課件：實(shí)驗(yàn)三血清醋酸纖維薄膜電泳.ppt

實(shí)驗(yàn)三 血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳,主講：姜婧怡 生物化學(xué)教研室,實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?掌握電泳的基本原理，加深對(duì)蛋白質(zhì)兩性解離性質(zhì)的理解。 掌握血清醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)的基本操作。,實(shí) 驗(yàn) 原 理,電泳技術(shù)（Electrophoresis）,電泳的概念：帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳.,背景：電泳現(xiàn)象早在十九世紀(jì)初就已發(fā)現(xiàn)（1808年俄國(guó)物理學(xué)家Ress進(jìn)行了世界上第一次電泳實(shí)驗(yàn)）。但電泳技術(shù)的廣泛應(yīng)用，則是在1937年用濾紙作為支持介質(zhì)成功地進(jìn)行紙電泳以后，是近幾十年以來(lái)，電泳技術(shù)發(fā)展很快，各種類型的電泳技術(shù)相繼誕生，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。,為了克服溶液對(duì)電泳離子的影響，一般在電泳體系中加入不流動(dòng)的固體支持物。 （一）按支持物的物理性狀不同，可分為： 1濾紙及其它纖維(如玻璃纖維、聚氯乙烯纖維薄膜、醋酸纖維)電泳 2粉末電泳：如纖維素粉、淀粉電泳； 3凝膠電泳：如瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳； 4絲線電泳：尼龍絲、人造絲電泳。,電泳的分類,（二）按支持物的裝置形式不同，可分為：,1平板式電泳：支持物水平放置；,2垂直板式電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳；,3垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤(pán)狀電泳,(三)按pH 的連續(xù)性不同，區(qū)帶電泳可分為： 1連續(xù)pH 電泳：即整個(gè)電泳過(guò)程pH 保持不變，如常用的紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳等。 2非連續(xù)pH 電泳：緩沖液和電泳支持物間有不同的pH 的電泳，如聚丙烯酰胺凝膠盤(pán)狀電脈，等電聚焦電泳等。,電泳速度:帶電粒子在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)時(shí)，單位電場(chǎng)強(qiáng)度內(nèi)粒子運(yùn)動(dòng)的速度，以u(píng)表示，即,V粒子運(yùn)動(dòng)的速度 X電場(chǎng)強(qiáng)度 Q粒子所帶電荷 r粒子的半徑 介質(zhì)的粘度,影響電泳速度的主要因素,1.樣品本身: 分子帶電量：Q越多，u越大； 分子大小: 分子小，r越小，u越大； 分子形狀：形狀越小，與支持物介質(zhì)摩擦 越小，u越大。 形狀越規(guī)則，u越大， 反之則越 小。 球形分子 纖維狀分子,2.緩沖溶液：,A.pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大,B.離子強(qiáng)度(I)： 離子強(qiáng)度代表所有類型的離子所產(chǎn)生的靜電力，也就是全部的離子效應(yīng)，它取決于離子電荷的總數(shù)，而與溶液中鹽類的性質(zhì)無(wú)關(guān)。溶液的離子強(qiáng)度越高，帶電質(zhì)點(diǎn)的泳動(dòng)速度越慢；離子強(qiáng)度越低，質(zhì)點(diǎn)泳動(dòng)的速度越快。,一般離子強(qiáng)度的選擇范圍在0.020.2之間。,3.電場(chǎng)強(qiáng)度(X):,電場(chǎng)強(qiáng)度：電泳支持物上每厘米的電位降，也稱電勢(shì)梯度。,X越大，u越快。 支持物越短， X越大， u越快。,注意：電場(chǎng)強(qiáng)度越大或支持物越短，電流將隨之增加，產(chǎn)熱也增加，影響分離效果。 在進(jìn)行高壓電泳的時(shí)候必須用冷卻裝置，否則可引起蛋白質(zhì)等樣品發(fā)生熱變性而無(wú)法分離。,電泳緩沖液相對(duì)于固體支持物的移動(dòng)稱電滲。如紙電泳時(shí)，濾紙吸附OH-帶負(fù)電荷，與紙接觸的緩沖液帶正電荷向負(fù)極移動(dòng)，會(huì)對(duì)顆粒的移動(dòng)造成不良影響，故電泳時(shí)，電滲小些為好。,4電滲現(xiàn)象,醋酸纖維薄膜電泳,醋酸纖維是纖維素的醋酸酯，由纖維素的羥基經(jīng) 乙?；?。涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，有強(qiáng)滲透性，厚度約為120微米。 醋酸纖維素薄膜電泳有以下優(yōu)點(diǎn)： 微量、快速、簡(jiǎn)便、分辨力高、 對(duì)樣品無(wú)拖尾和吸附現(xiàn)象,實(shí)驗(yàn)原理,以蛋白質(zhì)為例：,pHpI pH=pI pHpI,H,H,OH,OH,蛋白質(zhì)兼性離子,蛋白質(zhì)陽(yáng)離子,蛋白質(zhì)陰離子,（等電點(diǎn)）,實(shí)驗(yàn)原理,以蛋白質(zhì)為例：,實(shí)驗(yàn)原理,人血清中幾種主要蛋白組分,緩沖液pH=8.6,pHpI,血清蛋白帶負(fù)電荷,在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。,經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳可將血清蛋白按電泳速度分為5條區(qū)帶,染色和定量,膜條經(jīng)過(guò)氨基黑10B染色后顯出清晰色帶。,各色帶蛋白質(zhì)含量與染料結(jié)合量基本成正比。,可將各色帶剪開(kāi)，分別溶于堿性溶液中。,用分光光度法計(jì)算各種蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。,實(shí)驗(yàn)步驟：,1準(zhǔn)備與點(diǎn)樣：,取一條2.58cm的膜條,充分浸透在巴比妥緩沖液中,取出膜條,濾紙吸去多余的緩沖液,無(wú)光面距一端1.5cm處作點(diǎn)樣線,點(diǎn)樣器下端粘上薄層血清,垂 直 點(diǎn) 樣,（注意：在薄膜負(fù)極端寫(xiě)好學(xué)號(hào)或者做好標(biāo)記),2電泳,放 置 膜 條,點(diǎn)樣端置于陰極,點(diǎn)樣面向下,膜條貼 緊濾紙，拉直膜條,平衡10 分鐘,通 電,電壓：160v,時(shí)間：50 min,關(guān)閉 電源,3染色、脫色,通電 完畢,取出 膜條,浸于染色液（氨基黑10B）中,3min,取出 膜條,依次浸于漂洗液、,各5min,直至 漂凈,濾紙吸 干薄膜,.定量 (兩人的膜條共用),取試管6支，編號(hào)16,充分振蕩、脫凈染料,比 色、定 量,15min,實(shí)驗(yàn)結(jié)果：,原始數(shù)據(jù)：,各樣品吸光度值,儀器型號(hào)： 吸收波長(zhǎng)：,650nm,光密度總和 T2A12,1計(jì)算出各部分蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。 清蛋白（2A / T）100 1球蛋白（ 1 / T）100 2球蛋白（ 2 / T）100 球蛋白（/ T）100 球蛋白（/ T）100,2計(jì)算出清蛋白與球蛋白之比值（2A/G） G=12,血清蛋白電泳結(jié)果的臨床意義：,臨床上還可用A/G比來(lái)表示清球蛋白的量的關(guān)系： 正常人A/G1.52.5,注意事項(xiàng)：,1、點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，吸水量以不干不濕為宜。 2、點(diǎn)樣時(shí)，動(dòng)作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜 片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。 3、點(diǎn)樣應(yīng)點(diǎn)在薄膜的毛面上，點(diǎn)樣量要適量，不宜過(guò)多或過(guò)少。,4、電泳時(shí)應(yīng)將薄膜的點(diǎn)樣端置于電泳槽的負(fù)極端，且點(diǎn)樣面向下。 5、應(yīng)控制染色時(shí)間。時(shí)間長(zhǎng)，薄膜底色不易脫去；時(shí)間太短，著色不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻。,下次實(shí)驗(yàn)： 血清-球蛋白的提純,預(yù)習(xí)要點(diǎn)： 1.鹽析、凝膠層析、透析法分離純化蛋白 質(zhì)的基本原理及操作 2.蛋白質(zhì)定性檢測(cè)的方法。 3.離心機(jī)的原理及操作。,后面內(nèi)容直接刪除就行 資料可以編輯修改使用 資料可以編輯修改使用 資料僅供參考，實(shí)際情況實(shí)際分析,主要經(jīng)營(yíng)：課件設(shè)計(jì)，文檔制作，網(wǎng)絡(luò)軟件設(shè)計(jì)、圖文設(shè)計(jì)制作、發(fā)布廣告等 秉著以優(yōu)質(zhì)的服務(wù)對(duì)待每一位客戶，做到讓客戶滿意！ 致力于數(shù)據(jù)挖掘，合同簡(jiǎn)歷、論文寫(xiě)作、PPT設(shè)計(jì)、計(jì)劃書(shū)、策劃案、學(xué)習(xí)課件、各類模板等方方面面，打造全網(wǎng)一站式需求,感謝您的觀看