多肽合成技術(shù)

多肽化學(xué)已經(jīng)走過了一百多年的光輝歷程，1902年，EmilFischer首先起先關(guān)注多肽合成，

由于當(dāng)時(shí)在多肽合成方面的學(xué)問太少，進(jìn)展也相當(dāng)緩慢當(dāng)時(shí)合成采納了苯甲酰，乙酰愛護(hù)，

脫去相當(dāng)困難，而且簡潔導(dǎo)致肽鏈斷裂。直到1932年，MaxBergmann等人起先運(yùn)用節(jié)氧鍛

基（Z）來愛護(hù)a-氨基，該愛護(hù)基可以在催化氫化或氫澳酸的條件下定量脫除，多肽合成才

起先有了肯定的發(fā)展。到了20世紀(jì)50年頭，隨著越來越多的生物活性多肽的發(fā)覺，大大推

動(dòng)了有機(jī)化學(xué)家們對(duì)■多肽合成方法以與愛護(hù)基的探討，因此這一階段的探討成果也特別豐富,

人們合成了大量的生物活性多肽，包括催產(chǎn)素（oxylocin）,胰島素等，同時(shí)在多肽合成方

法以與氨基酸愛護(hù)基上面也取得了不少成果，這為后來的固相合成方法的出現(xiàn)也供應(yīng)了試驗(yàn)

和理論基礎(chǔ)。也就是這個(gè)階段，F(xiàn)redSanger獨(dú)倉U了氨基酸序列測(cè)定方法，并為此獲得了1958

年的Nobel化學(xué)獎(jiǎng)。還是他后來獨(dú)創(chuàng)了DNA序列檢測(cè)方法，并于1980年再次獲得了Nobel

化學(xué)獎(jiǎng)，成為到目前為止唯一獲得兩次Nobel化學(xué)獎(jiǎng)的科學(xué)家。1963年，Merrifield提出了

固相多肽合成方法（SPPS）,這個(gè)在多肽化學(xué)匕具有里程碑竟義的合成方法，一出來.就

由于其合成便利，快速，現(xiàn)在已經(jīng)成為多肽合成的首選方法，隨后的發(fā)展也證明白該方法不

僅僅是一種合成方法，而且也帶來了有機(jī)合成上的一次革命，并成為了一支獨(dú)立的學(xué)科，固

相有機(jī)合成（SPOS）。當(dāng)然,Merrifield也因此榮獲了1984年的Nobel化學(xué)獎(jiǎng)。也正是Merrifield,

他經(jīng)過了反復(fù)的篩選，最終屏棄了茉氧默基（Z）在固相上的運(yùn)用，首先將叔丁氧城基（BOC）

用于愛護(hù)*氨基并在固相多肽合成上運(yùn)用，其可以在酸性條件下定量的脫除，反應(yīng)也特別

快速，在30min就可以反應(yīng)完仝。由于叔丁氧埃基（BOC）方法中，氨基酸側(cè)鏈的愛護(hù)基

團(tuán)大多基于葦基（Bzl）,因此也稱為BOC-Bzl策略。同時(shí),Merrifield在20世紀(jì)60年頭末

獨(dú)創(chuàng)了第一臺(tái)全自動(dòng)多肽合成儀，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸兩（124個(gè)氨基酸）。

隨后的多肽化學(xué)探討主要集中在固相合成樹脂，多肽縮合試劑，氨基酸愛護(hù)基的探討。1972,

LouCarpino首先將9-防甲氮默基（FMOC）用于愛護(hù)a-氨基，其在堿性條件下可以快速脫

除，10min就可以反應(yīng)完全，而且由于其反應(yīng)條件溫柔，快速得到廣泛運(yùn)用，到了20世紀(jì)

80年頭取代了叔丁氧談基（BOC）,成為了固相多肽合成中的首選合成方法。該方法中敘

基酸的側(cè)性大多基于叔丁基（But）,因此，也稱為FMOC-But策略。同時(shí)，在多肽合成樹

脂，縮合試劑以與氨基酸愛護(hù)，包括合成環(huán)肽的氨基酸上交愛護(hù)上也取得了豐碩的成果。

進(jìn)入21世紀(jì)，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的探討深化，對(duì)于多肽化學(xué)的要求不僅僅是合成方法，而更

