生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)

1實(shí)驗(yàn)三酵母核糖核酸〔實(shí)驗(yàn)三酵母核糖核酸〔RNA〕的提取 實(shí)驗(yàn)四酵母核糖核酸〔RNA〕組分的鑒定 實(shí)驗(yàn)六過氧化氫酶米氏常數(shù)〔K〕的測(cè)定 m 實(shí)驗(yàn)八小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的比擬 實(shí)驗(yàn)九血糖的定量測(cè)定〔GOD-PAP法〕732學(xué)領(lǐng)域中一門重要的根底學(xué)科,它涵蓋的根底理論,根本知識(shí),根本技術(shù)與醫(yī)學(xué)研究各學(xué)科領(lǐng)域密切相關(guān),其理論與技術(shù)的開命科學(xué)的開展,對(duì)人類的科技進(jìn)步與文明產(chǎn)生巨大影響。生物化學(xué)實(shí)本門課程主要側(cè)重于給學(xué)生以根本的實(shí)驗(yàn)方法和技能的訓(xùn)練，讓2．實(shí)驗(yàn)時(shí)要嚴(yán)肅認(rèn)真專心進(jìn)行操作，注意觀察實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)33．實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)及時(shí)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果如實(shí)記錄下來，并請(qǐng)老師當(dāng)場(chǎng)審2．進(jìn)實(shí)驗(yàn)室前準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)、課本、筆記、實(shí)驗(yàn)記錄本、報(bào)4．實(shí)驗(yàn)室是培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考、獨(dú)立工作能力及良好科學(xué)作風(fēng)5．要保護(hù)儀器、節(jié)約藥品。第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)要按儀器清單清點(diǎn)儀器，負(fù)責(zé)保管，用后如數(shù)交還,在使用時(shí)如有破損，及時(shí)報(bào)告，經(jīng)指6．貴重儀器，如分光光度計(jì)、離心機(jī)等，要盡力保護(hù)，使用前42．取出試劑后，立即將瓶塞蓋好，切勿蓋錯(cuò)，放回原處。試劑3．取標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，應(yīng)先將標(biāo)準(zhǔn)液倒入干凈試管中，再用清潔吸4．使用滴管時(shí)，滴管尖端朝下，切勿倒置，勿使試劑流入橡皮5．使用有毒試劑及強(qiáng)酸強(qiáng)堿時(shí)，盡可能用量筒量取，假設(shè)用吸使用時(shí)應(yīng)禁明火、遠(yuǎn)離火源，假設(shè)需加熱要用水浴加熱，不可直接在3．假設(shè)發(fā)生酸堿灼傷事故，先用大量自來水清洗，酸灼傷者用53．實(shí)驗(yàn)完成后之沉淀或混合物含有可提取之貴重藥品者不可隨6第一章生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)根本操作果的可靠性。因此，玻璃儀器的清潔不僅是實(shí)驗(yàn)前后的常規(guī)工作，而新購(gòu)儀器外表附著油污和灰塵，特別是附著有可游離的金屬離溶液中煮沸。用流水沖凈后，再浸泡于12％HCl溶液中過夜。流7宜用鹽酸或適當(dāng)溶劑清洗。然后用自來水、蒸餾水沖洗干凈。切忌用此類吸量管為“吹出式〞，吸量管上端標(biāo)有“吹〞字。未標(biāo)“吹〞字8定量試驗(yàn)中，如欲加同種試劑于不同管中，并且取量不同時(shí)，應(yīng)選擇一支與最大取液量接近的刻度吸量管。如各試管應(yīng)加的試劑量為局部不可太深，也不可太淺，防止空氣突然進(jìn)入管內(nèi)，將溶液吸入吸刻度處。將吸量管移到另一容器，松開上口，使液體自由流出。最后9f．排放時(shí)，重新將大拇指按下，至第一檔后，繼續(xù)按至第二檔以2.指彈法：一手執(zhí)試管上端，另一只手輕彈試管下部，使管內(nèi)溶4．電磁攪拌混勻5.混勻器法：將容器置于混勻器的振動(dòng)盤上，逐漸用力下壓，使漏斗壁完全吻合，不留縫隙。