《毛細(xì)管電泳》PPT課件.ppt

毛細(xì)管電泳,Capillary Electrophoresis,電泳 electrophoresis 是指溶液中帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的電動現(xiàn)象。,毛細(xì)管電泳 capillary electrophoresis 是利用被分析離子在電場作用下移動的速率不同而達(dá)到分離的目的，這種技術(shù)主要用來分析在毛細(xì)管緩沖溶液中能離解為離子的物質(zhì)。,毛細(xì)管電色譜 可以分離離子和中性分子。它是利用緩沖溶液的電滲流作為泵，使被分析的分子通過對其具有不同保留程度的第二相，達(dá)到分離的目的。,概 念,特 點(diǎn),瑞典化學(xué)家Tiselius建立了“移界電泳”，成功地將人血清中的蛋白質(zhì)分為5個主要成分，為蛋白質(zhì)化學(xué)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。,毛細(xì)管電泳的基本原理,電泳分離的基礎(chǔ), = eE, 為離子移動的速度 e為電泳遷移率 E為毛細(xì)管柱進(jìn)樣端至檢測窗口間電場強(qiáng)度。,離子的電泳遷移率不同，在電場中移動的速度不一樣，利用這個原理可以把不同的離子彼此分離。電泳遷移率與分析物質(zhì)所帶電荷呈正比，與摩擦阻力系數(shù)呈反比。如果兩種物質(zhì)帶有不同的電荷或者通過緩沖溶液移動的摩擦力不同，那么這兩種物質(zhì)可以彼此分離。,電荷-尺寸,只有一個相！,毛細(xì)管電泳,1 離子移動的速率, = eE = eU/L,U是毛細(xì)管柱兩端施加的壓力 L是毛細(xì)管柱總長。 采用高電壓可以達(dá)到使離子迅速移動和快速分離。,2 毛細(xì)管電泳中的板高,N = eU/2D,由于分離度隨塔板數(shù)的增加而增加，因此為了獲得高的分離度應(yīng)采用高電壓。 在凝膠板形電泳中，一般最高使用的電壓約為500 V。 在毛細(xì)管電泳中，一般可采用20,000 60,000 V的高電壓。,3 電滲流,在電泳過程中還存在另一種電動現(xiàn)象，即電滲。當(dāng)高電壓通過含有緩沖溶液的毛細(xì)管柱時，管內(nèi)的溶質(zhì)向陰極或陽極移動，產(chǎn)生電滲流。在柱內(nèi)層氧化硅與溶質(zhì)的界面上形成雙電層是電滲流產(chǎn)生的原因。,毛細(xì)管電泳裝置,一般的進(jìn)樣方式是電動進(jìn)樣和壓力進(jìn)樣。 電動進(jìn)樣是將毛細(xì)管柱的一端及其相應(yīng)端的電極從緩沖池中移出，放入試樣杯中，然后在一準(zhǔn)確時間范圍內(nèi)施加壓力，使試樣因離子移動和電滲流進(jìn)入毛細(xì)管柱。 壓力進(jìn)樣是用壓差使試樣溶液進(jìn)入毛細(xì)管。產(chǎn)生壓差的辦法可以采用在檢測器端抽真空，或者通過提高試樣端液面。,毛細(xì)管電泳的分離模式與應(yīng)用,細(xì)管區(qū)帶電泳 capillary zone electrophoresis, CZE 毛細(xì)管凝膠電泳 capillary gel electrophoresis, CGE 毛細(xì)管等速電泳 capillary isota- chophoresis, CITP 毛細(xì)管等電聚焦 capillary isoelectric focus, CIEF,細(xì)管區(qū)帶電泳,毛細(xì)管區(qū)帶電泳可以分離小離子，而且能分離那些衍生化或反應(yīng)生成離子的物質(zhì)，如抗炎藥物，氨基酸，蛋白質(zhì)等物質(zhì)。,毛細(xì)管凝膠電泳,是將生物大分子如蛋白質(zhì)，DNA片斷，按相對分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離的一種分離方法。 毛細(xì)管凝膠電泳一般是在多孔的凝膠基質(zhì)上進(jìn)行，如聚酰胺聚合物。在凝膠的孔穴中含有緩沖混合物，分離是在穴中進(jìn)行。最常用的凝膠是在交聯(lián)劑的存在下聚合丙烯酸酰胺。聚合物的孔穴大小取決于單體與交聯(lián)劑的比例，增加交聯(lián)劑的量可以得到小孔穴凝膠。,毛細(xì)管等速電泳,是基于試樣中各組分電泳遷移率的差異而進(jìn)行分離的。在等速電泳中試樣是引入在兩種不同的電解質(zhì)之間，其中一種是遷移率較高的前導(dǎo)離子電解質(zhì)溶液另一種是遷移率較低的尾隨離子電解質(zhì)溶液。當(dāng)加上電場后，由于各種離子遷移率不同，向正極遷移的速度不同，故電解質(zhì)溶液將形成由負(fù)極到正極增加的離子濃度梯度，而電位梯度與電導(dǎo)率呈反比，故低濃度離子區(qū)即低電導(dǎo)區(qū)有較高的電位梯度。因此點(diǎn)泳池內(nèi)電解質(zhì)溶液的電位梯度有正極向負(fù)極增加。由于離子的遷移速度與電場強(qiáng)度呈正比，隨著電泳的進(jìn)行，離子進(jìn)入等速狀態(tài)，此時形成緊緊相鄰而又彼此完全分離的單組分區(qū)帶。,毛細(xì)管等電聚焦,是基于不同蛋白質(zhì)或多肽之間等電點(diǎn)pH的差異進(jìn)行分離。分子中既有酸性基團(tuán)又有堿性基團(tuán)的兩性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)，有一個等電點(diǎn) pI, 即電荷為零時的pH。當(dāng)溶液中的pH正好是兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)時，它們在電場中不移動。高于此pH時，它們失去質(zhì)子帶負(fù)電荷，在電場作用下向正極移動 低于此pH時，移向負(fù)極。若在毛細(xì)管柱中置一pH梯度緩沖溶液，從一端向另一端遞增。當(dāng)兩性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)進(jìn)入毛細(xì)管柱置于高于它的pI的地方，它就帶負(fù)電荷，趨向正極 而朝這個方向pH逐漸變小，最后達(dá)到pH等于它的pI值的部位，此時凈電荷為零，速度也為零。通過等電點(diǎn)聚焦，將試樣中不同物質(zhì)濃縮在不同的等電點(diǎn)處，從而達(dá)到分離的目的。,毛細(xì)管電色譜,填充柱毛細(xì)管電色譜。基于填充柱的電色譜是各種電泳中最新出現(xiàn)的一種技術(shù)。它是利用電滲透驅(qū)動極性溶劑通過反相高效液相色譜毛細(xì)管柱，利用試樣在兩相的分配進(jìn)行分離。 膠束電動毛細(xì)管色譜。是在緩沖溶液中加入濃度高于膠束臨界濃度的表面活性劑。膠束相在分離中起到了準(zhǔn)固定相的作用，電中性的有機(jī)化合物按照它們在水相和有機(jī)相之間分配系數(shù)的差異進(jìn)行分離。該方法也可用來改善帶電有機(jī)化合物的分離選擇性。,毛細(xì)管電動色譜的優(yōu)點(diǎn),像高效液相色譜，能夠分離不帶電荷的物質(zhì)。 像毛細(xì)管電泳法，不需要壓