多的集中在多肽標(biāo)記與修而方法，以與蛋白結(jié)構(gòu)與功能模擬多肽的合成以與長肽或蛋白合成。

?多肽化學(xué)合成的基本介紹

多肽化學(xué)合成方法，包括液相和固相兩種方法。液相合成方法現(xiàn)在主要采

納BOC和Z兩種愛護(hù)方法，現(xiàn)在主要應(yīng)用在短肽合成，如阿斯巴甜，力

肽，催產(chǎn)素等，其相對(duì)與固相合成，具有愛護(hù)基選擇多，成本低廉，合成

規(guī)模簡潔放大的很多優(yōu)點(diǎn)。與固相合成比較，液相合成主要缺點(diǎn)是，合成

范圍小，一般都集中在1。個(gè)氨基酸以內(nèi)的多肽合成，還有合成中須要對(duì)

中間體進(jìn)行提純，時(shí)間長，工作量大。固相合成方法現(xiàn)在主要采納FMOC

和BOC兩種方法，它具有合成便利，快速，簡潔實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，而且可以

比較簡潔的合成到30個(gè)氨基酸左右多肽。

1.1.氨基酸愛護(hù)基

20種常見氨基酸，依據(jù)側(cè)鏈可以分為幾類：脂肪族氨基酸(Ala,Gly,

Vai,Leu,He,),芳香族氨基酸(Phe,Tyr,Trp,His),酰胺或竣

基側(cè)鏈氨基酸(Asp,Glu,Asn,Gin),堿性側(cè)鏈氨基酸(Lys,Arg),

含硫氨基酸(Cys,Met),含醇氨基酸(Ser,Thr),亞氨型基酸(Pro)。

多肽化學(xué)合成中氨基酸的愛護(hù)特別關(guān)鍵，干脆確定了合成能夠勝利的關(guān)鍵。

因?yàn)槌Ｒ姷?0中氨基酸中有很多都是帶有活性側(cè)鏈的，須要進(jìn)行愛護(hù)，

一般要求，這些愛護(hù)基在合成過程中穩(wěn)定，無副反應(yīng)，合成結(jié)束后可以完

全定量的脫除。合成中須要進(jìn)行愛護(hù)的痣基酸包括：Cys,Asp,Glu,

His,Lys,Asn,Gin,Arg,Ser,Thr,Trp,Tyr。須要進(jìn)行愛護(hù)的基

團(tuán)：羥基，竣基，琉基，氨基，酰胺基，胭基，口引味，咪哇等。其中Trp

也可以不愛護(hù)，因?yàn)橛肐噪性質(zhì)比較穩(wěn)定。當(dāng)然在特殊的狀況下，有些氨基

酸也可以不愛護(hù)，象，Asn,Gin,Thr,Tyro

表1常見3種氨基脫除條件

TFAHBr/TFAH2/Pd-CPiperidine/DMF

Bocyynn

Znyyn

Fmocnyny

圖1常見3種氨基愛護(hù)基結(jié)構(gòu)

氨基酸側(cè)鏈愛護(hù)基團(tuán)特別多，同一個(gè)側(cè)鏈有多種不同的愛護(hù)基，可以在不

同的條件下選擇性的脫除，這點(diǎn)在環(huán)肽以與多肽修飾上具有很重要的意義。

而且側(cè)鏈愛護(hù)基和選擇的合成方法有親密的關(guān)系，液相和固相不一樣，固

相中BOC和FMOC策略也不一樣，從某種意義上看，多肽化學(xué)就是氨基

酸愛護(hù)基的敏捷運(yùn)用與搭配。關(guān)于側(cè)鏈愛護(hù)基的運(yùn)用，請(qǐng)參考王德心的《固

相有機(jī)合成一一原理與應(yīng)用指南》第四章，我們這里主要介紹Cys,Lys,

Asp的幾種愛護(hù)基與其脫除方法。Cys最常見的愛護(hù)基有三種,Trt,Acm,

Mob,這三個(gè)愛護(hù)基可以完成多對(duì)二硫鍵多肽的合成。Lys最常見的愛護(hù)

