食品衛(wèi)生微生物檢驗實驗室操作技術(shù)

食品衛(wèi)生微生物檢驗實驗室操作技術(shù)要求第一節(jié) 實驗室管理制度一、實驗室管理制度1實驗室應(yīng)制定儀器配備管理、使用制度，藥品管理、使用制度，玻璃器皿管理，使用制度，并根據(jù)安全制度和環(huán)境條件的要求，本室工作人員應(yīng)嚴(yán)格掌握，認真執(zhí)行。2進入實驗室必須穿工作服，進入無菌室換無菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非實驗室人員不得進入實驗室，嚴(yán)格執(zhí)行安全操作規(guī)程。3實驗室內(nèi)物品擺放整齊，試劑定期檢查并有明晰標(biāo)簽，儀器定期檢查、保養(yǎng)、檢修, 嚴(yán)禁在冰箱內(nèi)存放和加工私人食品。4各種器材應(yīng)建立請領(lǐng)消耗記錄，貴重儀器有使用記錄，破損遺失應(yīng)填寫報告；藥品、器材、菌種不經(jīng)批準(zhǔn)不得擅自外借和轉(zhuǎn)讓，更不得私自拿出，應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行菌種保管制度。5禁止在實驗室內(nèi)吸煙、進餐、會客、喧嘩，實驗室內(nèi)不得帶入私人物品，離開實驗室前認真檢查水、電、暖氣、門窗，對于有毒、有害、易燃、污染、腐蝕的物品和廢棄物品應(yīng)按有關(guān)要求執(zhí)行。6科、室負責(zé)人督促本制度嚴(yán)格執(zhí)行，根據(jù)情況給于獎懲，出現(xiàn)問題立即報告，造成病原擴散等責(zé)任事故者，應(yīng)視情節(jié)直至追究法律責(zé)任。二、儀器配備、管理使用制度 1食品微生物實驗室應(yīng)具備下列儀器：培養(yǎng)箱、高壓鍋、普通冰箱、低溫冰箱、厭氧培養(yǎng)設(shè)備、顯微鏡、離心機、超凈臺、振蕩器、普通天平、千分之一天平、烤箱、冷凍干燥設(shè)備、勻質(zhì)器、恒溫水浴箱、菌落計數(shù)器、生化培養(yǎng)箱，電位 pH計、高速離心機。2實驗室所使用的儀器、容器應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)要求，保證準(zhǔn)確可靠，凡計量器具須經(jīng)計量部門檢定合格方能使用。3實驗室儀器安放合理，貴重儀器有專人保管，建立儀器檔案，并備有操作方法，保養(yǎng)、維修、說明書及使用登記本，做到經(jīng)常維護、保養(yǎng)和檢查，精密儀器不得隨意移動，若有損壞需要修理時，不得私自拆動、應(yīng)寫出報告、通知管理人員，經(jīng)科室負責(zé)人同意填報修理申請、送儀器維修部門。4各種儀器（冰箱、溫箱除外），使用完畢后要立即切斷電源，旋鈕復(fù)原歸位，待仔細檢查后，方可離去。5一切儀器設(shè)備未經(jīng)設(shè)備管理人員同意，不得外借，使用后按登記本的內(nèi)容進行登記。6儀器設(shè)備應(yīng)保持清潔，一般應(yīng)有儀器套罩。7使用儀器時，應(yīng)嚴(yán)格按操作規(guī)程進行，對違反操作規(guī)程的因管理不善致使儀器械損壞，要追究當(dāng)事者責(zé)任。三、藥品管理、使用制度 1依據(jù)本室檢測任務(wù)，制定各種藥品試劑采購計劃，寫清品名、單位、數(shù)量、純度、包裝規(guī)格，出廠日期等，領(lǐng)回后建立帳目，專人管理，每半年做出消耗表，并清點剩余藥品。2藥品試劑陳列整齊，放置有序、避光、防潮、通風(fēng)干燥，瓶簽完整，劇毒藥品加鎖存放、易燃、揮發(fā)、腐蝕品種單獨貯存。3領(lǐng)用藥品試劑，需填寫請領(lǐng)單、由使用人和室負責(zé)人簽字，任何人無權(quán)私自出借或饋送藥品試劑，本單位科、室間或外單位互借時需經(jīng)科室負責(zé)人簽字。4稱取藥品試劑應(yīng)按操作規(guī)范進行，用后蓋好，必要時可封口或黑紙包裹，不使用過期或變質(zhì)藥品。四、玻璃器皿管理、使用制度1根據(jù)測試項目的要求，申報玻璃儀器的采購計劃、詳細注明規(guī)格、產(chǎn)地、數(shù)量、要求，硬質(zhì)中性玻璃儀器應(yīng)經(jīng)計量驗證合格。