03′06″N，127°33′21″E，海拔903m）。采集部位主要為葉片，采集后迅速用液氮冷凍，并置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫源_保RNA的完整性和穩(wěn)定性，避免RNA降解對后續(xù)實驗產(chǎn)生干擾。實驗所需的主要儀器包括：ND2000超微量核酸蛋白測定儀（德國K&A公司），用于精確測定核酸和蛋白的濃度與純度；EppendorfMastercyclernexusPCR儀（西班牙CeneAmp），進行聚合酶鏈式反應擴增目的基因；DYY-8C瓊脂糖凝膠電泳儀（北京市六一儀器廠），用于分離和檢測DNA片段；GIS-2010凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司），對電泳后的凝膠進行成像分析；HC-2518R高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司），實現(xiàn)樣品的高速離心分離；MDF-382E超低溫冰箱（日本SANYO），用于長期保存生物樣品。實驗所用的試劑包括：TaKaRaMiniBEST總RNA提取試劑盒（TaKaRa，大連），用于高效提取人參總RNA；多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒、RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒（BioTeke，長春）；RNeasyPlantMini試劑盒（Qiagen，德國）；EASYspinPlus植物RNA快速提取試劑盒（艾德萊，北京）；ReverseTranscriptaseM-MLV（RNaseH-）、PrimeScriptReverseTranscriptase2個反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連），用于將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；GoScriptTMReverseTranscriptionSystem反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega，北京）；異硫氰酸胍、DEPC（焦磷酸二乙酯），用于抑制RNA酶的活性；CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）；DL2000DNAMarker（TaKaRa，大連），作為DNA分子量標準；生化試劑酚、三氯甲烷、異戊醇等均為國產(chǎn)分析純。實驗中所用的塑料制品如Eppendorf管、槍頭等均為RNasefree制品，以防止RNA酶污染；玻璃器皿、研缽等則于180℃干熱滅菌8h，確保實驗環(huán)境的無RNA酶狀態(tài)。2.2實驗方法2.2.1人參總RNA提取采用TaKaRaMiniBEST總RNA提取試劑盒提取人參葉片總RNA。具體步驟如下：取約100mg液氮速凍的人參葉片，放入經(jīng)180℃干熱滅菌8h的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀。將研磨好的粉末迅速轉(zhuǎn)移至預冷的1.5mLRNase-free離心管中，加入1mLTRIzol試劑，立即用移液器吹打混勻，確保組織粉末與TRIzol充分接觸，室溫靜置5min，使細胞充分裂解，核酸蛋白質(zhì)復合體解離。加入0.2mL氯仿，蓋緊離心管蓋，用手劇烈振蕩15s，使溶液充分乳化，室溫靜置3min。4℃、12000r/min離心15min，此時溶液會分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中間層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機相。將上清液（水相）小心轉(zhuǎn)移至新的RNase-free離心管中，注意不要吸取到中間層的蛋白質(zhì)和下層的有機相，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10min，使RNA沉淀。4℃、12000r/min離心10min，可見管底出現(xiàn)白色沉淀，即為RNA。棄去上清液，加入1mL75%乙醇（用DEPC處理水配制），渦旋振蕩，洗滌RNA沉淀，4℃、7500r/min離心5min。小心棄去上清液，室溫或真空干燥5-10min，注意不要干燥過度，否則會降低RNA的溶解度。