向漏斗內(nèi)加液時(shí)，要用玻棒引導(dǎo)而且不【離心沉淀法】粘稠，或顆粒小得可以通過濾紙時(shí)，那么需選用離心法。特別是溶液離心機(jī)。其中制備離心技術(shù)又分為分級(jí)離心技術(shù)和密度梯度離心技術(shù)。用于生物大分子別離的，還有超速離心技術(shù)。本節(jié)將簡(jiǎn)要表達(dá)一轉(zhuǎn)動(dòng)平穩(wěn)；檢查套管有無(wú)軟墊，是否完好，內(nèi)部有無(wú)異物；離心管與平衡：將一對(duì)離心管放入一對(duì)套管中，置于天平兩側(cè)，用滴管向心管。假設(shè)離心管已碎，應(yīng)去除并更換新管；假設(shè)管未碎，應(yīng)重新平否那么將影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。常用劑量如下：草酸鉀或草酸抗凝劑宜先配成水溶液，按取血量的需要加于試管或適當(dāng)容器內(nèi)，橫放，再蒸干水分(肝素不宜超過30℃)，使抗凝劑在容器內(nèi)形為血漿。質(zhì)量上乘的血漿應(yīng)為淡黃色。為防止產(chǎn)生溶血，必須采用枯制備血清同樣要防止溶血，所以，應(yīng)用的器具應(yīng)當(dāng)枯燥清潔。而的作用?；蛘邚慕M織中別離、純化核酸、酶以及某些有意義的代謝物但是，在生物組織中，因含有大量的催化活性物質(zhì)，離體組織的組織糜：迅速將組織剪碎，用搗碎機(jī)絞成糜狀，或者參加少量黃組織勻漿：取一定量新鮮組織剪碎，參加適量勻漿制備液，用高是一種電磁波，傳播過程呈波動(dòng)性質(zhì)，具有波長(zhǎng)和頻率的特征。將電人肉眼可見的光線稱可見光，波長(zhǎng)范圍在400～760nm，波長(zhǎng)范圍在200～400nm為紫外光區(qū)(波長(zhǎng)<400nm的光線)，波長(zhǎng)范圍在760~500000nm為紅外區(qū)(波長(zhǎng)>760nm……)?？梢姽鈪^(qū)的電磁波，因波長(zhǎng)順序排列的各種單色光，即紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫等，這就是線，表現(xiàn)為不同的吸收現(xiàn)象，這一性質(zhì)稱為選擇性吸收。有色溶液之分光光度法，常被用來測(cè)定溶液中存在的光吸收物質(zhì)的濃度，其一局部光能，使光的強(qiáng)度減弱，假設(shè)溶液的濃度不變，那么溶液的厚溶液的厚度不變，那么溶液濃度C愈大，光吸收愈大，透射光線強(qiáng)度A=KCLA=-1gTA為吸光度(光密度、消光度)C為溶液的濃度L標(biāo)根據(jù)上式可知，對(duì)于相同物質(zhì)和相同波長(zhǎng)的單色光(消光系數(shù)不變)來說，溶液的吸光度和溶液的濃度呈正比。故己知標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃一個(gè)良好的光源要求具備發(fā)光強(qiáng)度高、光亮、穩(wěn)定、光譜范圍較收池上的指紋、油污或壁上的一些沉積物，都會(huì)影響其透光性，因此應(yīng)用高靈敏度放大裝置，將弱電流放大，提高敏感度。通過測(cè)量所產(chǎn)生的電能，由電流計(jì)顯示出電流的大小，在儀表上可直接讀得A值，T值。較高級(jí)的現(xiàn)代儀器，還常附有電子計(jì)算機(jī)及自動(dòng)記錄儀，可自有樣品的固定相時(shí)，由于樣品各組分的理化性質(zhì)〔吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等〕的差異，受固定相的配合相應(yīng)的光學(xué)、電學(xué)和電化學(xué)檢測(cè)手段，可用于定性、定量和純化某種物質(zhì)，其純度高達(dá)99％。層析法是別離率、靈敏度(pg～fg級(jí))、層析用濾紙的要求是：質(zhì)地均勻、厚薄均一、機(jī)械強(qiáng)度好、平整、無(wú)折痕、無(wú)明顯縱向和橫向紙紋等。層析常用的濾紙有w松，斑點(diǎn)易擴(kuò)散，適合于Rf 樣品原點(diǎn)到溶劑前沿的距離水>甲醇>乙醇>丙酮>正丁醇>乙酸乙脂層析時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)吸取濾紙中的水分，否那么改變分配平衡，色法兩種。剪洗法是將組分在濾紙上顯色后，剪下斑點(diǎn)，用適當(dāng)溶劑氧化鎂、氧化鋁、硅藻土、纖維素等。