中科大現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)課件第4章 細(xì)胞工程

第四章細(xì)胞工程

教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)、學(xué)時(shí)一、概述二、不同對(duì)象的細(xì)胞工程（一）微生物細(xì)胞工程（二）植物細(xì)胞工程（三）動(dòng)物細(xì)胞工程三、細(xì)胞工程在環(huán)境方面的應(yīng)用1、要點(diǎn)細(xì)胞工程基礎(chǔ)知識(shí)、微生物細(xì)胞工程、植物細(xì)胞工程、動(dòng)物細(xì)胞工程、利用細(xì)胞融合技術(shù)構(gòu)建環(huán)境工程菌、抗污染型植物2、重點(diǎn)細(xì)胞工程的定義、微生物細(xì)胞融合、植物組織培養(yǎng)、植物原生質(zhì)體制備、培養(yǎng)和融合、動(dòng)物細(xì)胞融合、單克隆抗體的制備、細(xì)胞拆合3、學(xué)時(shí)5學(xué)時(shí)教學(xué)要點(diǎn)、重點(diǎn)、學(xué)時(shí)一、概述（一）細(xì)胞工程相關(guān)名詞1、細(xì)胞是生物體的基本結(jié)構(gòu)單位和功能單位，單細(xì)胞生物，一個(gè)細(xì)胞就是一個(gè)個(gè)體，而多細(xì)胞生物則由許多細(xì)胞成一個(gè)個(gè)體。2、細(xì)胞工程：是指在細(xì)胞水平上的遺傳操作，即通過細(xì)胞融合、核質(zhì)移植、染色體或基因移植以及組織和細(xì)胞培養(yǎng)等方法，快速繁殖和培養(yǎng)出人們所需要的新物種的技術(shù)。

3、

細(xì)胞融合：是用自然或人工的方法使兩個(gè)或幾個(gè)不同細(xì)胞融合的為一個(gè)細(xì)胞（含有原來兩個(gè)細(xì)胞的染色體）的過程。4、細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)移植是指將細(xì)胞的亞結(jié)構(gòu)（如細(xì)胞核、染色體等）移植到另一個(gè)細(xì)胞中，從而改變細(xì)胞的遺傳性狀。主要有細(xì)胞拆合、染色體工程和染色體組工程。5、細(xì)胞拆合：即細(xì)胞換核技術(shù)。是通過物理或化學(xué)方法將細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核分開，再進(jìn)行不同細(xì)胞間核質(zhì)的重新組合，重建成新細(xì)胞。6、染色體工程:染色體工程是按人們需要來添加或削減一種生物的染色體，或用別的生物的染色體來替換。7、染色體組工程:染色體組工程是整個(gè)改變?nèi)旧w組數(shù)的技術(shù)。自從1937年秋水仙素用于生物學(xué)后，多倍體的工作得到了迅速發(fā)展，例如得到四倍體小麥，八倍體小黑麥等。三倍體西瓜是無籽西瓜，但沒有后代。一、概述8、雜交瘤細(xì)胞：現(xiàn)代免疫學(xué)早已查明，一種抗體是由一種B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的，人體內(nèi)約有一億種不同的B淋巴細(xì)胞，可產(chǎn)生一億種不同的抗體。依據(jù)這種事實(shí)，1975年，著名免疫學(xué)家米爾斯坦和同事勒爾在英國劍橋大學(xué)分子實(shí)驗(yàn)室內(nèi)巧妙地把B淋巴細(xì)胞和能無限生長的骨髓細(xì)胞合并成一個(gè)雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞因而具備了雙重特性：既能無限生長，又能產(chǎn)生B淋巴細(xì)胞的抗體。9、單克隆抗體：被人們譽(yù)為對(duì)付癌癥的“生物導(dǎo)彈”。如果能選出一個(gè)制造一種專一抗體的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群，即單克隆。單克隆細(xì)胞將合成一種決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。

一、概述10、干細(xì)胞是一種具有多項(xiàng)分化潛能和自我復(fù)制能力的原始未分化細(xì)胞，是形成哺乳類各種組織器官的祖宗細(xì)胞。根據(jù)來源和個(gè)體發(fā)育過程中先后次序不同，干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞／組織干細(xì)胞。11、虛擬細(xì)胞：是一個(gè)模擬的細(xì)胞。從短期來說，虛擬細(xì)胞可用于設(shè)計(jì)新的藥物和治療方法。人們可以利用模擬技術(shù)測試不同的治療方法，以發(fā)現(xiàn)最佳方案，并研究每種方案可能產(chǎn)生的副反應(yīng)。從長期來說，虛擬細(xì)胞可被用于設(shè)計(jì)更好的生物學(xué)系統(tǒng)，甚至創(chuàng)造全新的系統(tǒng)。另外，模擬技術(shù)還可用于測試不同的變異，以找出表現(xiàn)最好的那些生物性狀。

