綠原酸納米硒的制備及其抗氧化性的研究

JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY本 科 畢 業(yè) 論 文題 目： 綠原酸納米硒的制備及其抗氧化性的研究 學(xué) 院： 食品科學(xué)與工程學(xué)院 姓 名： 王菁 學(xué) 號(hào)： 20134775 專(zhuān) 業(yè)： 食品質(zhì)量與安全 班 級(jí)： 食安1302班 指導(dǎo)教師： 楊麗聰 職 稱(chēng)： 講師 二一七年五月目錄摘要IAbstractII前言11材料與方法21.1 材料與試劑21.2 儀器與設(shè)備22 試驗(yàn)方法32.1 綠原酸納米硒的制備32.2 綠原酸納米硒的表征32.2.1 紫外分光光度法32.2.2 傅里葉紅外光譜分析法32.2.3 熒光光譜法32.3 綠原酸納米硒抗氧化能力測(cè)定42.3.1 還原力的測(cè)定42.3.2 清除羥自由基能力的測(cè)定42.3.3 清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定42.3.4 清除ABTS+自由基能力的測(cè)定53 結(jié)果與分析53.1 綠原酸納米硒穩(wěn)定性分析53.2 綠原酸納米硒的表征53.2.1 CGASeNPs的紫外光譜分析53.2.2 紅外光譜下的CGASeNPs63.2.3 綠原酸納米硒熒光光譜分析73.3 綠原酸納米硒抗氧化能力的測(cè)定73.3.1 綠原酸納米硒還原力的測(cè)定73.3.2 綠原酸納米硒清除羥自由基的能力83.3.3 綠原酸納米硒清除超氧陰離子的能力93.3.4 綠原酸納米硒清除ABTS+自由基的能力94 結(jié)論10參考文獻(xiàn)11致謝12綠原酸納米硒的制備及其抗氧化性的研究摘要綠原酸具有較好抗氧化，但其水溶性及穩(wěn)定性較差。為了解決這一問(wèn)題，本試驗(yàn)采用綠原酸直接還原制備綠原酸納米硒（CGASeNPs）。選用熒光光譜法、紫外分光光譜法及傅里葉紅外光譜法對(duì)所制得的CGASeNPs進(jìn)行表征。并進(jìn)一步通過(guò)對(duì)CGASeNPs對(duì)羥自由基、超氧陰離子、ABTS+清除能力及還原力測(cè)定，評(píng)估CGASeNPs抗氧化能力。結(jié)果顯示，與CGA相比，CGASeNPs的紫外吸收峰，及傅里葉紅外光譜當(dāng)中的-OH特征峰均出現(xiàn)位移，說(shuō)明已成功制備CGASeNPs。熒光光譜顯示所制備的CGASeNPs具有熒光性?？寡趸囼?yàn)顯示CGASeNPs清除自由基及還原力均優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組VC及CGA。本試驗(yàn)結(jié)果表明CGASeNPs是一種高效的、穩(wěn)定且?guī)в袩晒馓匦缘男滦涂寡趸牧希@為納米材料做為抗氧化劑的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。關(guān)鍵詞：綠原酸；納米硒；制備；抗氧化AbstractChlorogenic acid has good oxidation resistance, but its water solubility and stability is poor. In order to solve this problem, chlorogenic acid nano selenium (CGASeNPs) was prepared by direct reduction of chlorogenic acid. The prepared CGASeNPs were characterized by fluorescence spectroscopy, ultraviolet spectrophotometry and Fourier transform infrared spectroscopy. The antioxidant capacity of CGASeNPs was further evaluated by the determination of hydroxyl radical, superoxide anion, ABTS+ scavenging ability and reducing power of CGASeNPs. The results showed that the UV absorption peaks of CGASeNPs and the -OH in Fourier transform infrared spectroscopy show that CGASeNPs have been successfully prepared compared with CGA. Fluorescence spectra showed that the prepared CGASeNPs were fluorescent. Antioxidant experiments showed that CGASeNPs scavenging free radicals and reducing power were better than those of positive control group Vc and CGA. The experimental results showed that CGASeNPs are antioxidant materials with efficient, stable and fluorescent properties, which provides a theoretical basis for the application of nanomaterials as antioxidants.Key words: chlorogenic acid; selenium nanoparticles; preparation; antioxidantII前言綠原酸（chlorogenic acid， CGA）分子式：C16H18O9，又稱(chēng)咖啡鞣酸，是由咖啡酸與奎尼酸形成的酯，具有較多的生物活性，如抗病毒、抗菌、降血壓等 1。