硅膠為微酸性吸附劑，適合別活度強(qiáng)時(shí)，能吸附極性較小的基團(tuán)；吸附劑活度弱時(shí)，對(duì)非極性基團(tuán)吸附能力也較強(qiáng)。一般利用加熱烘干的方法，減少吸附水分，從而增強(qiáng)其活度。通常，別離水溶性物質(zhì)時(shí)，因其本身具有較強(qiáng)極性，故吸次實(shí)驗(yàn)保持Rf值恒定的根底，一般使用吸附劑顆粒直徑為無(wú)機(jī)類粗，層析時(shí)溶劑推進(jìn)快，但別離效果差，而顆粒太細(xì)，層析時(shí)展開太薄層層析的優(yōu)點(diǎn)是：設(shè)備簡(jiǎn)單，操作容易，層析展開時(shí)間短，別紙層析和薄層層析均可用于氨基酸、肽、核苷酸、糖類、脂類和纖維素、TEAE-纖維素(三乙基氨乙基纖維如DEAE-SephadexA25、A50，CM--SephadexC25R—S03-H++Na+==R—S03-Na++H+洗脫下來，到達(dá)別離純化的目的。在實(shí)際工作中，可根據(jù)被別離物質(zhì)被別離的物質(zhì)為無(wú)機(jī)陽(yáng)離子或有機(jī)堿時(shí)，選用陽(yáng)離子交換樹脂；目。別離用的樹脂一般以直徑較小為宜，因粒度小，外表積大，別離分吸水溶脹，然后減壓去氣泡。傾去浮在溶液中的小顆粒樹脂，再用劑，均可再生后反復(fù)使用。再生方法為交換樹脂使用后，將交換樹脂稀堿緩緩流過交換柱。然后再洗至中性。離子交換纖維素使用后用2mol／LNaOH洗滌，然后用水洗凈堿液，再用緩沖液平衡，供下次實(shí)有主體多糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)孔大小與交聯(lián)度有關(guān)，交聯(lián)度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越致密，網(wǎng)孔的孔徑越小，交聯(lián)度越小，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越疏松，網(wǎng)孔顆粒間的孔隙，隨溶劑向下移動(dòng)，因此流程短，首先流出層析柱，而小分子物質(zhì)，由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，能自由進(jìn)出膠粒網(wǎng)孔，使之洗聯(lián)度成反比，在Sephadex后面綴上G-X作為交聯(lián)度的標(biāo)記。交如：SephadexG-50和G-100，吸水量分別為5ml水凝膠。此外交聯(lián)度大，機(jī)械強(qiáng)度大，較能容忍較高壓力，易采用高流而成的聚丙烯酰胺凝膠，其商品名為生物膠P(Bio-GelP)；瓊脂糖凝A和Sepharose；交聯(lián)瓊脂糖(SepharoseCL-2B，SepharoseCL-4B及SepharoseCL-6B)等。各種凝膠由于交聯(lián)劑的種類和比例不同，因而生物高分子具有能與其結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的專一分子進(jìn)行可逆性結(jié)合作為配基(載體)的專一分子(如酶的底物、輔酶，抗原的互補(bǔ)抗體)凝膠(sepharose2B、4B和6B)，活化后即可作為親和吸附的載體。如AH--Sepharose4B；CH—Sepharose和活化的CH-Sephar中溴化氰(CNBr)活化的Sepharose4B是親和層析中使用最廣泛的載極，帶負(fù)電的泳向正極。許多生物分子都帶有電荷，其電荷的多少取一般來說，帶電越多，分子量〔顆?！吃叫《沂乔蛐蔚?，那么泳動(dòng)速度就快。反之，那么慢。因此，在一定時(shí)間內(nèi)，由于各組分移動(dòng)距離子強(qiáng)度對(duì)電泳的影響是：離子強(qiáng)度低，電泳速度快，別離區(qū)帶不易清晰；離子強(qiáng)度高，電泳速度慢，但區(qū)帶別離清晰。如離子強(qiáng)度11數(shù)粒子的移動(dòng)愈快。電壓增加，相應(yīng)電流也增大，電流過大時(shí)易產(chǎn)生熱4．電滲作用在電場(chǎng)中，液體對(duì)固體的相對(duì)移動(dòng)，稱為電滲。如濾紙中含有外各放一電級(jí)，緩沖液和樣品自頂端下流，與電泳方向垂直?？蓜e離較大量的蛋白質(zhì)。