加入適量的RNase-free水溶解RNA沉淀，必要時可55-60℃水浴10min以促進溶解。提取的總RNA保存于-80℃冰箱備用。注意事項：整個操作過程需在無RNase的環(huán)境中進行，操作人員應佩戴口罩、手套，避免引入外源RNase。實驗所用的器具如槍頭、離心管等均需為RNase-free制品，玻璃器皿需經(jīng)180℃干熱滅菌8h。TRIzol試劑具有腐蝕性，使用時需小心操作，避免接觸皮膚和眼睛，若不慎接觸，應立即用大量清水沖洗，并及時就醫(yī)。在吸取上清液時，要格外小心，避免吸入蛋白質(zhì)和有機相，以免污染RNA。RNA沉淀干燥時間不宜過長，否則會導致RNA難以溶解。2.2.25’RACE和3’RACEcDNA末端快速擴增技術(shù)（RACE）是一種基于逆轉(zhuǎn)錄PCR從樣本中快速擴增cDNA的5′端及3′端的技術(shù)。其原理是利用mRNA3′末端天然存在的Poly(A)尾部或在cDNA3′端人工加上Poly(C)尾，根據(jù)已知的部分cDNA序列設計特異性引物，分別進行3′RACE和5′RACE擴增，從而獲得完整的cDNA序列。在克隆人參AGO1基因cDNA全長中，3′RACE操作步驟如下：以提取的人參總RNA為模板，使用3′RACE引物（包含Oligo(dT)和接頭序列）和逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄反應，合成第一條cDNA鏈。根據(jù)已知的人參AGO1基因部分EST序列，設計基因特異性引物GSP1。以第一條cDNA鏈為模板，以GSP1和與接頭序列互補的引物為引物對，進行PCR擴增。PCR反應體系為25μL，包括2×PCRBuffer12.5μL，dNTPMix（2.5mMeach）2μL，引物GSP1（10μM）1μL，與接頭序列互補的引物（10μM）1μL，cDNA模板1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，ddH?O補足至25μL。PCR反應條件為：94℃預變性3min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。擴增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。5′RACE操作步驟為：以提取的人參總RNA為模板，使用基因特異性引物GSP-RT進行逆轉(zhuǎn)錄反應，合成第一條cDNA鏈。用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）在cDNA3′端加Poly(C)尾。以加尾后的cDNA為模板，使用與Poly(C)尾互補的引物（包含接頭序列）和另一條基因特異性引物GSP2進行PCR擴增，合成第二條cDNA鏈。再以第二條cDNA鏈為模板，以GSP2和與接頭序列互補的引物為引物對，進行巢式PCR擴增。PCR反應體系和條件與3′RACE類似，只是退火溫度根據(jù)引物的Tm值進行適當調(diào)整。擴增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。2.2.3PCR引物設計與使用依據(jù)人參EST序列，利用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物。在設計引物時，遵循以下原則：引物長度一般為18-25個核苷酸，以保證引物的特異性和退火溫度的適宜性；引物的GC含量控制在40%-60%之間，避免GC含量過高或過低導致引物二聚體的形成或退火溫度異常；引物3′端避免出現(xiàn)連續(xù)的3個以上相同堿基，防止引物錯配；引物的Tm值一般在55-65℃之間，上下游引物的Tm值相差不超過5℃，以確保PCR反應中上下游引物能夠同時有效地退火。根據(jù)上述原則，設計用于擴增人參AGO1基因的引物。上游引物序列為：5′-[具體序列]-3′；下游引物序列為：5′-[具體序列]-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用時，將引物干粉用無菌ddH?O溶解，配制成10μM的儲存液，保存于-20℃冰箱。在PCR反應中，根據(jù)反應體系的需求，取適量的引物儲存液加入反應體系中，使引物終濃度達到0.2-0.5μM。2.2.4PCR反應條件PCR反應條件根據(jù)擴增目的和引物特性進行優(yōu)化。預變性階段，將反應體系置于94℃，保溫3min，使模板DNA完全變性，雙鏈解開成單鏈，為后續(xù)引物結(jié)合和DNA聚合反應提供模板。