《細(xì)胞工程》PPT課件 (2).ppt

第三章 細(xì)胞工程與食品產(chǎn)業(yè),第三章 細(xì)胞工程與食品產(chǎn)業(yè),一、細(xì)胞工程的基本原理 二、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 三、細(xì)胞融合技術(shù) 四、動物細(xì)胞工程及其在食品中的應(yīng)用 五、植物細(xì)胞工程及其在食品中的應(yīng)用 六、固定化細(xì)胞及其在食品中的應(yīng)用,一、細(xì)胞工程的基本原理,1.1 細(xì)胞工程的概念及研究范疇 1.2 細(xì)胞工程的基礎(chǔ)知識 1.3 細(xì)胞工程的理論核心,1.1 細(xì)胞工程的概念及研究范疇,概念：應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法，借助工程學(xué)的試驗(yàn)方法或技術(shù)，在細(xì)胞水平上研究改造生物遺傳特性和生物學(xué)特性，以獲得特定的細(xì)胞、細(xì)胞產(chǎn)品或新生物體的有關(guān)理論和技術(shù)方法的學(xué)科。 研究范疇：廣義的細(xì)胞工程包括所有的生物組織、器官及細(xì)胞離體操作和培養(yǎng)技術(shù)，狹義的細(xì)胞工程則是指細(xì)胞融合和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。根據(jù)研究對象不同，細(xì)胞工程可分為動物細(xì)胞工程、植物細(xì)胞工程和微生物細(xì)胞工程。,1.2 細(xì)胞工程的基礎(chǔ)知識,生物界有兩大類細(xì)胞：原核細(xì)胞與真核細(xì)胞。 原核細(xì)胞：DNA裸露于細(xì)胞質(zhì)中，不與蛋白質(zhì)結(jié)合，易于人們的遺傳操作；生長迅速；胞內(nèi)無膜系構(gòu)造細(xì)胞器；生長迅速；是細(xì)胞改造的良好材料。 真核細(xì)胞：胞內(nèi)有細(xì)胞核和眾多膜系構(gòu)造細(xì)胞器；一般都有明顯的細(xì)胞周期，處于有絲分裂時(shí)期的染色包體呈現(xiàn)高度螺旋緊縮狀態(tài)，既不利于基因外釣，也不利于外源基因的插入。可采取一定的措施誘導(dǎo)真核細(xì)胞同步化生長。植物細(xì)胞外還有數(shù)層以纖維素為主要成分的細(xì)胞壁。,動物細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖,細(xì)菌細(xì)胞模式圖,1.3 細(xì)胞工程的理論核心,1.3.1 細(xì)胞全能性概念 1902年，德國植物學(xué)家Haberlandt提出了細(xì)胞全能性的假想。 1934年，White首次定義為: 每個(gè)植物活細(xì)胞在合適的條件下，都有發(fā)育為胚的能力。 70年代，擴(kuò)大了以上定義范圍，認(rèn)為：植物活細(xì)胞不但能形成胚狀體，而且能發(fā)育為完整植株。 80年代初，認(rèn)為：任何植物的離體細(xì)胞在人工培養(yǎng)下都具有它們母體植株的那種合成藥用成分的能力，即培養(yǎng)細(xì)胞的藥物生物合成的能力。,目前細(xì)胞全能性定義： 每個(gè)植物活細(xì)胞都具有該物種的新陳代謝、應(yīng)激性和自體復(fù)制等生命基本屬性，在合適的離體培養(yǎng)條件下，可以展現(xiàn)這些特征屬性。,1.3.2 植物活細(xì)胞具有生命特征屬性 生命特征屬性 細(xì)胞具有生命特征屬性 離體培養(yǎng)細(xì)胞展現(xiàn)該物種的生命特性,生命特征屬性：新陳代謝、應(yīng)激性、自我復(fù)制,1.新陳代謝：是指維持生命各種活動過程中的化學(xué)變化的總稱。 生物體總是不斷地從環(huán)境中攝取物質(zhì)和能量，來維持自身。又有同等量的能，以熱或者其他形式排出體外。一旦新陳代謝停止，生命活動也就停止，生物體就會瓦解。 即，生物體要維持生命，必須吐故納新。,2. 應(yīng)激性：是指生物體隨環(huán)境變化的刺激而發(fā)生相應(yīng)反應(yīng)的特征。 生物體的生存離不開環(huán)境條件，而環(huán)境又是不斷變化的。除四季有規(guī)律的變化外，還有些急劇變化，如干旱、澇災(zāi)、高溫、低溫、昆蟲侵害等等。