以后有用淀粉、纖維素粉、玻璃粉等代替濾紙，別離丙烯酰胺凝膠圓盤電泳、等電聚焦電泳、等速電泳等，能使別離物質(zhì)不連續(xù)電泳與連續(xù)電泳的主要區(qū)別在于前者①有兩層不同孔徑紙電泳是以濾紙為支持物進(jìn)行電泳,現(xiàn)已根本被醋酸纖維帶，經(jīng)固定染色后不僅可看到清晰的色帶，而且可定量，計(jì)算出各種科學(xué)和相關(guān)領(lǐng)域研究中的重要介質(zhì)材料是由于它的特殊物理化學(xué)特2）瓊脂糖具有較高的機(jī)械強(qiáng)度，允許在聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelel酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，彈性大，透明，化學(xué)穩(wěn)定性高，無(wú)電滲作通過控制單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例聚合成孔徑大小不同的凝膠，可用于蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的別離、定性和定量分析。還可結(jié)合分子量范圍分子量范圍凝膠濃度%5～102～5根據(jù)凝膠形狀可分為盤狀電泳和板狀電泳。盤狀電泳是在直立的直或水平)是將丙烯酰胺聚合成方形或長(zhǎng)方形平板狀，平板大小和厚度視實(shí)驗(yàn)需要而定。垂直平板電泳有如下優(yōu)點(diǎn)：①外表積大，易于冷卻，便于控制溫度；②能在同一凝膠板上，相同操作條件下，同時(shí)點(diǎn)加多個(gè)樣品，便于相互比擬；③一個(gè)樣品在第一次電泳后，可將平板帶電荷的差異及分子大小的不同所產(chǎn)生的不同遷移率而別離成假設(shè)SDS是一種陰離子外表活性劑，它能使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵翻件下，SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比為1.4gSDS／g蛋白質(zhì)不再受蛋白質(zhì)原有的電荷和形狀的影響，而只與蛋白質(zhì)的分子量有Mr=K(10_bm)IgKM=IgK—bm=Kl—bm然后把未知分子量的蛋白質(zhì)樣品在同樣的條件下電泳，測(cè)出其遷移免疫電泳是在凝膠電泳與凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)根底上開展起來的一項(xiàng)化學(xué)技術(shù)。它是一種特異性的沉淀反響，敏感性較高，每種抗原可以弧線?？梢愿鶕?jù)出現(xiàn)的沉淀弧線數(shù)目來初步判定混合物中抗原的數(shù)量。一種好的抗血清應(yīng)出現(xiàn)較清晰、特異性的沉淀弧線，沉淀弧線的原擴(kuò)散速度慢時(shí)，沉淀弧線彎曲度大，其位置靠近移動(dòng)軸。反之當(dāng)抗第二篇根底生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)的定量測(cè)定——Folin-酚法性質(zhì)，如折射率，比重，紫外吸收等測(cè)定得知；另一類是利用化學(xué)方Folin—酚試劑由甲試劑和乙試劑組成。甲試劑由碳酸鈉，氫氧化鈉，硫酸銅及酒石酸鉀鈉組成。蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性條件下，與酒磷鎢酸，硫酸，溴等組成。此試劑在堿性條件下，易被蛋白質(zhì)中酪氨作簡(jiǎn)單，迅速，不需特殊儀器設(shè)備，靈敏度高，較紫外吸收法靈敏應(yīng)排除干擾因素或做空白試驗(yàn)消除。此法是22響。此外，所測(cè)的蛋白質(zhì)樣品中，假設(shè)含有酚類及檸檬酸，均對(duì)此反與〔4〕等體積配制成硫酸銅—酒石酸鉀鈉溶液黃色，不帶任何綠色。置棕色瓶中，可在冰箱長(zhǎng)期保存。假設(shè)此貯存液使用過久，顏色由黃變綠，可加幾滴液溴，煮沸幾分鐘，恢復(fù)原色102345670試0是在堿性條件下與蛋白質(zhì)作用生成堿性的銅－蛋白質(zhì)溶液。當(dāng)在要進(jìn)行電泳分析的樣品中參加含陰離子外表活性劑十二烷基磺酸處理液中通常參加溴酚藍(lán)染料作為電泳指示劑，用于控制電泳過程顯示電泳的前沿位置〕。此外，樣品處理液中還可參加適量蔗糖或甘作用，小分子的蛋白質(zhì)容易通過凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快；大①夾心式垂直板電泳槽，凝膠?！?35×100×1.5mm〕〔北京六一儀①高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒〔Pharmacia公司產(chǎn)品，表中2-1〕。