2大型器皿建立帳目，每年清查一次，一般低值易耗器皿損壞后隨時填寫損耗登記清單。3玻璃器皿使用前應(yīng)除去污垢，并用清潔液或2%稀鹽酸溶液浸泡24 h后，用清水沖洗干凈備用。4器皿使用后隨時清洗，染菌后應(yīng)嚴(yán)格高壓滅菌，不得亂棄亂扔。五、安全制度 1進入實驗室工作衣、帽、鞋必須穿戴整齊。 2在進行高壓、干烤、消毒等工作時，工作人員不得擅自離現(xiàn)場，認真觀察溫度、時間，蒸餾易揮發(fā)、易燃液體時，不準(zhǔn)直接加熱，應(yīng)置水浴鍋上進行，試驗過程中如產(chǎn)生毒氣時應(yīng)在避毒柜內(nèi)操作。 3嚴(yán)禁用口直接吸取藥品和菌液，按無菌操作進行，如發(fā)生菌液，病原體濺出容器外時，應(yīng)立即用有效消毒劑進行徹底消毒，安全處理后方有離開現(xiàn)場。 4工作完畢，兩手用清水肥皂洗凈，必要時可用新潔爾滅、過氧乙酸泡手，然后用水沖洗，工作服應(yīng)經(jīng)常清洗，保持整潔，必要時高壓消毒。 5實驗完畢，即時清理現(xiàn)場和實驗用具，對染菌帶毒物品，進行消毒滅菌處理。 6每日下班，尤其節(jié)假日前后認真檢查水、暖氣、電和正在使用的儀器設(shè)備，關(guān)好門窗，方可離去。六、環(huán)境條件要求1. 實驗室內(nèi)要經(jīng)常保持清潔衛(wèi)生，每天上下班應(yīng)進行清掃整理，桌柜等表面應(yīng)每天用消毒液擦拭，保持無塵，杜絕污染。2. 實驗室應(yīng)井然有序，不得存放實驗室外及個人物品、儀器等，實驗室用品要擺放合理，并有固定位置。3. 隨時保持實驗室衛(wèi)生，不得亂扔紙屑等雜物，測試用過的廢棄物要倒在固定的箱筒內(nèi)，并及時處理。4. 實驗室應(yīng)具有優(yōu)良的采光條件和照明設(shè)備。5. 實驗室工作臺面應(yīng)保持水平和無滲漏，墻壁和地面應(yīng)當(dāng)光滑和容易清洗。6. 實驗室布局要合理，一般實驗室應(yīng)有準(zhǔn)備間和無菌室，無菌室應(yīng)有良好的通風(fēng)條件，如安裝空調(diào)設(shè)備及過濾設(shè)備，無菌室內(nèi)空氣測試應(yīng)基本達到無菌。7. 嚴(yán)禁利用實驗室作會議室及其他文娛活動和學(xué)習(xí)場所。第二節(jié) 實驗室技術(shù)操作要求一、 無菌操作要求食品微生物實驗室工作人員，必須有嚴(yán)格的無菌觀念，許多試驗要求在無菌條件下進行，主要原因：一是防止試驗操作中人為污染樣品，二是保證工作人員安全，防止檢出的致病菌由于操作不當(dāng)造成個人污染。1. 接種細菌時必須穿工作服、戴工作帽。2. 進行接種食品樣品時，必須穿專用的工作服、帽及拖鞋，應(yīng)放在無菌室緩沖間，工作前經(jīng)紫外線消毒后使用。3. 接種食品樣品時，應(yīng)在進無菌室前用肥皂洗手，然后用75酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簟?. 進行接種所用的吸管，平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用95%酒精點燃燒灼三次后使用。5. 從包裝中取出吸管時，吸管尖部不能觸及外露部位，使用吸管接種于試管或平皿時，吸管尖不得觸及試管或平皿邊。6. 接種樣品、轉(zhuǎn)種細菌必須在酒精燈前操作，接種細菌或樣品時，吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒。7. 接種環(huán)和針在接種細菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲，必要時還要燒到環(huán)和針與桿的連接處，接種結(jié)核菌和烈性菌的接種環(huán)應(yīng)在沸水中煮沸5min，再經(jīng)火焰燒灼。8. 吸管吸取菌液或樣品時，應(yīng)用相應(yīng)的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。二、無菌間使用要求1. 