由于它含有一定量的R-OH基，能形成具有抗氧化作用的氫自由基，以消除羥基自由基和超氧陰離子等自由基的活性，從而保護(hù)組織免受氧化作用的損害2。然而，綠原酸本身不穩(wěn)定，難溶于水，易溶于乙醇及丙酮等極性有機(jī)溶劑，且它的分子結(jié)構(gòu)中有酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚3個(gè)不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，如下圖所示。這也導(dǎo)致了綠原酸的生物利用度低、穩(wěn)定性差。因此，綠原酸在人體中的使用受到很大程度的限制。納米科學(xué)技術(shù)的到來(lái)，給人類(lèi)認(rèn)識(shí)自然和改造自然開(kāi)辟了新的窗口。納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍(1-100nm)，或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料。納米材料具有量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)3，因此在光學(xué)、電學(xué)、熱學(xué)、磁學(xué)等多方面表現(xiàn)出大塊材料所不能比擬的優(yōu)越性，在分析檢測(cè)、生物傳感、藥物傳遞、生物醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。因此，研究如何利用納米材料實(shí)現(xiàn)對(duì)綠原酸的負(fù)載和傳遞，促進(jìn)綠原酸發(fā)揮藥效，具有十分重要的意義。硒是動(dòng)物體必不可少的微量元素之一，化學(xué)符號(hào)是Se，一種非金屬。硒有提高免疫力、預(yù)防癌癥、抗氧化、拮抗有害重金屬、調(diào)節(jié)維生素吸收與利用等作用4。但是硒的營(yíng)養(yǎng)劑量和可耐受的最高攝入量之間的范圍很窄，容易引起硒中毒5。納米硒不僅有很高的生物利用率和生物活性，而且毒性很低，是目前被發(fā)現(xiàn)的毒性最低的硒形式5。本試驗(yàn)運(yùn)用納米技術(shù)將不穩(wěn)定的利用價(jià)值高的綠原酸修飾在低毒、高生物活性的納米硒上，既可以克服綠原酸不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，又能克服無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒毒性大這一缺點(diǎn)。隨后用熒光光譜法、紫外分光光度法及傅里葉紅外光譜法對(duì)CGASeNPs進(jìn)行表征，試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明我們獲得了穩(wěn)定的帶有熒光特性的CGA修飾的納米硒材料。由于綠原酸和硒均具有抗氧化的特點(diǎn)，我們對(duì)所制備的CGASeNPs的抗氧化性進(jìn)行研究，確定我們所合成的CGASeNPs抗氧化能力與CGA對(duì)比有所提高，這說(shuō)明綠原酸納米硒有望成為一種高效的、穩(wěn)定的新型抗氧化材料，為納米材料做為抗氧化劑的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料與試劑亞硒酸鈉 山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司綠原酸（CGA，純度為98%） 上海源葉生物科技有限公司2 ,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS+） 上海源葉生物科技有限公司維生素C 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司 鄰苯三酚 天津市大茂化學(xué)試劑廠鹽酸 天津市大茂化學(xué)試劑廠磷酸二氫鈉 天津市大茂化學(xué)試劑廠無(wú)水乙醇 天津市大茂化學(xué)試劑廠雙氧水 天津市大茂化學(xué)試劑廠過(guò)硫酸鉀 天津市大茂化學(xué)試劑廠綠礬 天津永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心水楊酸 天津永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心磷酸氫二鈉 天津永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心Tris-HCl 北京索萊寶科技有限公司三氯乙酸 天津市福晨化學(xué)試劑廠鐵氰化鉀 天津市福晨化學(xué)試劑廠三氯化鐵 西隴化工股份有限公司。