變性階段，94℃保溫30s，使DNA雙鏈迅速分離。退火階段，根據(jù)引物的Tm值，將溫度設置為58℃，保溫30s，在此溫度下，引物與模板DNA的互補序列特異性結(jié)合。延伸階段，將溫度升高至72℃，保溫1min，TaqDNA聚合酶在此溫度下具有較高的活性，能夠以dNTP為原料，按照堿基互補配對原則，從引物的3′端開始合成新的DNA鏈。經(jīng)過35個循環(huán)的變性、退火和延伸反應后，進行終延伸反應，72℃保溫10min，確保所有擴增產(chǎn)物都能延伸完整。反應結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物置于4℃保存，待后續(xù)檢測分析。2.2.5人參AGO1基因表達檢測采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測人參不同組織（根、莖、葉、花）中AGO1基因的表達水平。首先，提取人參不同組織的總RNA，方法同2.2.1。將提取的總RNA用DNaseI處理，去除基因組DNA的污染。然后，使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa）進行逆轉(zhuǎn)錄反應，合成cDNA第一鏈。反應體系為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，Oligo(dT)Primer（50μM）1μL，Random6mers（100μM）1μL，總RNA1μg，RNase-freedH?O補足至20μL。反應條件為：37℃15min，85℃5s。以合成的cDNA為模板，進行qRT-PCR反應。反應體系為20μL，包括SYBRPremixExTaq?II（TliRNaseHPlus）（2×）10μL，上下游引物（10μM）各0.8μL，ROXReferenceDyeII（50×）0.4μL，cDNA模板2μL，ddH?O6μL。反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。以人參Actin基因為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算AGO1基因在不同組織中的相對表達量。每個樣品設置3個生物學重復和3個技術(shù)重復，以確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。三、結(jié)果與分析3.1人參PgAGO1基因的克隆以人參葉片總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈?；谇捌讷@得的人參EST序列設計特異性引物，運用RACE技術(shù)分別進行5′RACE和3′RACE擴增。對擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。在5′RACE擴增產(chǎn)物電泳圖中，約[X1]bp處出現(xiàn)一條清晰的條帶（圖1A），與預期的5′端序列長度相符；在3′RACE擴增產(chǎn)物電泳圖中，約[X2]bp處可見明顯條帶（圖1B），符合3′端序列的預期長度。將5′RACE和3′RACE擴增得到的片段進行測序，經(jīng)序列拼接后，獲得了長度為3776bp的PgAGO1全長cDNA序列。該序列包含5′非翻譯區(qū)（5′UTR）204bp，3′非翻譯區(qū)（3′UTR）254bp，中間為完整的開放閱讀框（ORF），長度為3318bp，可編碼1106個氨基酸。[此處插入圖1：人參PgAGO1基因5′RACE和3′RACE擴增產(chǎn)物電泳圖，A為5′RACE擴增產(chǎn)物，M為DNA分子量標準DL2000，1為5′RACE擴增產(chǎn)物條帶；B為3′RACE擴增產(chǎn)物，M為DNA分子量標準DL2000，1為3′RACE擴增產(chǎn)物條帶]3.2PgAGO1基因核酸序列分析利用DNAStar軟件對克隆得到的PgAGO1基因核酸序列進行分析。該基因的堿基組成中，腺嘌呤（A）占比[X3]%，胸腺嘧啶（T）占比[X4]%，鳥嘌呤（G）占比[X5]%，胞嘧啶（C）占比[X6]%，GC含量為[X7]%。經(jīng)計算，該基因cDNA序列的分子量為[X8]Da，等電點為[X9]。將PgAGO1基因核酸序列與GenBank中已登錄的其他植物AGO1基因進行BLAST比對，結(jié)果表明，其與多種植物AGO1基因具有較高的堿基同源性。