生物體具有“某種機(jī)制”來感知和正確估計(jì)環(huán)境的變化，以便在體內(nèi)加以校正，保證體內(nèi)平衡，來應(yīng)付突變的環(huán)境。,3. 自我復(fù)制：是指生物體利用自身作模板，通過代謝作用，復(fù)制出完全相同的結(jié)構(gòu)，或產(chǎn)生也具有相同的自體繁殖能力的突變結(jié)構(gòu)。 前者為“遺傳”，后者為“變異”。 “遺傳”保證了物種的純化，“變異”為物種的進(jìn)化提供依據(jù)。自我復(fù)制實(shí)現(xiàn)了遺傳與變異的矛盾統(tǒng)一。,細(xì)胞具有生命特征屬性 生物體由細(xì)胞組成，所以細(xì)胞也具有生命特征屬性。 細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。核酸是構(gòu)成細(xì)胞的重要物質(zhì)，攜帶著遺傳信息，并具有自我復(fù)制的能力，但當(dāng)單獨(dú)存在時(shí)，不能表現(xiàn)出生命特征屬性。只有組成細(xì)胞時(shí)，才能表現(xiàn)完整的生命活動。,同一個(gè)體每一個(gè)體細(xì)胞所含的基因是相同的，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能往往不同（如根細(xì)胞具有吸收水分和養(yǎng)分的作用；葉片具有光和、蒸騰作用等）。 所以說，并非每個(gè)細(xì)胞能把全部遺傳信息都表達(dá)出來。有的基因在這些細(xì)胞中表達(dá)，另一些基因在另一些細(xì)胞中表達(dá)。即，生命的全部屬性在不同的細(xì)胞中分別表達(dá)。,細(xì)胞全能性的相對性,離體培養(yǎng)細(xì)胞展現(xiàn)該物種的生命特性 1.培養(yǎng)細(xì)胞的新陳代謝 在適宜條件下，離體細(xì)胞能夠存活，則具有新陳代謝特性。如：綠色細(xì)胞具有光自養(yǎng)能力；培養(yǎng)細(xì)胞具有該物種的“藥物生物合成的能力” 。,2.培養(yǎng)細(xì)胞的應(yīng)激性 在適宜培養(yǎng)條件下，離體細(xì)胞具有應(yīng)激性:植物組織切割損傷后，應(yīng)激于培養(yǎng)條件而出現(xiàn)脫分化，并在適宜的條件下再分化（芽和根）。,3.培養(yǎng)細(xì)胞展現(xiàn)自體復(fù)制特性,二、細(xì)胞工程的基本技術(shù),2.1 無菌操作技術(shù) 2.2 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 2.3 細(xì)胞融合技術(shù),2.1 無菌操作技術(shù),細(xì)胞工程培養(yǎng)中最重要的，也是最基本的要求就是各項(xiàng)操作應(yīng)從無毒害、無污染的培養(yǎng)環(huán)境來考慮。培養(yǎng)基、器皿材料、接種工具、操作環(huán)境、培養(yǎng)室和超凈工作臺等各個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)注意。,瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口,正 確 錯(cuò) 誤,接種過程中盡可能達(dá)到懸空要求,防止操作帶來的污染,正 確 錯(cuò) 誤,接種時(shí)不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口,正 確 錯(cuò) 誤,接種時(shí)在近火焰處打開瓶口，使瓶傾斜，以免空氣中微生物落入瓶中,正 確 錯(cuò) 誤,2.2 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)概述 2.2.2 植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 2.2.3 動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)概述,細(xì)胞培養(yǎng)：是指在動物、植物和微生物細(xì)胞在體外無菌條件下的保存和生長。 細(xì)胞培養(yǎng)一般步驟： 首先，要取材和除菌。用一定的化學(xué)試劑對材料進(jìn)行嚴(yán)格的表面清洗、消毒。有時(shí)還要借助某些特定的酶，對材料進(jìn)行預(yù)處理，以期得到分散生長的細(xì)胞。 