基有：Boc,Fmoc,Trt,Dde,Allyl,這對(duì)于固相合成環(huán)肽供應(yīng)了很多

正交的愛護(hù)策略。Asp最常見的愛護(hù)基有：Otbu,OBzl,OMe,OA11,

OFm,同樣也供應(yīng)了多種正交的愛護(hù)策略。

表2琉基常見愛護(hù)基

結(jié)構(gòu)脫除條件

簡稱

TrtQTFA,HCl/HOAc,

I2/MeOH

AcmI2/MeOH,Hg2+

MobHF,TFMSA,Hg2+

表3氨基常見愛護(hù)基

結(jié)構(gòu)脫除條件

簡稱

TrtQTFA,HOAc,HCOOH

Boc0HCl/HOAc,

—|-0-U-

TFA/DCM

FmocPip/DMF,

NaOH/MeOH

0

DdeH2NNH2/DMF

AllylPd(Ph3P)4,嗎咻/THF

表3竣基常見愛護(hù)基

結(jié)構(gòu)脫除條件

簡稱

OtbuITFA,HOAc,HCOOH

OBzlH2/Pd,HF,TFMSA

OMe§—0-CHaNaOH/MeOH

OA11卜。^XPd(Ph3P)4,nW/THF

OFm2名Pip/DMF,DBU/DMF

1.2.多肽縮合試劑

目前多肽合成中，主要采納竣基活化方法來完成接肽反應(yīng)，最早運(yùn)用的是

將氨基酸活化為酰氯，疊氮，對(duì)稱酸酊以與混合酸酊的方法，但是由于這

些條件下，存在氨基酸消旋，以與反應(yīng)試劑危急以與制備比較困難，漸漸

被后來的縮合試劑取代，依據(jù)其結(jié)構(gòu)可以分為兩種：縮合試劑主要有：碳

二亞胺型，^鹽型（Uronium）。

1.2.1,碳二亞胺型

主要包括：DCC,DIC,EDC.HC1等。采納DCC進(jìn)行反應(yīng)，由于反應(yīng)

中生成的DCU,在DMF中溶解度很小，產(chǎn)生白色沉淀，所以一般不用在

固相合成中，但是由于其價(jià)格便宜，在液相合成中，可以通過過濾除去,

應(yīng)用仍舊相當(dāng)廣泛。EDC.HC1因?yàn)槠渌芙庑缘奶攸c(diǎn)，在多肽與蛋白的

連接中運(yùn)用比較多，而且也相當(dāng)勝利。但是該類型的縮合試劑的一個(gè)最大

的缺點(diǎn)，就是假如單獨(dú)運(yùn)用，會(huì)有比較多的副反應(yīng)，但是探討表明假如在

活化過程中添加HOBt,HOAt等試劑，可以將其副反應(yīng)限制在很低的范

圍。其反應(yīng)機(jī)理如下:

圖2DIC活化反應(yīng)機(jī)理

1.2.2,^鹽型

鹽型縮合試劑反應(yīng)活性高,速度快，現(xiàn)在運(yùn)用特別廣泛，主要包括：HBTU,

TBTU,HATU,PyBOP等。該試劑運(yùn)用過程中須要添加有機(jī)堿，如，二

異丙基乙胺(DIEA),N-甲基嗎琳(NMM),該試劑加入后，才能活化

氨基酸。其反應(yīng)機(jī)理如下：

圖3TBTU活化反應(yīng)機(jī)理

1.3.多肽合成方法比較

1.3.1.液相多肽合成(solutionphasesynthesis)

液相多肽合成現(xiàn)在仍舊廣泛的運(yùn)用，在合成短肽和多肽片段上具有合成規(guī)

模大，合成成本低的顯著優(yōu)點(diǎn)，而且由于是在均相中進(jìn)行反應(yīng)，可以選擇

的反應(yīng)條件更加豐富，象一些催化氫化，堿性水解等條件，都可以運(yùn)用，

這在固相中，運(yùn)用卻由于反應(yīng)效率低，以與副反應(yīng)等緣由，無法應(yīng)用。液

相多肽合成中主要采納BOC和Z兩種反應(yīng)策略。

0

H2N-CH^-O,

M、

10j。一o

—L-O-^-H-CHC-N-CH^-O

I加加,

射

6=0DCC

?。。彷

A

1NaObiMeOH

2HCI>H0Ac

,

4—OH

盥LoAarv

dH2口

圖4液相合成Glu-Trp

1.3.2.固相多肽合成

1DIEA

2.20%Pip<DMF

1.DIC/H0B!