無菌間通向外面的窗戶應(yīng)為雙層玻璃，并要密封，不得隨意打開，并設(shè)有與無菌間大小相應(yīng)的緩沖間及推拉門，另設(shè)有0.5-0.7m2的小窗，以備進入無菌間后傳遞物品。2. 無菌間內(nèi)應(yīng)保持清潔，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作臺面，不得存放與實驗無關(guān)的物品。3. 無菌間使用前后應(yīng)將門關(guān)緊，打開紫外燈，如采用室內(nèi)懸吊紫外燈消毒時，需30W紫外燈，距離在1.0m處，照射時間不少于30min，使用紫外燈，應(yīng)注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕擦拭，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響。4. 處理和接種食品標(biāo)本時，進入無菌間操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。5. 在無菌間內(nèi)如需要安裝空調(diào)時，則應(yīng)有過濾裝置。三、消毒滅菌要求 微生物檢測用的玻璃器皿、金屬用具及培養(yǎng)基、被污染和接種的培養(yǎng)物等，必須經(jīng)滅菌后方能使用。 （一）干熱和濕熱高壓蒸氣鍋滅菌方法1滅菌前準(zhǔn)備（1）所有需要滅菌的物品首先應(yīng)清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴(yán)密，如用金屬筒應(yīng)將上面通氣孔打開。（2）裝培養(yǎng)基的三角瓶塞，用紙包好，試管蓋好蓋，注射器須將管芯抽出，用紗布包好。2裝放（1）干熱滅菌器：裝放物品不可過擠，且不能接觸箱的四壁。（2）大型高壓蒸氣鍋：放置滅菌物品分別包扎好，直接放入消毒筒內(nèi)，物品之間不能過擠。3設(shè)備檢查（1）檢查門的開關(guān)是否靈活，橡皮圈有無損壞，是否平整。（2）壓力表蒸氣排盡時是否停留在零位，關(guān)好門和蓋，通蒸氣或加熱后，觀察是否漏氣，壓力表與溫度計所標(biāo)示的狀況是否吻合，管道有無堵塞。（3）對有自動電子程序控制裝置的滅菌器，使用前應(yīng)檢查規(guī)定的程序，是否符合于進行滅菌處理的要求。4滅菌處理(1)干熱滅菌法：此法適應(yīng)于在干熱情況下，不損壞、不變質(zhì)、不蒸發(fā)的物品、較常用于玻璃器皿、金屬制品、陶瓷制品等的滅菌。a. 器械器皿應(yīng)清洗后再干烤，以防附著在表面的污物炭化。b. 滅菌時安放物品不能過擠，不要直接接觸底和箱壁，物品之間留有空隙。c.滅菌時將箱門關(guān)緊，接上電源，先將排氣孔打開約30min，排除滅菌器中的冷空氣，溫度升至160調(diào)節(jié)指示燈，維持1.5 2h。d.滅菌完畢后或溫度升溫過程中，須在60以下才能打開箱門。(2) 手提式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的使用應(yīng)按下列步驟進行：a. 手提式高壓鍋在主體內(nèi)加入3L清水，立式高壓鍋加水16L（重復(fù)使用時應(yīng)將水量補足，水變混濁需更換）。b. 手提式壓力鍋將頂蓋上的排氣管插入消毒桶內(nèi)壁的方管中（無軟管或軟管銹蝕破裂的滅菌器不得使用）。c. 蓋好頂蓋擰緊，勿使漏氣；置滅菌器于火源上加熱，立式壓力鍋通上電源，并打開頂蓋上的排氣閥放了冷氣（水沸騰后排氣10-15min）。d. 關(guān)閉排氣閥，使蒸氣壓上升到規(guī)定要求，并維持規(guī)定時間（按滅菌物品性質(zhì)與有關(guān)情況而定）。e. 達到規(guī)定時間后，對需干燥的物品，立即打開排氣閥排出蒸氣，待壓力恢復(fù)到零時，自然冷卻至60后開蓋取物，如為液體物品，不要打開排氣閥，而應(yīng)立即將鍋去除熱源，待自然冷卻，壓力恢復(fù)至零，溫度降到60以下再開蓋取物，以防突然減壓液體劇烈沸騰或容器爆破。(3) 臥式壓力鍋蒸氣滅菌器的使用按下列步驟進行：a. 關(guān)緊鍋門，打開進氣閥，將蒸氣引入夾層進行預(yù)熱，夾層內(nèi)冷空氣經(jīng)阻氣器自動排出。