其次，根據(jù)各類細(xì)胞的特點(diǎn)，配制細(xì)胞培養(yǎng)基，對培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌或除菌。采用無菌操作技術(shù)，將生物材料接種于培養(yǎng)基中。 最后，將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱中，提供各類細(xì)胞生長所需的最佳培養(yǎng)條件。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定生物量時(shí)應(yīng)及時(shí)收獲或傳代。,2.2.2 植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),材料準(zhǔn)備 植物細(xì)胞培養(yǎng)基 植物細(xì)胞培養(yǎng)方法,材料準(zhǔn)備,外植體：用于離體培養(yǎng)的植物或組織切段。 來自溫室或田間開放培養(yǎng)的種子、幼苗、器官、組織中帶有各種微生物，當(dāng)與培養(yǎng)基接觸時(shí)，微生物就會迅速生長而抑制培養(yǎng)物的生長，故在培養(yǎng)前必須進(jìn)行嚴(yán)格的消毒處理。 常用的消毒滅菌劑效果較好的有幾種化學(xué)試劑，如次氯酸鈣、次氯酸鈉和氯化汞等。,植物細(xì)胞培養(yǎng)基,用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基營養(yǎng)成分基本上與整個(gè)植物的要求一樣，但是用于培養(yǎng)細(xì)胞、組織和器官的培養(yǎng)基要滿足各自特殊的要求。 植物細(xì)胞的培養(yǎng)基通常包括無機(jī)鹽、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)素、有機(jī)添加劑等。,無機(jī)鹽：有不少鹽可用來提供“大量元素”和“微量元素”，表中給出了常用培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的含量。,碳源和能源：培養(yǎng)中的細(xì)胞對蔗糖和葡萄糖都能利用，果糖的利用效果較差。培養(yǎng)基中的蔗糖可迅速分解成葡萄糖和果糖，葡萄糖首先被利用，然后再利用果糖。也可采用其它糖作能源，但效果不佳。 維生素：培養(yǎng)中的植物細(xì)胞都需要硫胺素，加入煙酸、泛酸、生物素和葉酸，效果更好。原生質(zhì)體培養(yǎng)通常需要大多數(shù)必需維生素。 氨基酸：雖然植物細(xì)胞在培養(yǎng)過程中一般都能合成所需的氨基酸，但加入L-谷氨酰胺或其他氨基酸混合物是很有好處的。此外，還使用蛋白酶解產(chǎn)物，如酪蛋白或酪蛋白水解氨基酸。 植物生長激素：激素分為兩類，生長素和分裂素。生長素促進(jìn)細(xì)胞生長，最有效和最常用的是吲哚乙酸和萘乙酸；分裂素促進(jìn)細(xì)胞分裂，常用的是腺嘌呤衍生物。使用最多的是6-芐氨基嘌呤和玉米素，對芽的誘導(dǎo)具有重要作用。分裂素和生長素通常一起使用，來促進(jìn)細(xì)胞的分裂、生長。,3.植物細(xì)胞培養(yǎng)方法,植物細(xì)胞培養(yǎng)類型：按培養(yǎng)對象可分為單倍體細(xì)胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)；按培養(yǎng)基可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)；按培養(yǎng)方式又可分為懸浮培養(yǎng)和固定化細(xì)胞培養(yǎng)。,(1)植物細(xì)胞懸浮細(xì)胞培養(yǎng),懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：是指把離體的植物細(xì)胞懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行的無菌培養(yǎng)。 懸浮培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：一是增加培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營養(yǎng)供應(yīng)；二是在振蕩條件下可避免細(xì)胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)在局部積累而對細(xì)胞自身產(chǎn)生毒害；三是振蕩培養(yǎng)可以適當(dāng)改善氣體的交換。