一、概述12、愈傷組織：是指植物組織地離體狀態(tài)下，給以一定條件，使已經(jīng)分化并停止生長的細(xì)胞重新分裂生長而形成的沒有組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)。13、細(xì)胞學(xué)說：一切動(dòng)物和植物都是細(xì)胞的集合體，細(xì)胞是生命的基本單位，動(dòng)物和植物都是在細(xì)胞的繁殖和分化中發(fā)育起來的。這一認(rèn)識(shí)被稱為細(xì)胞學(xué)說。14、植物細(xì)胞全能假說：植物體的每一個(gè)細(xì)胞，包括體細(xì)胞，都具有發(fā)育成整個(gè)個(gè)體的潛能。一、概述（二）細(xì)胞工程的分類1、按研究對(duì)象中需要改造的遺傳物質(zhì)不同，將細(xì)胞工程分為基因工程（geneengineering）、染色體工程（chromosomeengineering）、染色體組工程（genomeengineering）、細(xì)胞質(zhì)工程（cytoplasmengineering）和細(xì)胞融合等五個(gè)方面。這個(gè)范圍相當(dāng)廣泛，幾乎包括了所有的細(xì)胞操作和遺傳操作。2、細(xì)胞工程按其對(duì)象不同，也可分為微生物細(xì)胞工程、植物細(xì)胞工程和動(dòng)物細(xì)胞工程。本章將主要介紹動(dòng)物細(xì)胞工程。一、概述（三）細(xì)胞1、細(xì)胞的大小與形態(tài)一、概述各類細(xì)胞大小的比較一、概述

體內(nèi)最大的細(xì)胞

體內(nèi)最大的細(xì)胞有各種說法：（1）按細(xì)胞直徑而言，要數(shù)卵細(xì)胞，其直徑約200微米（1微米＝1/1000毫米）。（2）以細(xì)胞長度來說，當(dāng)之為骨骼肌細(xì)胞，長的可超過4厘米。（3）而以細(xì)胞突出的長度來劃分，當(dāng)之無愧的是神經(jīng)細(xì)胞（也稱神經(jīng)元）。神經(jīng)元的軸突長的可達(dá)1米以上。故神經(jīng)元可稱之為體內(nèi)最大的細(xì)胞了。它們的活動(dòng)受機(jī)體神經(jīng)體液因素的調(diào)節(jié)。

線粒體最多的細(xì)胞

：人體內(nèi)線粒體最多的細(xì)胞是肝臟的肝細(xì)胞。每一個(gè)肝細(xì)胞內(nèi)約有2000個(gè)線粒體。

溶酶體最多的細(xì)胞：最多要數(shù)巨噬細(xì)胞，溶酶體內(nèi)含有50多種水解酶。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)最多的細(xì)胞

：漿細(xì)胞是含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)最多的細(xì)胞。漿細(xì)胞是由B淋巴細(xì)胞在抗原刺激下分化增生而來的，是一種不再具有增殖分化能力的終末細(xì)胞。

壽命最長的細(xì)胞

：神經(jīng)細(xì)胞的壽命最長。細(xì)胞形態(tài)的多樣性酵母菌植物纖維細(xì)胞植物表皮細(xì)胞動(dòng)物精子一、概述2、細(xì)胞的結(jié)構(gòu)

無論各種細(xì)胞的大小和形態(tài)有多大的差異，它們都由一層具有一定生物學(xué)功能的細(xì)胞膜包裹在細(xì)胞外層。

根據(jù)細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，可將生物界的細(xì)胞分為兩大類：原核細(xì)胞和真核細(xì)胞

細(xì)菌、藍(lán)藻和放線菌等由原核細(xì)胞構(gòu)成的有機(jī)體稱為原核生物，幾乎所有的原核生物都由單個(gè)原核細(xì)胞構(gòu)成，而由真核細(xì)胞構(gòu)成的有機(jī)體則稱為真核生物。(1)原核細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)基本特點(diǎn)：A.主染色體為一個(gè)環(huán)狀裸露DNAB.無核膜

C.無膜系構(gòu)造細(xì)胞器

D.以無絲分裂繁殖主要代表：細(xì)菌、

藍(lán)藻等一、概述纖毛細(xì)胞壁擬核鞭毛核糖體質(zhì)膜內(nèi)含物細(xì)菌結(jié)構(gòu)模式圖一、概述(2)真核細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)三大結(jié)構(gòu)體系：