220%P腹CMF

H^N-CH^-H-CHS-OH

Olu-Trp

圖5FMOC固相合成Ghi-Trp

固相多肽合成現(xiàn)在運(yùn)用的主要有兩種策略：BOC和FMOC兩種。BOC

方法合成過程中，須要反復(fù)運(yùn)用TFA脫BOC,而且在最終從樹脂上切割

下來須要運(yùn)用HF,由于HF必需運(yùn)用特地的儀器進(jìn)行操作，而且切割過

程中簡潔產(chǎn)生副反應(yīng)，因此現(xiàn)在運(yùn)用受到試驗(yàn)條件限制，運(yùn)用也漸漸削減。

FMOC方法反應(yīng)條件溫柔，在一般的試驗(yàn)條件下就可以進(jìn)行合成，因此,

也得到了特別廣泛的應(yīng)用。

1.3.2.1.固相合成中常用樹脂

固相合成中樹脂，一般都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料，大小在75-150Mm,

交聯(lián)度在1-2%之間，現(xiàn)在運(yùn)用的大多是1%,因?yàn)檫@種交聯(lián)度下，樹脂

在DMF,DCM中具有很好的溶脹性能，立體上是一個(gè)空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，反

應(yīng)物分子可以在樹脂內(nèi)部自由移動(dòng)。樹脂中最關(guān)鍵的部分是連接手臂，它

一端連接在樹脂上，一端作為反應(yīng)位點(diǎn)。目前廣泛運(yùn)用的樹脂有：PAM,

MBHA,Wang,2-Cl-Trt,Rink-Amide-MBHA等。其中PAM,MBHA

是用在BOC策略中，因?yàn)槠鋵?duì)酸特別穩(wěn)定，須要在HF,TFMSA等強(qiáng)酸

條件下才能夠切割下來。

PAMRmk-Amtde

圖6固相合成常用樹脂

1.3.2.2.筋三酮檢測(cè)

固相多肽合成中，主要是通過檢測(cè)樹脂上游離氨基來推斷連接效率，檢測(cè)