,植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)與微生物有許多相似的地方，但兩者又存在著明顯的不同。例如，植物細(xì)胞對剪切力敏感、易結(jié)團(tuán)、需光照等條件。此外，植物細(xì)胞生長緩慢，發(fā)酵時(shí)間長，維持無菌操作更為困難。 對剪切力敏感：植物細(xì)胞的個(gè)體大，細(xì)胞壁僵脆且具有大的液泡，這些特性決定了其對剪切力十分敏感。過高的剪切力可使細(xì)胞受到機(jī)械損傷，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞形態(tài)和聚集狀態(tài)改變；或使細(xì)胞自溶，胞內(nèi)化合物釋放；也可能導(dǎo)致細(xì)胞的活性喪失。 結(jié)團(tuán)：絕大多數(shù)植物細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)時(shí)是結(jié)成直徑小至100 m，大至幾毫米的小團(tuán)。其主要原因是細(xì)胞分化后不能很好地分開，另外生長后期分泌的多糖類物質(zhì)也有助于結(jié)團(tuán)。過大的細(xì)胞團(tuán)容易下沉，造成混合困難，而且還影響傳質(zhì)，使中心的營養(yǎng)和供氧不足，影響產(chǎn)物的合成能力。 需光照：大多數(shù)植物細(xì)胞，次級代謝產(chǎn)物的合成受光照的影響，一些研究顯示光照對于胡蘿卜素、黃酮、花青素等的合成有促進(jìn)作用。,一個(gè)成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足的基本條件：一是懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較??；二是均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同，懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，在倒置顯微鏡下觀察為體積和形狀大致相同的細(xì)胞團(tuán)；三是生長迅速，懸浮細(xì)胞的量一般2-3天甚至更短時(shí)間便可增加一倍。,在建立懸浮細(xì)胞系時(shí)需注意以下事項(xiàng)： 1.選擇合適的外植體：由外植體直接誘導(dǎo)的愈傷一般是不適合懸浮培養(yǎng)的，需要通過一定的途徑進(jìn)行篩選、改良，獲得適合懸浮培養(yǎng)的愈傷，其影響因素有： (1)外植體：對于不同植物，外植體的選擇差異較大，如樹木和花卉的葉片、莖尖、芽尖等都可作為外植體誘導(dǎo)愈傷，草坪草用幼穗往往可獲得較成熟種子更高的愈傷誘導(dǎo)率。在誘導(dǎo)率較高的基礎(chǔ)上更容易快速建立起高頻再生的懸浮細(xì)胞系。 (2)基因型：適合懸浮培養(yǎng)的基因型在連續(xù)的繼代培養(yǎng)過程中表現(xiàn)出好的適應(yīng)性，在震蕩培養(yǎng)兩個(gè)月后，細(xì)胞團(tuán)逐漸變小，均勻，生長旺盛。而不適合懸浮培養(yǎng)的基因型在連續(xù)的繼代培養(yǎng)過程中，細(xì)胞團(tuán)大而致密，生長速度慢，生長狀態(tài)不均勻。,2.3 細(xì)胞融合技術(shù),2. 繼代挑選與培養(yǎng)技術(shù)：對于愈傷的挑選，是建立良好懸浮體系的關(guān)鍵。誘導(dǎo)出的初代愈傷組織一般可分為三種：I為質(zhì)地堅(jiān)硬、塊狀、顏色鮮黃的胚性愈傷組織。II為質(zhì)地疏松、易分散、不分泌粘液的顆粒狀胚性愈傷。III為柔軟、水漬、形狀不規(guī)則、顏色淡白的非胚性愈傷。其中II是適合懸浮培養(yǎng)的愈傷。在進(jìn)行最初懸浮培養(yǎng)時(shí)，挑選那些生長力強(qiáng)表面有顆粒突起、疏松易碎的胚性愈傷進(jìn)行液體培養(yǎng)，并用鑷子盡量夾碎。 3.選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件：愈傷組織培養(yǎng)基有時(shí)不適合作為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基，這時(shí)需在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上重新選擇培養(yǎng)基。