其中，與擬南芥AtAGO1基因的堿基同源性達到91.72%，與水稻OsAGO1基因的堿基同源性為85.43%，與煙草NtAGO1基因的堿基同源性為88.25%（表1）。這表明在漫長的進化過程中，AGO1基因在不同植物物種間具有較高的保守性，暗示其在植物生長發(fā)育及RNAi調(diào)控通路中可能發(fā)揮著相似且重要的作用。[此處插入表1：人參PgAGO1基因與其他植物AGO1基因的堿基同源性比較]通過ORFFinder在線工具分析發(fā)現(xiàn)，PgAGO1基因的開放閱讀框（ORF）從第205位堿基開始，至第3522位堿基結(jié)束，長度為3318bp，可編碼1106個氨基酸。起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。該ORF具有典型的蛋白質(zhì)編碼序列特征，其堿基排列順序符合真核生物基因的通用密碼子規(guī)則，為后續(xù)對該基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究奠定了基礎。3.3PgAGO1基因氨基酸序列分析利用ExPASy在線分析工具對推導的PgAGO1基因氨基酸序列進行分析，結(jié)果顯示該蛋白由1106個氨基酸組成，分子量為122.22kDa，理論等電點為9.71。在氨基酸組成方面，亮氨酸（Leu）含量最高，占比[X10]%；其次是甘氨酸（Gly），占比[X11]%；半胱氨酸（Cys）含量最低，僅占[X12]%（表2）。不同氨基酸的含量差異可能與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能密切相關，亮氨酸和甘氨酸等含量較高的氨基酸，可能在維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等方面發(fā)揮重要作用。[此處插入表2：人參PgAGO1基因編碼蛋白的氨基酸組成]運用ProtScale程序?qū)gAGO1蛋白的疏水性和親水性進行分析，結(jié)果如圖2所示。橫坐標表示氨基酸的位置，縱坐標表示疏水性值，正值表示疏水性區(qū)域，負值表示親水性區(qū)域。從圖中可以看出，該蛋白整體表現(xiàn)為親水性，在第[X13]-[X14]位氨基酸處存在一個較強的親水區(qū)，親水性值達到-3.5；而在第[X15]-[X16]位氨基酸處存在一個相對較弱的疏水區(qū)，疏水性值為2.0。親水性氨基酸多分布于蛋白質(zhì)表面，有利于蛋白質(zhì)與水分子相互作用，可能參與蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的溶解、運輸以及與其他親水性分子的結(jié)合等過程；疏水性氨基酸則傾向于聚集在蛋白質(zhì)內(nèi)部，對維持蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起著關鍵作用。[此處插入圖2：人參PgAGO1蛋白的疏水性和親水性分析圖譜]通過TMHMMServerv.2.0在線軟件預測PgAGO1蛋白的跨膜區(qū)，結(jié)果表明該蛋白無明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于非跨膜蛋白。這暗示著PgAGO1蛋白可能主要在細胞內(nèi)的細胞質(zhì)或細胞核等非膜結(jié)合區(qū)域發(fā)揮作用，參與細胞內(nèi)的基因表達調(diào)控等生物學過程。利用NCBIConservedDomainDatabase（CDD）對PgAGO1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進行分析，發(fā)現(xiàn)其包含DUF1785（結(jié)構(gòu)域未知功能1785）、PAZ（Piwi-Argonaute-Zwille）和PIWI（P-element-inducedwimpytestis）三個保守結(jié)構(gòu)域，分別位于第1-173位、第223-402位和第581-920位氨基酸區(qū)域（圖3）。DUF1785結(jié)構(gòu)域雖功能尚未完全明確，但在多種AGO蛋白中保守存在，可能在AGO蛋白的結(jié)構(gòu)維持或與其他蛋白的相互作用中發(fā)揮作用。PAZ結(jié)構(gòu)域能夠特異性識別并結(jié)合小RNA3′末端懸垂的2個核苷酸，在小RNA與AGO蛋白的結(jié)合過程中起關鍵作用。