病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)

病理學(xué)常用研究方法,主講人：王恩華,1,2,3,一、免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題探討,本世紀(jì)70年代問(wèn)世抗體種類(lèi)急速增加，交叉反應(yīng)存在免疫組化技術(shù)方法不斷問(wèn)世使用的試劑或?qū)嶒?yàn)室條件不同操作人員的熟練程度病理醫(yī)生的結(jié)果判定水平及關(guān)聯(lián)知識(shí)解決標(biāo)準(zhǔn)化的問(wèn)題勢(shì)在必行,4,(一)方法的選擇,目前常用的免疫組化方法有：PAP、ABC、APAAP法、S-P方法等各種方法只要運(yùn)用得好，都會(huì)得到滿(mǎn)意的結(jié)果建議：在我們省內(nèi)都采用S-P法,5,S-P法的優(yōu)點(diǎn) 方法統(tǒng)一 有配套的即用型抗體、試劑盒和顯色試劑盒 一般2-3小時(shí)(30-60)，而ABC法需1天，分 子量小(60KD)，穿透力強(qiáng) 靈敏性高，特異性強(qiáng)，4個(gè)亞基都能于二抗上的生 物素結(jié)合，而且結(jié)合鍵強(qiáng) 背景低，非特異性反應(yīng)少，等電點(diǎn)為6.5，接近于 中性，不與內(nèi)源性凝集素樣物質(zhì)結(jié)合,而ABC法為10,6,S-P法與ABC法的區(qū)別,S-P法：Streptaridin peroxidase conjugataed method 鏈霉菌素抗生物素蛋白過(guò)氧化物酶連接法ABC法： Avidin-Biotin peroxidase complex method 卵白素親生物素過(guò)氧化酶復(fù)合物法,S-P法中的鏈霉菌素抗生物素蛋白取代了ABC方法中的卵白 素和生物素即：卵白素中的4個(gè)亞基一方面與第二抗體上的生物素結(jié) 合，另一方面還與復(fù)合物中的生物素結(jié)合,7,ABC法：,S-P法：,8,(二) 固定、包埋,固定液：一般10%中性緩沖福爾馬林，PH7.3-7.4(PBS配制)固定時(shí)間：應(yīng)少于24小時(shí)，固定時(shí)間越長(zhǎng)，抗原丟失越多固定液量或組織塊大?。航M織為1/3，固定液2/3大體標(biāo)本：切下一塊固定,9,包埋：起初免疫組化對(duì)蠟溫的要求很?chē)?yán)，溫度一高會(huì)嚴(yán)重影響結(jié)果。現(xiàn)在由于抗體質(zhì)量的提高，以及抗原恢復(fù)方法的問(wèn)世，多數(shù)人又忽視了蠟溫的問(wèn)題。個(gè)人認(rèn)為：盡管有抗原修復(fù)方法，但不如開(kāi)始就不使抗原破壞，另外，蠟溫過(guò)高，組織變脆，不易切成大片，容易脫片。因此，要控制蠟溫在65以下,10,(三) 抗原修復(fù)(抗原暴露、抗原復(fù)原),組織中存在某種抗原、但用特異性抗體，卻為陰性其原因是：固定、包埋后部分抗原決定簇與核酸或其它蛋白抗原發(fā)生了交聯(lián)，形成網(wǎng)絡(luò)固定液中的醛基本身也會(huì)發(fā)生交聯(lián)，而封閉抗原,11,抗原修復(fù)的目的：就是要打開(kāi)交聯(lián)，暴露抗原決定簇，有利于抗原抗體反應(yīng)，抗原修復(fù)的方法從大的方面講有兩種：,12,熱修復(fù)： 0.01M檸檬酸緩沖液，PH=6.0，95，10分鐘注意：脫片多多聚L賴(lài)氨酸 干片 選醫(yī)用微波爐酶消化：1.