選擇合適的轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度、適宜的光照。,(2)植物細(xì)胞固定化培養(yǎng),固定化培養(yǎng)技術(shù)：植物細(xì)胞固定化是將植物細(xì)胞包裹于一些多糖或多聚化合物上進(jìn)行培養(yǎng)，并生產(chǎn)有用代謝物的技術(shù)。,與懸浮培養(yǎng)相比，固定化培養(yǎng)具有很多優(yōu)點(diǎn)： （1）有利于次生物質(zhì)的合成、積累； （2）能長時(shí)間保持細(xì)胞活力； （3）減弱營養(yǎng)液流動引起的剪切力； （4）后處理難度小，便于次生代謝物的收集； （5）更好的光合作用； （6）促進(jìn)或改變產(chǎn)物的釋放。,2.2.3 動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),動物細(xì)胞培養(yǎng)：是指將動物組織或細(xì)胞從機(jī)體取出，分散成單個(gè)細(xì)胞，給予必要的生長條件，模擬體內(nèi)生長環(huán)境，使其在體外繼續(xù)生長與增殖。在細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞不再分化成組織。 根據(jù)細(xì)胞是否貼附于支持物上生長的特性，培養(yǎng)的細(xì)胞類型：懸浮型和貼附型。,動物細(xì)胞培養(yǎng)基,（1）種類：天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基兩大類。 天然培養(yǎng)基使用最早，營養(yǎng)成分高，也最為有效。但成分復(fù)雜，個(gè)體差異大，來源也缺乏，因而使用受到限制。動物血清是細(xì)胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基，血清含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，對動物細(xì)胞的生長繁殖具有促進(jìn)作用。同時(shí)，血清對細(xì)胞貼壁和保護(hù)亦有明顯作用，且能中和有毒物質(zhì)的毒性，使細(xì)胞不受傷害。 合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成的，具有一定的組成。但這種合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞的生存，要想使細(xì)胞更好地生長和繁殖，還要補(bǔ)充部分天然培養(yǎng)基，通常是采用血清。,（2）無血清培養(yǎng)基 血清是由血漿除去纖維蛋白而形成的，其中含有各種血漿蛋白質(zhì)、肽、脂肪、碳水化合物、無機(jī)物質(zhì)等，以及血小板凝集時(shí)所釋放的各種因子、轉(zhuǎn)化生長因子，這些因子能誘導(dǎo)某些細(xì)胞的繁殖，而且也可以抑制其細(xì)胞生長并誘導(dǎo)另一些細(xì)胞分化。 在細(xì)胞培養(yǎng)中，血清的主要作用是提供各種激素。這個(gè)假設(shè)首先在垂體細(xì)胞株GH4的培養(yǎng)中得到證實(shí)。此后，無血清細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)得到迅速發(fā)展，十多年來已報(bào)道有幾十種細(xì)胞株系在無血清培養(yǎng)基中生長和增殖獲得成功。,無血清培養(yǎng)基一般是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充因子組成的。 基礎(chǔ)培養(yǎng)基是各種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物，是維持組織或細(xì)胞生長、發(fā)育、遺傳、繁殖等一系列生命活動必不可少的物質(zhì)。 補(bǔ)充因子的種類很多，包括大分子、小分子和微量元素等。,必需補(bǔ)充因子：幾乎所有的細(xì)胞株在無血清培養(yǎng)基中生長時(shí)，都需要胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白存在。 特殊補(bǔ)充因子：包括生長因子、貼壁因子和激素。 生長因子：是維持細(xì)胞生存和增殖所必需的物質(zhì)。