方法稱為Kaiser方法，其檢測(cè)結(jié)果，假如有游離氨基的時(shí)候，顯示蘭色，

或紅褐色(pro,ser,His)。

Kaiser試劑包括：

A,6%前三酮的乙醇溶液

B,80%苯酚的乙醛溶液

C,2%0.001MKCN的毗I定溶液

配制中的叱咤須要經(jīng)過苛三酮處理后，重蒸后再運(yùn)用。檢測(cè)過程，取少量

樹脂，加入A,B,C各2-3滴，100C下加熱l?2min,假如溶液有蘭

色，或樹脂出現(xiàn)蘭色，紅褐色，表明還有游離氨基，否則說明連接完全。

還有其它檢測(cè)游離氨基的方法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，澳芬蘭法等。

圖7黃三酮檢測(cè)原理

1.3.2.3.固相合成切割方法

固相合成完成之后，必需選擇合適的切割試劑將多肽從樹脂上切割下來,

然后經(jīng)過冰乙酸沉淀，離心收集沉淀，經(jīng)過HPLC分別純化，冷凍干燥得

到最終產(chǎn)品。由于選擇的樹脂不同，氨基酸序列不同，在切割時(shí)候，選擇

的切割方法也不完全相同，一般都是選擇酸性條件下切割的條件，對(duì)于

PAM,MBHA樹脂，一般采納HF切割，切割過程中須要添加對(duì)甲苯酚，

對(duì)瑞基苯酚，苯甲健等試劑。而對(duì)于Wang,Rink-Amide,Trt樹脂，一

般采納TFA切割，切割過程中加入，乙二硫醇，苯甲硫雄，水，三異丙基

硅烷，苯酚等。這些添加試劑主要作為碳正離子俘獲試劑運(yùn)用，目的是俘

獲切割反應(yīng)過程中生成的碳正離子，削減這些碳正離子對(duì)部分氨基酸側(cè)鏈

的進(jìn)攻導(dǎo)致的副反應(yīng)，比較簡潔產(chǎn)生副反應(yīng)的氨基酸有：Trp,Tyro切割

試劑用量一般10-15ml/g樹脂。常用的切割配比：

HF/p-cresol/p-thiocresol(90/5/5),TFA/TIS/EDT/H2O

(94/1/2.5/2.5),反應(yīng)一般是在室溫條件下2h-4h。

1.3.3.多肽合成中主要問題

1.3.3.1.消旋與其反應(yīng)機(jī)理

多肽合成過程中，部分氨基酸在活化的過程中會(huì)導(dǎo)致不同程度的消旋，特

殊簡潔消旋的氨基酸有：Cys,His,Phe,當(dāng)然這些消旋化還和溶劑，溫

度以與合成中的有機(jī)堿等因素有關(guān)。對(duì)于這些氨基酸，可以通過采納高效

縮合試劑，削減反應(yīng)時(shí)間，可以削減消旋的比例，一般條件選擇適當(dāng)，消

旋化都可以限制在5%以內(nèi)。消旋反應(yīng)機(jī)理如下：

圖8消旋反應(yīng)機(jī)理

1.3.3.2,二酮哌嗪(DKP)反應(yīng)

DKP副反應(yīng)出現(xiàn)在FMOC-Wang樹脂合成過程中，主要出現(xiàn)在第一個(gè)氨

基酸為Pro的時(shí)候，當(dāng)其次個(gè)負(fù)基酸脫FMOC的時(shí)候，a-氨基被游離出

來之后，馬上對(duì)Wang樹脂的節(jié)酯鍵進(jìn)行分子內(nèi)胺解，生成六元環(huán)二酮哌

嗪衍生物，同時(shí)從Wang樹脂上釋放出來，導(dǎo)致反應(yīng)終止。該反應(yīng)特別快

速，文獻(xiàn)報(bào)道采納50%Pip/DMF,脫Imin,4min的條件，但是我們?cè)?/p>

驗(yàn)證明在多數(shù)狀況下，即使是lmin左右反應(yīng)就超過了20%o因此一般在

末端第一個(gè)氨基酸為Pr。的時(shí)候，建議采納2-Cl-Trt樹脂合成，由于該

樹脂巨大的空間阻力，可以完全消退該副反應(yīng)。這個(gè)副反應(yīng)在BOC策略

合成過程中，卻可以完全避開，因?yàn)锽OC在運(yùn)用TFA脫除后，使氨基以

TFA鹽的形式存在，從而失去了親核性，不能進(jìn)攻芳酯鍵。

圖9DKP反應(yīng)機(jī)理

1.3.3.3.困難序列多肽合成

固相多肽合成中也常常遇到多肽合成失敗或合成效率很低的問題，這里面

的主要緣由是由于多肽序列引起的，因?yàn)橛行┒嚯男蛄性跇渲闲纬蒔-

折疊，變更了樹脂的溶脹性能，還有可能將反應(yīng)的活性位點(diǎn)埋藏在樹脂里

面，這樣使得反應(yīng)很難進(jìn)行，目前報(bào)道運(yùn)用的主要方法有：

?運(yùn)用混合溶劑，DMSO/DMF,6N朋噬/DMF溶液

?提高反應(yīng)溫度，或采納微波方法

?運(yùn)用高離液鹽，LiCl,NaClO4等。

?運(yùn)用溶脹性能更好的PEG-PS樹脂，同時(shí)削減樹脂擔(dān)載量

(0.05-0.2mmol/g)

1.4.合成多肽分析鑒定方法

多肽的分析鑒定方法有多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定，多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)包括:

