熒光定量PCR技術(shù)簡(jiǎn)介劉偉11課件

熒光定量PCR技術(shù)簡(jiǎn)介主講：劉偉

—1—概念一檢測(cè)模式二應(yīng)用三

食品營(yíng)養(yǎng)與檢測(cè)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)

目錄頁(yè)

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食品營(yíng)養(yǎng)與檢測(cè)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)

一概念多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR：PolymeraseChainReaction)1985年，Kary.B.Mullis教授發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的PCR技術(shù)。1993年，Kary.B.Mullis因該技術(shù)的發(fā)明而獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

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循環(huán)次數(shù)DNA的鏈數(shù)

1

2122

2243

23810

210102420

220

1,048,57630

230

1,073,741,82410億

PCR特點(diǎn)：高效擴(kuò)增、忠實(shí)復(fù)制PCR技術(shù)原理

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缺憾無(wú)法對(duì)初始模板精確定量無(wú)法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增情況跑膠繁瑣、易污染常規(guī)PCR電泳鑒定

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熒光定量PCR

在體系中引入熒光染料實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增階段：指數(shù)期平臺(tái)期

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熒光定量PCR定義

是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。目的

對(duì)起始模板進(jìn)行定量?jī)?yōu)點(diǎn)

靈敏，重復(fù)性，動(dòng)態(tài)范圍寬，高通量

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普通PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR開管操作、需要后處理、易造成污染，假陽(yáng)性率高。閉管操作、無(wú)需后處理、避免了污染，防止假陽(yáng)性。PCR結(jié)束后，對(duì)終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行分析，不能定量，重復(fù)性差。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增，在指數(shù)擴(kuò)增期對(duì)起始模板進(jìn)行定量，重復(fù)性好。人工分析結(jié)果，操作復(fù)雜，存在誤差。儀器自動(dòng)分析，操作簡(jiǎn)單，增加了靈敏度和客觀性。

熒光定量PCR與普通PCR的區(qū)別

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1.SYBRGreenI2.Taqman水解探針3.分子信標(biāo)二檢測(cè)模式

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熒光定量PCR檢測(cè)模式染料標(biāo)記：

SYBRGreenI探針標(biāo)記：水解探針：

TaqMan非水解探針：Molecularbeacon

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1.SYBRGreenISYBRGreenI

是一種與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光染料。SYBRGreenI只與雙鏈DNA結(jié)合才能發(fā)出熒光。熒光信號(hào)與雙鏈DNA分子數(shù)成正比，隨著擴(kuò)增產(chǎn)物增加而增加。

熒光信號(hào)強(qiáng)度與反應(yīng)體系中所有雙鏈DNA分子成正比。

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5’3’5’3’SGSGSGSG5’3’5’3’SGSGSGSGEmissionExcitation--變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無(wú)熒光信號(hào)。--延伸結(jié)束時(shí)，采集熒光信號(hào)。

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優(yōu)點(diǎn)：

使用方便，成本低--僅需設(shè)計(jì)兩個(gè)引物通用性好--對(duì)DNA模板沒(méi)有選擇性需要在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，對(duì)產(chǎn)物做融解曲線分析。缺點(diǎn)：SYBRGreen與所有雙鏈DNA結(jié)合--引物二聚體或錯(cuò)誤擴(kuò)增產(chǎn)物造成假陽(yáng)性--只能檢測(cè)單一模板，無(wú)法進(jìn)行多重檢測(cè)

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探針與靶序列配對(duì)（一段序列，兩個(gè)基團(tuán)，5’報(bào)告基團(tuán)、3’淬滅基團(tuán)）完整的探針，報(bào)告基團(tuán)R發(fā)射的熒光被淬滅基團(tuán)Q淬滅，沒(méi)有熒光產(chǎn)生。聚合酶的5’外切酶活性報(bào)告基團(tuán)R與淬滅基團(tuán)Q分離，發(fā)射熒光。RQReporterQuencherRQ熒光信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合探針的DNA分子成正比。2.Taqman水解探針

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在退火過(guò)程中，探針與靶序列結(jié)合探針被Taq酶的5’-3’外切酶活性剪切成片斷游離報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光在延伸過(guò)程中，探針部分與靶序列分離

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Taqman特異性高--與特異靶序列結(jié)合對(duì)模板有選擇性--可進(jìn)行多重PCR反應(yīng)

SYBRGreenI使用方便，成本低--僅需設(shè)計(jì)兩個(gè)引物通用性好--對(duì)DNA模板沒(méi)有選擇性

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熒光信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合探針的DNA分子成正比。標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對(duì)序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑發(fā)夾型雜交探針

3.分子信標(biāo)

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模板不存在時(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)緊緊靠近而被淬滅。當(dāng)存在模板時(shí)，環(huán)序列將與模板配對(duì)，此時(shí)分子信標(biāo)成鏈狀而非莖環(huán)狀，熒光基團(tuán)與淬滅劑分開，使得熒光基團(tuán)發(fā)出熒光。

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高特異性：對(duì)目標(biāo)序列檢測(cè)SNP最靈敏的試劑之一熒光背景低優(yōu)點(diǎn)

只能用于一個(gè)特定目標(biāo)設(shè)計(jì)困難價(jià)格比較高缺點(diǎn)

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醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用科學(xué)研究方面的應(yīng)用公安系統(tǒng)內(nèi)的應(yīng)用動(dòng)植物檢疫考古學(xué)方面的應(yīng)用三應(yīng)用

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醫(yī)療方面的部分應(yīng)用遺傳病診斷：等位基因檢測(cè)多基因遺傳病的突變檢測(cè)基因表達(dá)異常所致遺傳病檢測(cè)

腫瘤診斷：腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)：包括癌基因抗癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移基因及轉(zhuǎn)移抑制基因腫瘤標(biāo)志物如癌胚抗原、同功酶、抗體、激素、細(xì)胞因子、受體等腫瘤耐藥基因（MDR）

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研究方面的部分應(yīng)用分子生物學(xué)方面：研究各種處理對(duì)細(xì)胞mRNA含量變化的影響比較染病組織與正常組織中各種mRNA含量差異DNA或RNA的轉(zhuǎn)染量與實(shí)驗(yàn)結(jié)果關(guān)系的研究植物學(xué)方面：轉(zhuǎn)基因植物中基因拷貝數(shù)與性狀的關(guān)系監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)基因