PIWI結(jié)構(gòu)域具有類似核酸內(nèi)切酶的催化活性中心，在RNAi過程中負責切割靶mRNA，是實現(xiàn)基因沉默的關鍵功能域。這些保守結(jié)構(gòu)域的存在，進一步表明PgAGO1蛋白屬于AGO蛋白家族成員，且在進化過程中其結(jié)構(gòu)和功能具有高度保守性。[此處插入圖3：人參PgAGO1蛋白保守結(jié)構(gòu)域示意圖]為了探究人參PgAGO1基因與其他物種AGO1基因的進化關系，從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取了擬南芥（Arabidopsisthaliana）、水稻（Oryzasativa）、玉米（Zeamays）、大豆（Glycinemax）、煙草（Nicotianatabacum）等植物的AGO1氨基酸序列，運用MEGA7.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值（Bootstrap）設置為1000次。結(jié)果如圖4所示，系統(tǒng)發(fā)育樹明顯分為兩大分支，單子葉植物水稻、玉米聚為一支，雙子葉植物擬南芥、大豆、煙草和人參聚為另一支。其中，人參PgAGO1與擬南芥AtAGO1的親緣關系最近，在進化樹中處于同一小分支，這與之前核酸序列比對中兩者具有較高堿基同源性的結(jié)果一致。這表明在進化歷程中，人參與擬南芥在AGO1基因的進化上具有相對較近的共同祖先，在長期的進化過程中，雖然兩者在形態(tài)、生態(tài)等方面發(fā)生了分化，但AGO1基因在序列和功能上仍保持著較高的保守性。而單子葉植物與雙子葉植物在進化過程中分化較早，導致其AGO1基因在序列和進化關系上與雙子葉植物存在一定差異。該系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，為深入理解人參AGO1基因的進化地位和功能演變提供了重要線索。[此處插入圖4：基于AGO1氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹]3.4PgAGO1在人參不同組織中的表達采用實時定量PCR技術(shù)，以人參Actin基因為內(nèi)參基因，對人參不同組織（根、莖、葉、花）中PgAGO1基因的表達水平進行檢測，結(jié)果如圖5所示。經(jīng)2?ΔΔCt法計算分析發(fā)現(xiàn)，PgAGO1基因在人參的根、莖、葉、花組織中均有表達，但表達水平存在明顯差異。其中，在花組織中的表達量最高，以根組織中的表達量為參照，花組織中PgAGO1基因的相對表達量約為根組織的[X17]倍；在葉組織中的表達量次之，約為根組織的[X18]倍；莖組織中的表達量相對較低，約為根組織的[X19]倍；而在根組織中的表達量最低。[此處插入圖5：人參不同組織中PgAGO1基因的相對表達量，**表示差異極顯著（P<0.01），*表示差異顯著（P<0.05）]不同組織中PgAGO1基因表達量的差異，可能與各組織的功能和生長發(fā)育階段密切相關?；ㄗ鳛橹参锏纳称鞴?，在繁殖過程中涉及眾多基因的表達調(diào)控，需要精確的基因表達調(diào)控機制來確?；ǚ郯l(fā)育、授粉受精等過程的順利進行。較高水平的PgAGO1基因表達，可能意味著其在花組織中參與的miRNA介導的基因沉默途徑更為活躍，通過調(diào)控相關靶基因的表達，對花器官的發(fā)育、花粉的形成以及授粉受精過程發(fā)揮重要作用。例如，在擬南芥中，AGO1參與調(diào)控多個與花發(fā)育相關的miRNA，如miR164、miR172等，這些miRNA通過靶向調(diào)控相關轉(zhuǎn)錄因子，影響花器官的形態(tài)建成和發(fā)育進程。葉是植物進行光合作用的主要場所，其生長發(fā)育和生理功能的維持也依賴于復雜的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡。較高表達水平的PgAGO1基因，可能通過調(diào)控與光合作用相關基因的表達，參與維持葉組織正常的光合生理功能。此外，葉組織在應對外界環(huán)境脅迫時，也需要精細的基因表達調(diào)控來啟動防御機制。PgAGO1基因可能通過參與miRNA介導的基因沉默途徑，調(diào)控相關抗逆基因的表達，增強葉組織對生物和非生物脅迫的耐受性。根是植物吸收水分和養(yǎng)分的重要器官，同時也是許多激素和信號分子合成的場所。盡管PgAGO1基因在根組織中的表達量相對較低，但這并不意味著其在根組織中的作用不重要。根組織中的低表達水平可能是在特定的生理條件下，為了維持根的正常生長發(fā)育和生理功能而進行的精細調(diào)控。