MrMr蛋白試劑盒時(shí)，可參考常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及其分子量表。從中選擇2、將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上，短玻璃板應(yīng)面對(duì)上貯4、豎直電泳槽，在長(zhǎng)玻璃板下端與硅膠?？蚪唤绲目p隙內(nèi)參加已融電極緩沖液為pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液，內(nèi)含0.1%SDS。滴管將凝膠液加至長(zhǎng)、短玻璃板間的縫隙內(nèi)，約8cm高，用1ml注射水封。約30min后，凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，那么表管將濃縮膠加到已聚合的別離膠上方，直至距離短玻璃板上緣約劑廠生產(chǎn)的低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒，每一安瓿那么需參加20溶解后，將其轉(zhuǎn)移到帶塞小離心管中，輕輕蓋上蓋子〔不要塞緊以免加熱迸出〕，在100℃沸水浴中保溫3min，取出冷卻后加樣。如處理一般每個(gè)凹形樣品槽內(nèi)，只加一個(gè)種樣品或分子量的混合標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，加樣體積要根據(jù)凝膠厚及樣品濃度靈活掌握，一般加樣體積為如樣品槽中有所泡，可用注射器針頭挑除。加樣時(shí)，將微量注射器的進(jìn)行電泳。在制備濃縮膠后，不能進(jìn)行預(yù)電泳，因預(yù)電泳會(huì)破壞pH環(huán)境，如需要電泳只能在別離膠聚合后，并用別離膠緩沖液進(jìn)行。預(yù)中心，插入細(xì)銅絲作為前沿標(biāo)記。將凝膠板放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，參加固酵母細(xì)胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量為干菌體的規(guī)模操作的稀堿法或濃鹽法。這兩種方法所提取的核酸均為變性的此試劑必須在臨用前新鮮配制。市售的3,5—二羥甲苯每二人取1g二片干酵母于研缽中研碎(/分)。將上清液倒入另一小試管中，參加95％乙醇2ml，邊加邊攪。2．利用等電點(diǎn)控制RNA析出時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格控制pH。RNA含有核糖、嘌呤堿/嘧啶堿和磷酸各組分。加硫酸煮可使RNA水解，從水解液中可用定糖，加鉬酸銨沉淀〔或用定磷法〕和5-二羥基甲苯〕反響呈鮮綠色，該反響需用三氯化鐵或氯化銅作催化磷酸與鉬酸銨試劑作用產(chǎn)生黃色的磷鉬酸銨沉淀↓此試劑必須在臨用前新鮮配制。市售的3,5—二羥甲苯取水解液，按下表所列程序分別鑒定核酸的嘌呤堿、磷酸及核管水解5%3滴使成堿性3滴使成堿性2.磷酸的鑒定：取試管兩只，分別標(biāo)明測(cè)定管與對(duì)照管，然后依液號(hào)5%H2SO4VC3．核糖的鑒定：取試管兩只，分別標(biāo)明測(cè)定管與對(duì)照管，然管管4.脫氧核糖的鑒定：取兩試管分別標(biāo)明測(cè)定管與對(duì)照管，然后依號(hào)管管地衣酚反響特異性較差，凡戊糖均有此反響。因此地衣酚實(shí)驗(yàn)不實(shí)驗(yàn)五核酸的定量測(cè)定——紫外(UV)吸收法蛋白質(zhì)和核苷酸也能吸收紫外光。通常蛋白質(zhì)的吸收頂峰在在本實(shí)驗(yàn)中，1ml待測(cè)液中制品量為50μg。實(shí)驗(yàn)六過氧化氫酶米氏常數(shù)〔K〕的測(cè)定m22↑+8H2O2212345【計(jì)算】EQ\*jc3\*hps35\o\al(\s\up6(m),4)2m212345⑥反響速度V=②一⑤⑦[S]/V=③÷⑥m【思考題】mm有重要的作用。近年來，發(fā)現(xiàn)它還有增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤的抵抗力，并具多羥基物，屬于水溶性維生素。它分布很廣，植物的綠色局部及許多溶于水或乙醇中，不溶于油劑。在水溶液中易被氧化，在堿性條件下或堿性溶液中呈藍(lán)色。因此，當(dāng)用2，6–二氯酚靛酚滴定含有抗壞血名式量式2,6-Dich