1.2 儀器與設(shè)備超純水機(jī) 廈門(mén)精藝興業(yè)科技有限公司JD1000-2電子天平 沈陽(yáng)龍騰電子有限公司GPX-9248干燥箱/培養(yǎng)箱（兩用） 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司HH-數(shù)顯恒溫?cái)嚢柩h(huán)水箱 上海圣科儀器設(shè)備有限公司CL-3型恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司UV-5200PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美析儀器有限公司970CRT熒光分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司YP-2壓片機(jī) 上海山岳科學(xué)儀器有限公司IS5傅里葉紅外光譜儀 上海力晶科學(xué)儀器有限公司TGL-16GB臺(tái)式離心機(jī) 上海書(shū)培實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司TDL-5-A低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠SB-3200DTDN超聲波清洗機(jī) 寧波新藝生物科技服份有限公司BDC-215KS電冰箱 青島海爾股份有限公司2 試驗(yàn)方法2.1 綠原酸納米硒的制備有研究表明，CGA溶解在50%的乙醇中并在4下保存最穩(wěn)定7。因此，我們精密稱(chēng)取一定量的純度為98%的CGA、亞硒酸鈉，將綠原酸溶于50%的乙醇中，亞硒酸鈉溶于超純水中，將配制的25 mM綠原酸與0.1 M亞硒酸鈉按一定的比例在450 r/min轉(zhuǎn)速及室溫下攪拌在一起直至溶液顏色由無(wú)色變?yōu)榇u紅色后停止攪拌，離心洗滌之后，重新溶解在50% 醇溶液中，4下過(guò)夜保存5-6。這種方法使得CGA修飾在納米硒材料上，制得均一穩(wěn)定的CGASeNPs溶液。2.2 綠原酸納米硒的表征2.2.1 紫外分光光度法 制后的CGASeNPs在5000 r/min的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心，棄上清液，所得的沉淀即為CGASeNPs，再用50% 乙醇溶解成樣液。采用紫外可見(jiàn)分光光度法在200-600 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)樣液進(jìn)行波譜掃描8，以50%乙醇做基準(zhǔn)線校正液，將CGA醇溶液與CGASeNPs樣液的紫外光譜圖進(jìn)行對(duì)比。2.2.2 傅里葉紅外光譜分析法配制后的CGASeNPs在5000 r/min的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心，棄上清液，所得的沉淀即為CGASeNPs。將所得沉淀的離心管用保鮮膜包裹后放入恒溫干燥箱內(nèi)進(jìn)行干燥24h，用溴化鉀壓片后，用紅外光譜儀對(duì)其進(jìn)行紅外分析。在400-4000 cm-1范圍內(nèi)分別對(duì)干燥后的CGASeNPs和CGA進(jìn)行紅外波譜掃描，記錄其紅外光譜9。2.2.3 熒光光譜法配制后的CGASeNPs在5000 r/min的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心，棄上清液，所得的沉淀即為CGASeNPs。再用50%乙醇溶解所得沉淀制成樣品溶液。以最大激發(fā)波長(zhǎng)ex=350nm激發(fā), 在380-600 nm之間檢測(cè)最大發(fā)射波長(zhǎng)em處的熒光強(qiáng)度值, 激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均設(shè)定為10 nm10-11。2.3 綠原酸納米硒抗氧化能力測(cè)定2.3.1 還原力的測(cè)定分別取20 g/mL、40 g/mL、60 g/mL、80 g/mL、100 g/mL的CGASeNPs溶液1 mL樣品溶液于試管中，加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液1.25 mL (pH = 6.6)和1%的鐵氰化鉀溶液1.25 mL，混勻后于50 恒溫水浴鍋中水浴加熱20 min后，快速冷卻，再加入1.0 mL 10% 三氯乙酸，以3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液0.5 mL，加入0.1% 的三氯化鐵溶液0.25 mL，再加1.75 mL蒸餾水，充分混勻后，在700 nm處測(cè)定其吸光值A(chǔ)i，空白對(duì)照以1.0 mL蒸餾水代替樣液測(cè)吸光度A013。以Vc及CGA為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行CGA、CGASeNPs與Vc的還原力大小對(duì)比。