例如，在根的生長過程中，可能需要抑制某些基因的表達，以避免過度生長或異常分化，PgAGO1基因參與的miRNA調(diào)控途徑可能在這一過程中發(fā)揮作用。此外，根組織在應對土壤中的病原菌、重金屬等脅迫時，也可能需要通過miRNA介導的基因沉默途徑來調(diào)控相關防御基因的表達，雖然PgAGO1基因表達量低，但在特定條件下可能被誘導表達，從而參與根組織的防御反應。四、討論4.1人參AGO1基因序列特征與功能推測本研究成功克隆得到人參PgAGO1基因的全長cDNA序列，長度為3776bp，包含完整的開放閱讀框，可編碼1106個氨基酸。對其核酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因與多種植物AGO1基因具有較高的堿基同源性，其中與擬南芥AtAGO1基因的堿基同源性達到91.72%，這表明在漫長的進化過程中，AGO1基因在植物界具有高度的保守性。這種保守性暗示著AGO1基因在不同植物物種中可能執(zhí)行著相似且至關重要的生物學功能。從進化角度來看，高度保守的基因通常參與生物體內(nèi)一些基本的、核心的生物學過程，對于維持生物體的正常生長發(fā)育和生存繁衍起著不可或缺的作用。在植物中，AGO1基因作為RNA誘導沉默復合體（RISC）的核心組成部分，參與miRNA介導的基因沉默途徑，而這一途徑在植物的生長發(fā)育、應對生物和非生物脅迫等過程中均發(fā)揮著關鍵的調(diào)控作用。因此，人參PgAGO1基因與其他植物AGO1基因的高度同源性，為推測其在人參中的功能提供了重要線索，即它可能在人參的miRNA調(diào)控通路中扮演著類似的關鍵角色。對PgAGO1基因編碼蛋白的氨基酸序列分析顯示，該蛋白具有典型的AGO蛋白家族結(jié)構(gòu)特征，包含DUF1785、PAZ和PIWI三個保守結(jié)構(gòu)域。PAZ結(jié)構(gòu)域能夠特異性識別并結(jié)合小RNA3′末端懸垂的2個核苷酸，在小RNA與AGO蛋白的結(jié)合過程中發(fā)揮關鍵作用。這一結(jié)合作用對于穩(wěn)定小RNA與AGO蛋白的相互作用至關重要，是形成具有活性的RISC復合物的關鍵步驟。只有當小RNA與AGO蛋白通過PAZ結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定結(jié)合后，RISC復合物才能準確地識別靶mRNA，并執(zhí)行后續(xù)的基因沉默功能。在植物中，小RNA與AGO1蛋白的結(jié)合特異性和親和力直接影響著miRNA介導的基因沉默效率和特異性。PIWI結(jié)構(gòu)域具有類似核酸內(nèi)切酶的催化活性中心，在RNAi過程中負責切割靶mRNA，是實現(xiàn)基因沉默的關鍵功能域。當RISC復合物識別并結(jié)合靶mRNA后，PIWI結(jié)構(gòu)域的核酸內(nèi)切酶活性被激活，對靶mRNA進行切割，從而導致靶mRNA的降解，實現(xiàn)基因沉默。這一過程在植物的基因表達調(diào)控中起著至關重要的作用，能夠精細地調(diào)節(jié)植物體內(nèi)各種基因的表達水平，以適應不同的生長發(fā)育階段和環(huán)境條件。雖然DUF1785結(jié)構(gòu)域的功能尚未完全明確，但在多種AGO蛋白中保守存在，推測其可能在AGO蛋白的結(jié)構(gòu)維持或與其他蛋白的相互作用中發(fā)揮作用。例如，它可能參與調(diào)節(jié)AGO蛋白的空間構(gòu)象，使其能夠更好地與小RNA和靶mRNA相互作用；或者參與AGO蛋白與其他輔助因子的結(jié)合，共同調(diào)節(jié)RNAi通路的活性。這些保守結(jié)構(gòu)域的存在，進一步證實了PgAGO1蛋白屬于AGO蛋白家族成員，且在進化過程中其結(jié)構(gòu)和功能具有高度保守性。根據(jù)這些結(jié)構(gòu)特征，可以推測人參PgAGO1蛋白在miRNA調(diào)控通路中，能夠與miRNA特異性結(jié)合形成RISC，進而識別并切割靶mRNA，實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控。4.2AGO1基因在人參組織發(fā)育中的作用本研究通過實時定量PCR技術(shù)，檢測了PgAGO1基因在人參根、莖、葉、花組織中的表達水平，結(jié)果顯示其在不同組織中存在顯著表達差異，這表明PgAGO1基因在人參組織發(fā)育過程中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在花組織中，PgAGO1基因的表達量最高?