質(zhì)譜分析，氨基酸組成分析，氨基酸序列分析。二級(jí)結(jié)構(gòu)包括：圓二色譜

(CD),NMR,X-衍射等方法。

1.4.1.純度分析

多肽的純度分析，一般都采納HPLC進(jìn)行分析，選擇RP-C18,粒徑5|uni,

孔徑300A,4.6X150mm,流淌相：A,0.1%TFA/H2O;B,0.1%

TFA/ACN,洗脫梯度，5%B-65%B,時(shí)間30min。也有些多肽，特殊

是短肽，由于親水性強(qiáng)，在C18上保留很弱，須要變更條件，這里主要

有兩種方法：一個(gè)變更分析梯度，可以將起始梯度改為2%,等度或小梯

度洗脫；另外一個(gè)方法是在流淌相中加入強(qiáng)離子對(duì)試劑，如七氟丁酸，十

八烷基磺酸鈉等。

1.4.2.一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

1.4.2.1.質(zhì)譜分析

質(zhì)譜分析的目的主要是確證分子量，當(dāng)然采納MS/MS可以部分的了解多

肽序列的信息，但是這個(gè)須要比較全的數(shù)據(jù)庫作為基礎(chǔ)，分析才能比較精

確。由于多肽性質(zhì)不穩(wěn)定，須要采納軟電離技術(shù)，目前多肽分析主要運(yùn)用

了電噴霧(ESI-MS),基質(zhì)協(xié)助激光解吸(MALDI-MS)。其中ESI-MS

通常會(huì)給出多電荷峰，電荷數(shù)目和多肽序列上氨基，服基，咪哇基的數(shù)目

有關(guān)，因此，常常給出了雙電荷，三電荷等離子峰『MALDI-MS可以分

析蛋白大分子，而且通常狀況下很少帶多電荷，因此數(shù)據(jù)干脆對(duì)應(yīng)了分子

離子峰，簡潔分析。此外，通常在分析長肽或蛋白過程中，須要添加NH4,

Na,K等離子，提高靈敏度，所以一般在MS中出現(xiàn)一組峰，分別對(duì)應(yīng):

(M+H)+,(M+NH4)+,(M+Na)+,(M+K)+。

1.4.2.2.氨基酸組成分析

氨基酸組成分析一般須要產(chǎn)品的純度較高，它可以給出多肽中氨基酸的種

類，數(shù)目。分析過程首先通過酸水解破壞肽鍵，典型酸水解的條件是：真

空條件下，110℃,用6M鹽酸水解16至72小時(shí)。酸水解雖然很有用,

但酸水解條件下不能獲得完整的氨基酸分析，因?yàn)樘於０泛凸劝滨０返?/p>

側(cè)鏈含有酰胺鍵，用于切斷蛋白質(zhì)肽鍵的酸也可以將天冬酰胺轉(zhuǎn)換為天冬

氨酸，谷氨酰胺轉(zhuǎn)換為谷氨酸。由于水解溫度比較高，色氨酸的呼噪環(huán)簡

潔被空氣氧化，即使在密封的管中，色氨酸的呼I味環(huán)也幾乎都被破壞了。

因此蛋白質(zhì)的色氨酸含量往往是通過它的紫外汲取光譜估計(jì)的，也可以通

過堿水解分析色氨酸的含量。半胱氨酸在酸水解中也不能精確測(cè)定，要精

確測(cè)量須要在蛋白質(zhì)水解之前進(jìn)行氧化或竣甲基化，形成的衍生物在酸水

解之后才能定量。

1.4.2.3.氨基酸序列分析

氨基酸序列分析的基木原理是Edman降解，主要涉與耦聯(lián)、水解、萃取

和轉(zhuǎn)換等4個(gè)過程。首先運(yùn)用苯異硫劄酸酯(PITC)在pH9.。的堿性條

件下對(duì)蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行處理，PITC與肽鏈的N-端的氨基酸殘基反應(yīng)，

形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物，即PTC-肽。然后PTC-肽用三氟乙酸

處理，N-端氨基酸殘基肽鍵被有選擇地切斷，釋放出該氨基酸殘基的唾理

咻酮苯胺衍生物。接下來將該衍生物用有機(jī)溶劑(例如氯丁烷)從反應(yīng)液

中萃取出來，而去掉了一個(gè)N-端氨基酸殘基的肽仍留在溶液中。萃取出來

的唾座咻酮苯胺衍生物不穩(wěn)定，經(jīng)酸作用，再進(jìn)一步環(huán)化，形成一個(gè)穩(wěn)定

的苯乙內(nèi)酰硫版(PTH)衍生物，即PTH-氨基酸。留在溶液中的削減了

一個(gè)氨基酸殘基的肽再重復(fù)進(jìn)行上述反應(yīng)過程，整個(gè)測(cè)序過程現(xiàn)在都是通

過測(cè)序儀自動(dòng)進(jìn)行。

1.4.3.二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

1.4.3.1.圓二色譜(CD)