2.3.2 清除羥自由基能力的測(cè)定分別取20 g/mL、40 g/mL、60 g/mL、80 g/mL、100 g/mL的CGASeNPs溶液1.0 mL樣品溶液于試管中，依次加入1.0 mL 6 mmol/L硫酸亞鐵、1.0 mL 6 mmol/L雙氧水，混勻后靜置10 min，再加入1.0 mL 6 mmol/L水楊酸，混勻后靜置30 min，于510 nm處測(cè)吸光度Ai。以1.0 mL蒸餾水代替水楊酸測(cè)吸光度Aj，空白對(duì)照以1.0 mL蒸餾水代替樣液測(cè)吸光度A011-13。以Vc及CGA為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算羥自由基的清除率E：E =（A0-Ai+Aj）/ A02.3.3 清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定此試驗(yàn)是利用鄰苯三酚的自氧化反應(yīng)測(cè)定CGA對(duì)其產(chǎn)生的超氧陰離子的清除作用，在堿性的條件下，鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng)，生成有色物質(zhì)，我們通過(guò)加入樣品溶液阻止中間產(chǎn)物的積累，吸光度降低，以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照，研究所制得的CGASeNPs的清除超氧陰離子能力是否提高。取pH = 8.2，2.25mL，50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液于試管中，加入1.0 mL蒸餾水，于25水浴加熱20 min，再分別取20 g/mL、40 g/mL、60 g/mL、80 g/mL、100 g/mL的CGASeNPs溶液1 mL于試管中，再加入25 mmol/L的鄰苯三酚0.25 mL混勻，在25水浴中反應(yīng)6 min，立即滴加0.5 mL 10 mmol/L的鹽酸終止反應(yīng)，在320 nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)i，以1.0 mL蒸餾水代替鄰苯三酚測(cè)吸光度Aj ，以1.0 mL蒸餾水代替CGASeNPs溶液測(cè)吸光度A011-14。以Vc及CGA為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算超氧陰離子自由基的清除率E。E =（A0-Ai+Aj）/ A02.3.4 清除ABTS+自由基能力的測(cè)定精密稱(chēng)取4.00 mg ABTS+粉末，然后加入新鮮配制的1.0 mg/mL的過(guò)硫酸鉀溶液0.8 mL，密封后避光靜置反應(yīng)16 h，定量轉(zhuǎn)移到25 mL的容量瓶中，再加入3.2 mL蒸餾水，用無(wú)水乙醇定容，放置10 h后使用。分別取20 g/mL、40 g/mL、60 g/mL、80 g/mL、100 g/mL的0.25mL CGASeNPs溶液于試管中，用80乙醇補(bǔ)至1.0 mL，再加入1.0 mL ABTS+工作液，搖勻，避光反應(yīng)6 min，在734 nm下測(cè)吸光值A(chǔ)i,以80乙醇代替樣品溶液作為空白對(duì)照，測(cè)吸光度A015。以Vc及CGA為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算樣品溶液對(duì)ABTS+自由基清除率E。E = （A0-Ai）/ A03 結(jié)果與分析3.1 綠原酸納米硒穩(wěn)定性分析圖1 綠原酸納米硒穩(wěn)定性分析圖制備后的CGASeNPs 4保存1到14天如圖1所示，圖中左邊均為CGA醇溶液，右邊是離心洗滌之后，重新分散在醇溶液中CGASeNPs溶液，我們可以看出CGASeNPs為均一穩(wěn)定的磚紅色溶膠狀，通過(guò)兩周的4冷藏保存，CGASeNPs溶膠狀態(tài)幾乎沒(méi)有變化，說(shuō)明CGASeNPs的穩(wěn)定性良好。3.2 綠原酸納米硒的表征3.2.1 CGASeNPs的紫外光譜分析從CGA與CGASeNPs紫外光譜如圖2所示，CGA屬于酚類(lèi)物質(zhì)，含有苯環(huán)、雙鍵、羰基等不飽和結(jié)構(gòu)，其329 nm 有紫外吸收峰8。制備出的CGASeNPs的吸收峰有些微的偏移，CGASeNPs的最高峰由CGA醇溶液337 nm移至334 nm處，藍(lán)移了3nm。CGA修飾在納米硒上使得吸收峰的位置發(fā)生一定的偏移，說(shuō)明所制得的納米硒表面修飾劑為綠原酸。圖2 CGA與CGASeNPs紫外光譜圖3.2.2 紅外光譜下的CGASeNPsCGA具有酚羥基、苯環(huán)、羰基的特征吸收峰。從CGAs與CGASeNPs紅外光譜如圖3所示，CGA的羥基的峰在3353.99 cm-1處，制成的CGASeNPs的羥基的峰移至3419.00 cm-1處，合成后羥基的峰發(fā)生了紅移，說(shuō)明羥基參與了合成，CGA修飾到了納米硒表面。圖3 CGA與CGASeNPs紅外光譜圖3.2.3 綠原酸納米硒熒光光譜分析從CGA與CGASeNPs的熒光光譜如圖4所示，CGASeNPs的激發(fā)峰由CGA醇溶液的442.9 nm移至437.5 nm處，藍(lán)移了5.4 nm。