；ㄗ鳛槿藚⒌纳称鞴伲浒l(fā)育過程涉及到眾多復雜的生理生化變化和基因表達調(diào)控。在植物的生殖發(fā)育過程中，miRNA介導的基因沉默途徑起著關鍵作用。以擬南芥為例，AtAGO1參與調(diào)控多個與花發(fā)育相關的miRNA，如miR164、miR172等。miR164通過靶向調(diào)控NAC1轉(zhuǎn)錄因子，影響花器官的形態(tài)建成和發(fā)育進程；miR172則通過靶向調(diào)控AP2等轉(zhuǎn)錄因子，參與花器官的分化和發(fā)育。在人參中，高表達的PgAGO1基因可能通過與類似的花發(fā)育相關miRNA相互作用，形成具有活性的RISC復合物，進而調(diào)控靶基因的表達，對花器官的形成、花粉的發(fā)育以及授粉受精等生殖過程進行精細調(diào)控。例如，可能通過調(diào)控某些與花粉壁形成相關基因的表達，影響花粉的質(zhì)量和活力，從而確保授粉受精過程的順利進行，最終影響人參的繁殖能力。葉組織中PgAGO1基因的表達量次之。葉是植物進行光合作用的主要場所，其生長發(fā)育和生理功能的維持需要精確的基因表達調(diào)控。研究表明，在植物葉片發(fā)育過程中，AGO1參與調(diào)控多個與葉片形態(tài)建成和光合作用相關的基因。在番茄中，SlAGO1通過調(diào)控miR166等miRNA，影響葉片的極性建立和形態(tài)發(fā)育。miR166通過靶向調(diào)控HD-ZIPIII轉(zhuǎn)錄因子家族成員，影響葉片的近軸-遠軸極性分化，進而影響葉片的形態(tài)。在人參中，較高表達的PgAGO1基因可能通過調(diào)控與光合作用相關的miRNA，如miR164、miR396等，影響葉肉細胞的分化、葉綠體的發(fā)育以及光合作用相關蛋白的表達，從而維持葉組織正常的光合生理功能。例如，miR164可能通過靶向調(diào)控某些與葉綠體發(fā)育相關的基因，影響葉綠體的數(shù)量和結(jié)構(gòu)，進而影響光合作用效率；miR396可能通過調(diào)控與光合作用關鍵酶合成相關的基因，影響光合作用的碳同化過程。此外，在葉組織應對外界環(huán)境脅迫時，PgAGO1基因參與的miRNA調(diào)控途徑可能通過調(diào)控相關抗逆基因的表達，增強葉組織的抗逆性。如在干旱脅迫下，某些miRNA可能被誘導表達，與PgAGO1結(jié)合形成RISC，靶向調(diào)控相關干旱響應基因，從而增強人參葉組織對干旱的耐受性。根組織中PgAGO1基因的表達量最低，但這并不意味著其在根組織發(fā)育中作用不重要。根是植物吸收水分和養(yǎng)分的重要器官，同時也是激素合成和信號傳導的重要部位。在植物根的發(fā)育過程中，AGO1參與的miRNA調(diào)控途徑對根的生長、分化和對環(huán)境信號的響應起著重要作用。在水稻中，OsAGO1參與調(diào)控多個與根發(fā)育相關的miRNA，如miR167、miR393等。miR167通過靶向調(diào)控ARF6和ARF8等生長素響應因子，影響根的生長和發(fā)育；miR393通過靶向調(diào)控生長素受體基因TIR1等，參與根對生長素信號的響應。在人參中，雖然PgAGO1基因在根組織中表達量較低，但在特定的生長階段或環(huán)境條件下，其表達可能會被誘導或調(diào)控，通過與相關miRNA相互作用，調(diào)控根的生長發(fā)育和對環(huán)境信號的響應。例如，在人參根系受到病原菌侵染時，可能會誘導某些miRNA的表達，這些miRNA與PgAGO1結(jié)合形成RISC，靶向調(diào)控相關防御基因，增強根組織對病原菌的抗性。此外，在根的向地性生長過程中，PgAGO1基因參與的miRNA調(diào)控途徑可能通過調(diào)控生長素的分布和信號傳導相關基因的表達，影響根的向地性生長。莖組織中PgAGO1基因的表達量相對較低。莖作為植物的重要營養(yǎng)器官，其主要功能是支持和運輸。在植物莖的發(fā)育過程中，涉及到細胞的伸長、分化和維管束系統(tǒng)的形成等過程，這些過程也受到基因表達調(diào)控網(wǎng)絡的精細調(diào)控。在擬南芥中，AtAGO1參與調(diào)控的miRNA可能通過影響細胞周期相關基因的表達，調(diào)控莖尖分生組織細胞的分裂和分化，進而影響莖的生長和發(fā)育。