b. 夾層達到預(yù)定溫度后，打開鍋室進氣閥，將蒸氣引入鍋室，鍋室內(nèi)冷空氣經(jīng)鍋室阻氣器自動排出。c. 待鍋室達到規(guī)定的壓力與溫度時，調(diào)節(jié)進氣閥，使保持恒定至規(guī)定時間。d. 自然或人工降溫至60再開門取物，不得使用快速排出蒸氣法，以防突然降壓，液體劇烈沸騰或容器爆破。e.使用自動程序控制式壓力蒸氣滅菌器，在放好物品關(guān)緊門后，應(yīng)根據(jù)物品類別按動相應(yīng)開關(guān)，以便按要求程序自動進行滅菌，滅菌時必須利用附設(shè)儀表記錄溫度與時間以備查，操作要求應(yīng)嚴(yán)格按照廠家說明書進行。5滅菌溫度與時間(1) 干熱滅菌器滅菌溫度160，1.5-2h。(2) 壓力蒸氣滅菌鍋滅菌溫度與時間見表34-1。表34-1物品 滅菌時間，min 115 121不含糖等耐熱物質(zhì)培養(yǎng)基含糖類等不耐熱培養(yǎng)基 15-20 30染菌培養(yǎng)物 器械器皿 30（二）間歇滅菌方法1滅菌方法系利用不加壓力的蒸氣滅菌，某些物質(zhì)經(jīng)高壓蒸氣滅菌容易破壞，可用此法滅菌。（1）將欲滅菌物品置于鍋內(nèi)，蓋上頂蓋，打開排水口，使器內(nèi)余水排盡。（2）關(guān)閉排水口，打開進氣門，根據(jù)需要消毒1020min.（3）滅菌完畢關(guān)閉進氣門，取出物品待冷至室溫溫度，放入37溫箱過夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可達到滅菌目的。2血清凝固器使用方法，培養(yǎng)基中含有血清或雞蛋特殊成份時，因高熱會破壞其營養(yǎng)成份，故用低溫，可使血清凝固，又可達到滅菌目的。（1）在使用該法滅菌的血清等分裝時，需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，試管、平皿也經(jīng)滅菌后使用。（2）將培養(yǎng)基按要求使成斜面或高層，加足水后，接上電源，升溫75901h滅菌，放37溫箱過夜，再如此滅菌三次。3. 煮沸消毒：可用煮鍋或煮沸消毒器，水沸騰后再煮515 min，也可在水中加入2石炭酸煮沸5 min，加入0.02甲醛,80煮60 min均可達到滅菌目的,但選用煮沸消毒的增消劑時,應(yīng)注意對物品的腐蝕性.4. 滅菌處理:滅菌后物品,按正常情況已屬無菌,從滅菌器中取出應(yīng)仔細檢查放置,以免再度污染.(1) 物品取出,隨即檢查包裝的完整性,若有破壞或棉塞脫掉,不可作為無菌物品使用.(2) 取出的物品,如為包裝有明顯的水浸者,不可作為無菌物品使用.(3) 培養(yǎng)基或試劑等,應(yīng)檢查是否符合達到滅菌后的色澤或狀態(tài),未達到者應(yīng)廢棄.(4) 啟閉式容器,在取出時應(yīng)將篩孔關(guān)閉.(5) 取出的物品掉落在地或誤放不潔這處,或沾有水液,均視為受到污染,不可作為無菌物品使用.(6) 取出的合格滅菌物品,應(yīng)存放于貯藏室或防塵柜內(nèi),嚴(yán)禁與未滅菌物品混放.(7) 凡屬合格物品,應(yīng)標(biāo)有滅菌日期及有效期限.(8) 每批滅菌處理完成后,記錄滅菌品名、數(shù)量、溫度、時間、操作者。四、有毒有菌污物處理要求微生物實驗所用實驗器材、培養(yǎng)物等未經(jīng)消毒處理，一律不得帶出實驗室。1. 經(jīng)培養(yǎng)的污染材料及廢棄物應(yīng)放在嚴(yán)密的容器或鐵絲筐內(nèi)，并隼中存放在指定地點，待統(tǒng)一進行高壓滅菌。2. 經(jīng)微生物污染的培養(yǎng)物，必須經(jīng)12130 min高壓滅菌。3. 染菌后的吸管，使用后放入5煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液體不得低于浸泡的高度）再經(jīng)12130 min高壓滅菌。4. 涂片染色沖洗片的液體，一般可直接沖入下水道，烈性菌的沖洗液必須沖在燒杯中，經(jīng)高壓滅菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5煤酚皂溶液中浸泡24 h后，煮沸洗滌。