圓二色譜是一種特殊的汲取譜，它通過測(cè)量蛋白質(zhì)等生物大分子的圓二色

光譜，從而得到生物大分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，簡潔、快捷，廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)

折疊，蛋白質(zhì)構(gòu)象探討，的動(dòng)力學(xué)等領(lǐng)域。圓二色譜紫外區(qū)段

(190-240nm),主要生色團(tuán)是肽鏈，這一波長范圍的CD譜包含了生

物大分子主鏈構(gòu)象的信息。a-螺旋構(gòu)象的CD譜在222nm、208nm處

呈負(fù)峰，在190nm旁邊有一正峰。0-折疊構(gòu)象的CD譜，在217-218nm

處有一負(fù)峰，在195-198nm處有一強(qiáng)的正峰。無規(guī)則卷曲構(gòu)象的CD譜

在198nm旁邊有一負(fù)峰，在220nm旁邊有一小而寬的正峰。

1.4.3.2.核磁共振(NMR)

隨著二維、三維以與四維NMR的應(yīng)用，分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)處理技術(shù)的

發(fā)展,使NMR漸漸成為大分子結(jié)構(gòu)物質(zhì)分析的主要方法之一。NMR可

用于確定氨基酸序列、分布以與構(gòu)象。目前，NMR在分析分子中含少于

30個(gè)氨基酸的小肽時(shí)是特別有用的，分析結(jié)果快速精確。

1.4.3.3.X-衍射

X-衍射可獲得有關(guān)化合物晶型的干脆信息，而且可以推斷相對(duì)與肯定構(gòu)型。

?多肽標(biāo)記與修飾

目前多肽標(biāo)記與修飾的內(nèi)容特別多，廣泛應(yīng)用在多肽藥物，多肽生物學(xué)，

多肽抗體以與多肽試劑的探討中。目前應(yīng)用廣泛的有：非放射性核素標(biāo)記

(C13,H2),熒光標(biāo)記(FAM,FITC),生物素標(biāo)記，磷酸化修飾等。

2.1.非放射性核素標(biāo)記

目前在非放射性核素標(biāo)記中，運(yùn)用廣泛的仍舊是C13,H2,因?yàn)槠溥\(yùn)用

平安，放射性小?，F(xiàn)在有比較完全的非放射性標(biāo)記的氨基酸，可以依據(jù)正

常的多肽合成方法將標(biāo)記好的氨基酸干脆連接到多肽上。

2.2.熒光標(biāo)記

熒光標(biāo)記由于沒有放射性，試驗(yàn)操作簡潔。因此，目前在生物學(xué)探討中熒

光標(biāo)記應(yīng)用特別廣泛，熒光標(biāo)記方法與熒光試劑的結(jié)構(gòu)有關(guān)系，對(duì)于有游

離竣基的采納的方法與接肽反應(yīng)相同，也采納HBTU/HOBt/DIEA方法

連接。但是對(duì)于FITC標(biāo)記，須要在連接FITC前，增加一個(gè)氨基己酸，

避開在切割的過程中被TFA切割掉。

2.3.生物素標(biāo)記

生物素-親合素系統(tǒng)(biotin-avidinsystem,BAS),是7。年頭后期應(yīng)用

于免疫學(xué)，并得到快速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。由于它具有生

物素與親合素之間高度親和力與多級(jí)放大效應(yīng)，并與熒光素、酶、同位素

等免疫標(biāo)記技術(shù)有機(jī)地結(jié)合，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進(jìn)一

步提高。主要有用于標(biāo)記多肽敏基的生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(BNHS)

和生物素對(duì)硝基酚酯(pBNP),其中以BNHS最常用，當(dāng)然，也可以干脆

運(yùn)用生物素也可以標(biāo)記，因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)上有個(gè)游離的竣基，采納