細(xì)胞內(nèi)抗原0.1%胰蛋白酶 2037 2.間質(zhì)抗原4%胃蛋白酶37，4-8小時(shí),13,(八)免疫組織化學(xué)的發(fā)展,1. 免疫PCR：主要用于臨床生物分子檢測(cè)方面 血清(Ag)電泳+Ab+無(wú)關(guān)引物擴(kuò)增顯色 意義：1. 原來(lái)較弱、水平較低的酶等，用免疫PCR就可以檢測(cè)出來(lái) 2. 需要較長(zhǎng)或一定時(shí)間才能查出來(lái)用免疫PCR法，就可提前查出來(lái)如：病毒性心肌炎、血腫CPK檢測(cè) 心梗早期心肌酶譜的檢測(cè)等,心梗預(yù)報(bào)：心絞痛一般認(rèn)為沒(méi)有酶 譜改變，設(shè)想用免疫PCR就可能發(fā)現(xiàn)改變,14,2. 原位免疫PCR在組織切片上有定位 Ag+Ab1+Ab2卵白素洗凈生物素標(biāo)記的DNA片斷洗凈原位PCR擴(kuò)增洗凈ACB或S-P顯色 特點(diǎn)：提高陽(yáng)性率 定位好,15,2. 擴(kuò)增：,Total: 25l PCR buffer 2.5l mixed dNTP 2.0l dH2O 16.375l primer 1 1.0l primer 2 1.0l Taq 0.125l DNA template 2.0l94 25” 55 25” 72 40” 30 cycles,16,3. Agarose 2-5%，用1TBE電泳 擴(kuò)增后液 5l + 1l loading buffer 溴化乙淀染色 20，UV照射下確認(rèn)泳帶照相,4. DNA收集 RECOCHIP法,17,三、Western Blotting,1. 提取蛋白 500l的hypotonic buffer + 組織2mm3勻漿器粉碎 冰上放置30 15000轉(zhuǎn)/分，4，30。上清：細(xì)胞質(zhì)蛋白，+250l 3loading buffer沉淀物 + 750l loading buffer再次粉碎、離心，上清為細(xì)胞膜蛋白 2-氫硫基乙醇 7.5l(1/100)混合 95沸騰5分鐘 冰上放置,18,2. 蛋白定量 標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度制備：BSA，0，0.5，1，2mg/ml 比色：測(cè)定系數(shù) 換算成含量 計(jì)算出每個(gè)樣品加樣量3. 電泳 丙烯酰胺 上部膠、下部膠 marker樣品4. 轉(zhuǎn)膜5. 洗膜 一抗、二抗 顯色或自顯影,19,四、組織芯片(Tissue Micro-Array, TMA),組織芯片技術(shù)是一種特殊生物芯片技術(shù)，它是將幾十個(gè)或幾百個(gè)不同個(gè)體的臨床組織標(biāo)本按預(yù)先設(shè)計(jì)的順序排列在一張玻片進(jìn)行分析研究，是一種高通量、多樣本的分析工具。它使科研人員第一次有可能同時(shí)對(duì)幾百甚至上千種正?；蚣膊∫约凹膊“l(fā)展不同階段的自然病理生理狀態(tài)下的組織樣本，進(jìn)行某一個(gè)或多個(gè)特定的基因，或與其相關(guān)的表達(dá)產(chǎn)物的研究。,20,應(yīng)用免疫組化DNA或RNA原位雜交FISH原位PCR,低密度芯片(50-70個(gè)標(biāo)本)、高密度芯片(500個(gè)標(biāo)本),21,制作過(guò)程,1. 組織處理：固定、石蠟包埋、HE染色、組織定位2. 組織打孔/陣列儀鉆取組織，直徑0.6mm3. 制作陣列蠟塊，將鉆取的組織按設(shè)定的位置放入空白蠟塊內(nèi)4. 切片厚度為5m，以40為宜，56烤片3小時(shí)，備用,2