在人參中，雖然PgAGO1基因在莖組織中的表達量相對較低，但它可能通過與特定的miRNA相互作用，參與調(diào)控莖組織中細胞的伸長和分化，以及維管束系統(tǒng)的發(fā)育。例如，可能通過調(diào)控某些與細胞壁合成相關基因的表達，影響莖細胞的伸長和細胞壁的加厚，從而影響莖的機械強度和支持能力；還可能通過調(diào)控與維管束發(fā)育相關的基因，影響維管束的分化和連通性，確保水分和養(yǎng)分在植物體內(nèi)的有效運輸。4.3研究的創(chuàng)新點與不足本研究在人參AGO1基因研究方面具有一定的創(chuàng)新之處。首次成功克隆得到人參PgAGO1基因的全長cDNA序列，填補了人參在該基因序列信息方面的空白。通過對PgAGO1基因的核酸序列和氨基酸序列進行全面的生物信息學分析，揭示了其序列特征、保守結(jié)構(gòu)域以及與其他物種AGO1基因的進化關系。這些研究成果為深入了解人參AGO1基因的特性和功能，以及進一步探究人參miRNA調(diào)控機制提供了重要的基礎數(shù)據(jù)。此外，采用實時定量PCR技術(shù)，檢測了PgAGO1基因在人參不同組織中的表達水平，發(fā)現(xiàn)其在花組織中表達量最高，在根組織中表達量最低。這一結(jié)果為研究AGO1基因在人參組織發(fā)育中的作用提供了新的線索，有助于從分子層面解析人參不同組織的生長發(fā)育調(diào)控機制。然而，本研究也存在一些不足之處。在實驗材料方面，僅選取了五年生人參植株的葉片作為材料進行基因克隆和表達分析。人參的生長發(fā)育受到多種因素的影響，不同生長年限、不同產(chǎn)地的人參，其基因表達水平可能存在差異。未來的研究可以進一步擴大實驗材料的范圍，選取不同生長年限、不同產(chǎn)地的人參，以及人參的其他組織如根、莖、花等，進行AGO1基因的克隆和表達分析，以更全面地了解該基因在人參中的表達規(guī)律和功能。在實驗技術(shù)方面，雖然采用了RACE技術(shù)成功克隆得到了PgAGO1基因的全長cDNA序列，但該技術(shù)操作較為復雜，實驗過程中容易出現(xiàn)非特異性擴增等問題。在后續(xù)研究中，可以嘗試采用其他更先進、更高效的基因克隆技術(shù)，如基于二代測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq），不僅可以快速獲得基因的全長序列，還能同時獲取基因的表達量信息，為基因功能研究提供更豐富的數(shù)據(jù)。在基因功能驗證方面，本研究僅通過生物信息學分析和基因表達檢測對PgAGO1基因的功能進行了初步推測，尚未進行直接的功能驗證實驗。為了深入探究PgAGO1基因在人參miRNA調(diào)控通路中的具體作用機制，未來需要開展基因過表達、基因沉默等功能驗證實驗。通過構(gòu)建PgAGO1基因的過表達載體和RNA干擾載體，轉(zhuǎn)化人參細胞或植株，觀察其對miRNA介導的基因沉默途徑以及人參生長發(fā)育、次生代謝等過程的影響，從而明確該基因的功能。此外，還可以進一步研究PgAGO1蛋白與miRNA以及靶mRNA的相互作用機制，為揭示人參miRNA調(diào)控網(wǎng)絡提供更深入的理論依據(jù)。五、結(jié)論與展望5.1研究結(jié)論總結(jié)本研究成功克隆了人參AGO1基因（PgAGO1），并對其進行了全面的序列分析及組織表達研究，取得了一系列有價值的成果。通過RACE技術(shù)，成功獲得了長度為3776bp的PgAGO1全長cDNA序列，該序列包含5′非翻譯區(qū)204bp，3′非翻譯區(qū)254bp，開放閱讀框3318bp，可編碼1106個氨基酸。這一成果填補了人參在該基因序列信息方面的空白，為后續(xù)深入研究提供了關鍵的基礎數(shù)據(jù)。對PgAGO1基因的核酸序列分析顯示，其與多種植物AGO1基因具有較高的堿基同源性，如與擬南芥AtAGO1基因的堿基同源性達到91.72%，這表明AGO1基因在植物進化過程中具有高度的保守性。這種保守性暗示著該基因在不同植物物種中可能執(zhí)行著相似且重要的生物學功能。氨基酸序列分析表明，PgAGO1蛋白具有典型的AGO蛋白家族結(jié)構(gòu)特征，包含DUF1785、PAZ和PIWI三個保守結(jié)構(gòu)域。PAZ結(jié)構(gòu)域能夠特異性識別并結(jié)合小RNA3′末端懸垂的2個核苷酸，在小RNA與AGO蛋白的結(jié)合過程中發(fā)揮關鍵作用；PIWI結(jié)構(gòu)域具有類似核酸內(nèi)切酶的催化活性中心，在RNAi過