生物膜系統(tǒng)質(zhì)膜、內(nèi)膜系統(tǒng)（細(xì)胞器）

遺傳信息表達(dá)系統(tǒng)染色質(zhì)(體)、核糖體、

mRNA、tRNA等

細(xì)胞骨架系統(tǒng)胞質(zhì)骨架、核骨架一、概述微絲葉綠體線粒體質(zhì)膜液泡細(xì)胞核內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微管細(xì)胞壁高爾基體植物細(xì)胞模式圖動(dòng)物細(xì)胞模式圖微絲微管質(zhì)膜線粒體中心體細(xì)胞核溶酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體(1)無絲分裂——無紡錘絲出現(xiàn)，染色體（DNA）復(fù)制后直接移到兩個(gè)仔細(xì)胞中。(2)細(xì)胞增殖周期（有絲分裂）G0期：休眠期G1期：DNA合成前期

S期：DNA合成期

G2期:DNA合成后期

M期：有絲分裂期3、細(xì)胞的分裂和分化①細(xì)胞分裂間期②有絲分裂期前期中期后期末期子細(xì)胞分為G1期、S期和G2期三個(gè)階段。新生細(xì)胞的去向：重新進(jìn)入細(xì)胞周期、細(xì)胞分化成為Go期細(xì)胞(3)細(xì)胞分化

多細(xì)胞生物體是由各種各樣形態(tài)和功能都不同的細(xì)胞群所組成。高等動(dòng)、植物由受精卵細(xì)胞開始的胚胎發(fā)生過程隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加而使得早期胚胎的細(xì)胞數(shù)量也增加許多。其中有些細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上逐漸發(fā)生了差異，這種細(xì)胞之間差異的發(fā)生過程就是細(xì)胞分化。個(gè)體發(fā)育的過程就是細(xì)胞分化的過程，個(gè)體的各種器官和組織都是通過細(xì)胞分化形成的。

一、概述4、癌細(xì)胞癌細(xì)胞的主要特征1.脫分化：已分化細(xì)胞失去分化后的特性，恢復(fù)分裂增殖能力。2.無限增殖3.失去接觸抑制現(xiàn)象4.細(xì)胞表面和粘附性質(zhì)改變5.細(xì)胞骨架紊亂6.對(duì)生長因子需求降低一、概述二、不同對(duì)象的細(xì)胞工程

（一）微生物細(xì)胞工程

1、

定義：微生物細(xì)胞工程應(yīng)用微生物進(jìn)行細(xì)胞水平的研究與生產(chǎn)，具體內(nèi)容包括各種微生物細(xì)胞的培養(yǎng)、遺傳性狀的改造、微生物細(xì)胞的直接利用或獲得細(xì)胞代謝產(chǎn)物等。2、細(xì)胞融合基本過程原生質(zhì)體的制備→融合重組→原生質(zhì)體再生成細(xì)胞→融合重組的測定

（1）原生質(zhì)體的制備酶解法質(zhì)生質(zhì)體的形成率＝原生質(zhì)體數(shù)/未經(jīng)酶處理的總菌數(shù)。①革蘭氏陽性菌：溶菌酶，肽聚糖中N－乙酰胞壁酸與N－乙酰葡萄糖胺之間的β－1,4－糖苷鍵

②革蘭氏陰性菌：溶菌酶+(數(shù)分鐘后）0.1mol/L的EDTA共同作用15－20min，則可使90%以上的革蘭氏陰性菌轉(zhuǎn)變?yōu)榭晒┘?xì)胞融合用的球狀體。③真核細(xì)胞：消解酶、蝸牛酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶等處理，原生質(zhì)體得率在90%以上。二、不同對(duì)象的細(xì)胞工程

注意：原生質(zhì)體制備后必須用滲透壓穩(wěn)定劑維持其穩(wěn)定性。（2）融合重組

p146圖4－6注意：原生質(zhì)體融合重組作為基因聲稱的一種有效方法，需經(jīng)歷三個(gè)主要階段：細(xì)胞融合形成異核體、不同核融合產(chǎn)生二倍體、融合核交換和重組生成重組體（3）原生質(zhì)體再生成細(xì)胞

二、不同對(duì)象的細(xì)胞工程置于高滲再手固體培養(yǎng)基中。再生頻率＝（原生質(zhì)體再生細(xì)胞數(shù)/總菌落數(shù)）×100%(主要是利用原生質(zhì)體對(duì)滲透壓的敏感性）（4）融合重組的測定