做凝隼試驗用的玻片或平皿，必須高壓滅菌后洗滌。5. 打碎的培養(yǎng)物，立即用5煤酚皂溶液或石炭酸液噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時后再擦拭干凈。污染的工作服或進行烈性試驗所穿的工作服、帽、口罩等，應(yīng)放入專用消毒袋內(nèi)，經(jīng)高壓滅菌后方能洗滌。五、培養(yǎng)基制備要求培養(yǎng)基制備的質(zhì)量將直接影響微生物生長。因為各種微生物對其營養(yǎng)要求不完全相同，培養(yǎng)目的的不同，各種培養(yǎng)基制備要求如下：1. 根據(jù)培養(yǎng)基配方的成分按量稱取，然后溶于蒸餾水中，在使用前對應(yīng)用的試劑藥品應(yīng)進行質(zhì)量檢驗。2. PH測定及調(diào)節(jié)：PH測定要在培養(yǎng)基冷至室溫時進行，因在熱或冷的情況下，其PH有一定差異，當(dāng)測定好時，按計算量加入堿或酸混勻后，應(yīng)再測試一次。培養(yǎng)基PH值一定要準(zhǔn)確，否則會影響微生物的生長或影響結(jié)果的觀察。但需注意因高壓滅菌可影響一些培養(yǎng)基的PH降低或升高，故不宜滅菌壓力過高或次數(shù)太多，以免影響培養(yǎng)基的質(zhì)量，指示劑、去氧膽酸鈉、瓊脂等一般在調(diào)完P(guān)H后再加入。3. 培養(yǎng)基需保持澄清，便于觀察細菌的生長情況，培養(yǎng)基加熱煮沸后，可用脫脂棉花或絨布過濾，以除去沉淀物，必要時可用雞蛋白澄清處理，所用瓊脂條要預(yù)先洗凈涼干后使用，避免因瓊脂含雜質(zhì)而影響透明度。4. 盛裝培養(yǎng)基不宜用鐵、銅等容器，使用洗凈的中性硬質(zhì)玻璃容器為好。5. 培養(yǎng)基的滅菌既要達到完全滅菌目的，又要注意不因加熱而降低其營養(yǎng)價值，一般12115min即可，如為含有不耐高熱物質(zhì)的培養(yǎng)基如糖類、血清、明膠等，則應(yīng)采用低溫滅菌或間歇法滅菌，一些不能加熱的試劑如亞碲酸鉀、卵黃、TTC、抗菌素等，待基礎(chǔ)瓊脂高壓滅菌后涼至50左右再加入。6. 每批培養(yǎng)基制備好后，應(yīng)做無菌生長試驗及所檢菌株生長試驗。如果是生化培養(yǎng)基，使用標(biāo)準(zhǔn)菌株接種培養(yǎng)，觀察生化反應(yīng)結(jié)果，應(yīng)呈正常反應(yīng)，培養(yǎng)基不應(yīng)貯存過久，必要時可置4冰箱存放。7. 目前各種干燥培養(yǎng)基較多，每批需用標(biāo)準(zhǔn)菌株進行生長試驗或生化反應(yīng)觀察，各種培養(yǎng)基用相應(yīng)菌株生長試驗良好后方可應(yīng)用，新購進的或存放過久的干燥培養(yǎng)基，在配制時也應(yīng)測PH，使用時需根據(jù)產(chǎn)品說明書用量和方法進行。8. 每批制備的培養(yǎng)基所用化學(xué)試劑、滅菌情況及菌株生長試驗結(jié)果、制作人員等應(yīng)做好記錄，以備查詢。六、樣品采集及處理要求1. 所采集的檢驗樣品一定要具有代表性，采樣時應(yīng)首先對該批食品原料、加工、運輸、貯藏方法條件、周圍環(huán)境衛(wèi)生狀況等進行詳細調(diào)查，檢查是否有污染源存在。2. 根據(jù)食品的種類及數(shù)量，采樣數(shù)量及方法應(yīng)按標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法的要求進行。3. 采樣應(yīng)注意無菌操作，容器必須滅菌，避免環(huán)境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，用新潔爾滅、酒精等消毒藥物滅菌，更不能含有此類消毒藥物或抗生素類藥物，以避免殺死樣品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可應(yīng)用。4. 樣品采集后應(yīng)立即送往檢驗室進行檢驗，送檢過程中一般不超過3h，如路程較遠，可保存在15環(huán)境中，如需冷凍者，則