HBTU/HOBt/DIEA方法縮合，由于生物素的溶解度低，運(yùn)用

DMSO/DMF的混合溶劑增加溶解度。

2.4.磷酸肽合成

磷酸肽在生命過程中發(fā)揮重要作用，磷酸化的位置在多肽上的Ser,Thr,

Tyro目前磷酸肽合成一般都采納磷酸化氨基酸，目前運(yùn)用的都是單葦基

磷酸化氨基酸，Tyr也可以干脆運(yùn)用磷酸化募基酸。磷酸化氨基酸的連接

一般采納HBTU/HOBt/DIEA方法，但是目前采納該方法合成磷酸化也

有缺點(diǎn)，特殊是在合成多磷酸化多肽或長肽的時(shí)候，連接效率低，最終產(chǎn)

品純度很低，對(duì)于這種磷酸化多肽，我們考慮采納后磷酸化方法，其合成

過程就是在多肽合成結(jié)束后，選擇性脫去要標(biāo)記的氨基酸的側(cè)鏈愛護(hù)基,

對(duì)于Tyr,Thr可以干脆運(yùn)用側(cè)鏈不愛護(hù)的氨基酸進(jìn)行反應(yīng)，而Ser可以

采納Fmoc-Ser(trt),在1%TFA/DCM條件下可以定量的脫除。后

磷酸化，采納雙茉基亞磷酰胺，四氮?座生成亞磷酰胺四喋活性中間體，連

接到羥基上，隨后在過氧酸下氧化生成磷?；?，完成反應(yīng)。

?蛋白結(jié)構(gòu)與功能模擬多肽

多肽在與蛋白受體結(jié)合發(fā)揮功能的時(shí)候，總是先折疊出某些特殊的結(jié)構(gòu),

多肽類似物合成主要是為了模擬這些結(jié)構(gòu)，保持或提高生物活性，同時(shí)也

為了變更多肽的穩(wěn)定性，提高其抗酶解實(shí)力。

3.1.a-螺旋多肽

Q-螺旋是蛋白結(jié)構(gòu)中最為一般的一種，但是一般多肽在溶液中大多是無規(guī)

卷曲的，目前運(yùn)用最多的方法是多肽保持Q-螺旋結(jié)構(gòu)就是在多肽表面通過

共價(jià)鍵將處在Q-螺旋結(jié)構(gòu)的兩個(gè)氨基酸連接起來，選擇的位點(diǎn)(i,i+4或

i,i+7),選擇的化學(xué)鍵包括：二硫鍵，硫酸鍵，酰胺鍵，烯燃鍵(RCM)

等方法。

3.1.1.二硫鍵

二硫鍵廣泛存在與蛋白結(jié)構(gòu)中，對(duì)穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)具有特別重要的意義，二

硫鍵一般是通過序列中的2個(gè)Cys的疏基，經(jīng)氧化形成。形成二硫鍵的方

法很多：空氣氧化法，DMSO氧化法，過氧化氫氧化法等。二硫鍵的合成

過程，可以通過Ellman檢測(cè)以與HPLC檢測(cè)方法對(duì)其反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

3.1.2.硫醒鍵

硫醮鍵的形成可以通過序列中的Lys,將濱乙酸連接到Lys的側(cè)鏈氨基上,

利用其和硫基的特異性反應(yīng)，反應(yīng)在緩沖溶液中進(jìn)行，快速高效。

3.1.3.酰胺鍵

多肽的內(nèi)酰胺環(huán)肽的合成一般是利用Lys,Asp(Glu)的選擇性愛護(hù)，

在固相上干脆環(huán)化。BOC策略中可以采納BOC-Lys(Fmoc),BOC-Asp

(OFm),FMOC策略中可以采納FMOC-Lys(Aloe),FMOC-Asp

(Allyl)o對(duì)于首尾環(huán)肽，還可以先合成愛護(hù)的多肽，然后在液相中環(huán)化

生成目標(biāo)多肽。

3.1.4.烯妙鍵(RCM)

RCM反應(yīng)是一個(gè)過渡金屬催化反應(yīng)，其反應(yīng)中運(yùn)用催化劑:

(Cy3P)2C12Ru=CHPh,可以催化烯燃環(huán)化，過程中脫去一分子乙烯。

Fmoc-X-Resin

I120%pip/DMF

|2.Fmoc-X1/HBTU/HOBtDIEA

Xn-X-Resin

(Cy3P)2C12Ru=CHPh,

DCM,reflux

Xn-X-Resin

1.cleavagereag