①直接法：不補(bǔ)充兩親株生長所需營養(yǎng)物或補(bǔ)充兩種藥物

②間接法:親株和重組子都再生，然后用影印法復(fù)制到選擇培養(yǎng)基上以檢出重組子。融合頻率＝融合子數(shù)/再生的原生質(zhì)體數(shù)二、不同對(duì)象的細(xì)胞工程二、不同對(duì)象的細(xì)胞工程（二）植物細(xì)胞工程1、定義:p1482、植物組織培養(yǎng)（1）植物組織培養(yǎng)：是一種將植物組織、器官或細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上進(jìn)行無菌培養(yǎng)，并重新再生細(xì)胞或植株的技術(shù)，包括植物培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)外植體愈傷組織新植株植物組織培養(yǎng)二、不同對(duì)象的細(xì)胞工程(2)進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，一般要經(jīng)歷以下五個(gè)階段：

a外植體的選擇及培養(yǎng)。

b誘導(dǎo)去分化階段。

c繼代增殖階段。

d誘導(dǎo)分化生根成芽階段。

e移栽成活階段。3、植物細(xì)胞培養(yǎng)二、不同對(duì)象的細(xì)胞工程單個(gè)細(xì)胞營養(yǎng)培養(yǎng)基克隆植株工業(yè)化植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)主要有兩大類：懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和固定化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

4、植物細(xì)胞雜交1960年英國諾丁漢大學(xué)Cocking教授領(lǐng)導(dǎo)的小組率先利用真菌纖維素酶，成功地制備出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根細(xì)胞原生質(zhì)體,開辟了原生質(zhì)體融合研究的新階段。

植物細(xì)胞雜交的主要過程如下：(1)原生質(zhì)體的制備：機(jī)械法與酶法

(2)原生質(zhì)體的融合：物理方法與化學(xué)法

；膜融合與核融合

二、不同對(duì)象的細(xì)胞工程

(3)雜合體的鑒別與篩選：顯微鏡、互補(bǔ)法、細(xì)胞與分子生物學(xué)法注：原生質(zhì)體培養(yǎng)過程：脫去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體→

細(xì)胞壁再生→細(xì)胞分裂形成細(xì)胞團(tuán)→愈傷組織→分化形成芽和根→完整植株二、不同對(duì)象的細(xì)胞工程細(xì)胞育種

誘導(dǎo)突變，篩選新品系、新品種次生代謝產(chǎn)物生成

從培養(yǎng)的植物細(xì)胞中提取所需的代謝產(chǎn)物。優(yōu)點(diǎn)

比栽培原料作物更易控制最佳生產(chǎn)條件；

培養(yǎng)物為無菌、無蟲材料，能保證產(chǎn)品質(zhì)量；

工藝操作較為簡單，可減少勞動(dòng)費(fèi)用，提高生產(chǎn)率。5、植物細(xì)胞工程的應(yīng)用二、不同對(duì)象的細(xì)胞工程（三）動(dòng)物細(xì)胞工程1、定義:p1572、動(dòng)物組織培養(yǎng)：是指將取自動(dòng)物的某類組織，在體外培養(yǎng)并一直保持原本已分化的特性，該組織的結(jié)構(gòu)與功能持續(xù)不發(fā)生明顯變化。3、細(xì)胞培養(yǎng)：是指離體細(xì)胞在無菌培養(yǎng)條件下的分裂、生長。在整個(gè)培養(yǎng)過程中細(xì)胞不出現(xiàn)分化，不再形成組織?？煞謶腋⌒秃唾N附型。4、動(dòng)物細(xì)胞雜交（1）融合方法：病毒誘導(dǎo)融合、化學(xué)誘導(dǎo)融合、電激誘導(dǎo)融合二、不同對(duì)象的細(xì)胞工程（2）篩選形成五種類型的細(xì)胞：異型融合細(xì)胞（雙核、多核）、兩種同型融合細(xì)胞（雙核、多核）、未發(fā)生融合的兩種親本細(xì)胞。篩選原理：后四種不成活，多核融合細(xì)胞因核分裂受阻而死亡。

a、HAT選擇系統(tǒng)二、不同對(duì)象的細(xì)胞工程b、抗藥性選擇系統(tǒng)c、營養(yǎng)缺陷型選擇系統(tǒng)5、克?。?）定義：兩種說法，克隆是指離體條件下的無性繁殖。（2）克隆“多莉”二、不同對(duì)象的細(xì)胞工程綿羊B乳腺細(xì)胞核易核卵融合卵綿羊C子宮多莉植入植入生產(chǎn)克隆多莉羊示意圖取出未受精卵去核電激體外胚胎發(fā)育綿羊A(3)克隆意義

a遺傳素質(zhì)完全一致的克隆動(dòng)物將更有利于開展對(duì)動(dòng)物(人)生長、發(fā)育、衰老和健康等機(jī)理的研究；

b有利于大量培養(yǎng)品質(zhì)優(yōu)良的家畜;

c經(jīng)轉(zhuǎn)基因的克隆哺乳動(dòng)物，將能為人類提供源源不斷的廉價(jià)的藥品、保健品以及較易被人體接受的移植器官；

d科學(xué)家將很快地從目前的同種克隆技術(shù)推進(jìn)到異種克隆,即借腹懷胎的新領(lǐng)域,這無疑將大大促進(jìn)對(duì)瀕臨滅種的哺乳動(dòng)物的