證明CGA被修飾到了納米硒表面，制得了帶有熒光特性的納米硒材料。圖4 CGA與CGASeNPs的熒光光譜圖3.3 綠原酸納米硒抗氧化能力的測(cè)定3.3.1 綠原酸納米硒還原力的測(cè)定根據(jù)CGASeNPs、CGA與Vc的還原力如圖5所示，還原力測(cè)試CGASeNPs、CGA和Vc的吸光值都隨著濃度的增加而增大，說(shuō)明在0 g/mL-100 g/mL，隨著樣品溶液濃度增加，其還原能力不斷增強(qiáng)，并有良好的線性關(guān)系，在100 g/mL處的還原力CGASeNPs為1.304，Vc為0.704，CGA為0.468。CGASeNPs的還原力最強(qiáng)，其次是Vc，最后是CGA。說(shuō)明將綠原酸修飾在納米硒上之后，其還原能力得到了提高。圖5 CGASeNPs、CGA和Vc還原力圖3.3.2 綠原酸納米硒清除羥自由基的能力CGASeNPs、CGA與Vc清除羥自由基能力如圖6所示，在0 g/mL-100 g/mL，隨著樣品溶液濃度增加，CGASeNPs清除羥自由基的能力不斷增強(qiáng)，在100 g/mL處羥自由基的清除率CGASeNPs為71.0%，CGA為67.0%，Vc為65.9%。CGASeNPs的還原力最強(qiáng)，其次是CGA，最后是Vc。說(shuō)明制備的CGASeNPs的羥自由基的清除能力得到了提高。圖6 CGASeNPs、CGA和Vc清除羥自由基能力圖3.3.3 綠原酸納米硒清除超氧陰離子的能力CGASeNPs、CGA與Vc清除超氧陰離子能力如圖7所示，CGASeNPs清除超氧陰離子的能力最強(qiáng)，其次是Vc，最后是CGA。但是CGASeNPs在40 g/mL后的趨勢(shì)逐漸平緩，Vc在60 g/mL后趨于平緩，并在80-100 g/mL時(shí)幾乎相等，在100 g/mL處超氧陰離子自由基的清除率CGASeNPs為98.5%，Vc為98.0%，CGA為79.9%。說(shuō)明通過(guò)將CGA修飾在納米硒表面的手段提高了CGA清除超氧陰離子的能力，但是到達(dá)一定的濃度后其清除率不會(huì)再增加了。圖7 CGASeNPs、CGA和Vc清除超氧陰離子能力圖3.3.4 綠原酸納米硒清除ABTS+自由基的能力CGASeNPs、CGA與Vc清除ABTS+能力如圖8所示，表明所有樣品對(duì)ABTS+自由基的清除能力都隨濃度的增加而增強(qiáng)，其中CGASeNPs清除ABTS+自由基能力最強(qiáng)，其次是Vc，最后是CGA，但是綠原酸納米硒在60 g/mL后的趨勢(shì)逐漸平緩，Vc在80 g/mL后趨于平緩，在100 g/mL處ABTS+自由基的清除率CGASeNPs為96.0%，CGA為66.6%，Vc為96.0%。說(shuō)明將CGA修飾在納米硒上之后，其清除ABTS+自由基能力得到了提高,雖然能力逐漸增加，但是到達(dá)一定濃度后趨勢(shì)逐漸平緩。圖8 CGASeNPs、CGA和Vc清除ABTS+自由基能力圖4 結(jié)論通過(guò)制備出的CGASeNPs樣品溶液顏色的變化觀察以及運(yùn)用紫外分光光度法、傅里葉紅外光譜法與熒光光譜法對(duì)CGASeNPs進(jìn)行表征，各個(gè)特征峰的偏移說(shuō)明我們成功的制備出了CGASeNPs。CGA修飾在納米硒的表面，使得所制備的CGASeNPs在水中具有良好的穩(wěn)定的分散體系?？寡趸缘脑囼?yàn)表明CGA修飾后的納米硒對(duì)于清除羥自由基、超氧陰離子、ABTS+的能力以及還原力都有顯著的提高，CGASeNPs具有良好的抗氧化效果。這種方法的操作過(guò)程簡(jiǎn)便、所選用的試劑無(wú)毒、反應(yīng)條件溫和，所制備的 CGA修飾納米硒作為新型抗氧化劑具有良好的應(yīng)用前景。11參考文獻(xiàn)1 徐賢柱，魏允，饒華，等. 綠原酸納米脂質(zhì)體制備與抑菌性分析J. 食品科學(xué)，2014，34(20)：62-66.2 李健民，徐艷明，朱魁元，等. 杜仲抗氧化生物活性研究進(jìn)展J. 中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2010，38(02)：137-139.3 丁靜. 碳納米管和納米金顆粒用于DNA和小分子檢測(cè)的研究D. 湖南大學(xué)，2011. 4 Brooks J D， Metter E J， Chan D W， et al. Plasma selenium level before diagnosis and the risk of prostate cancer developmentJ. The Journal of Urology，2001，166:（06）： 2034-2038.5 楊夢(mèng)濤. 納米硒牡蠣多糖的制備及其抗氧化活性研究D. 中國(guó)海洋大學(xué)，2014.6 M. Behera，G. Giri. Green synthesis and characterization of cuprous oxide nanoparticles in presence of a bio-surfactantJ. Materials Science-Poland，2014，32(4)：702-708.7 陳鋼，侯世祥，胡平，等. 金銀花提取物中綠原酸的穩(wěn)定性研究J. 中國(guó)中藥雜志，2003，28（03）：34-3