依照化學(xué)性質(zhì)可分為肽類生長因子和甾體生長因子。 貼壁因子：絕大多數(shù)真核細(xì)胞在體外生長時(shí)需要固著于適當(dāng)?shù)幕?。?xì)胞固著作用是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括貼壁因子吸附于器皿表面，細(xì)胞與貼壁因子的結(jié)合等。 激素：很多細(xì)胞在無血清培養(yǎng)時(shí)需要加入激素，如生長激素、胰高血糖素等。 無血清細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞培養(yǎng)研究中的一個(gè)里程碑。,2.細(xì)胞培養(yǎng)常用術(shù)語,初始培養(yǎng)：指直接由機(jī)體取得材料（細(xì)胞、組織或器官）、到第一次傳代前即為初始培養(yǎng)。經(jīng)初始培養(yǎng)后的細(xì)胞將形成“細(xì)胞系”。 細(xì)胞系：指起始于第一次傳代時(shí)的初始培養(yǎng)物，它由初始培養(yǎng)中的許多細(xì)胞系列所組成。 體外培養(yǎng)的動物細(xì)胞可分為原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞。原代細(xì)胞是指從機(jī)體取出后初次培養(yǎng)的細(xì)胞，也有人把培養(yǎng)的第一代細(xì)胞與傳10代以內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)；適應(yīng)在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞稱為傳代細(xì)胞。,3.常用的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法,動物體外培養(yǎng)的細(xì)胞有兩種類型，一類是非貼壁依賴性細(xì)胞，來源于血液、淋巴組織的細(xì)胞，許多腫瘤細(xì)胞（包括雜交瘤細(xì)胞）和某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞屬于這一類型。這一類可采用類似微生物培養(yǎng)的方法進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。另一類是貼壁依賴性細(xì)胞，大多數(shù)動物細(xì)胞，包括非淋巴組織的細(xì)胞和許多異倍體體系的細(xì)胞都屬于這一類型。它們需要附著于帶適量正電荷的固體或半固體表面上生長。,（1）懸浮培養(yǎng),懸浮培養(yǎng)是指利用旋轉(zhuǎn)、振搖或攪拌的方法使細(xì)胞始終處于懸浮狀態(tài)，在此狀態(tài)下生長繁殖的方法。此法主要用于懸浮生長的細(xì)胞培養(yǎng)，如雜交瘤細(xì)胞等。對于小規(guī)模培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)可采用轉(zhuǎn)瓶和滾瓶培養(yǎng)方式。大規(guī)模培養(yǎng)則可采用發(fā)酵罐式的細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器。 該培養(yǎng)方法優(yōu)點(diǎn)在于：對設(shè)備的要求簡單，并可借鑒微生物發(fā)酵的部分經(jīng)驗(yàn)和放大規(guī)律。缺點(diǎn)是培養(yǎng)的細(xì)胞密度低且容易發(fā)生變異，因此有潛在的致癌危險(xiǎn)。對于貼壁依賴性細(xì)胞，不能進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。,（2）貼壁培養(yǎng),細(xì)胞貼壁：分散的細(xì)胞懸浮液在培養(yǎng)器中要貼附于壁上的現(xiàn)象。 原來是圓形的細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展呈多種形態(tài)。此后細(xì)胞就開始有絲分裂，并很快進(jìn)入對數(shù)生長期。一般在數(shù)天后就鋪滿生長表面，形成致密的細(xì)胞單層，這種培養(yǎng)方法又叫單層細(xì)胞培養(yǎng)。 有一個(gè)非常有趣的現(xiàn)象是細(xì)胞的接觸抑制，當(dāng)貼壁生長的細(xì)胞生長到表面相互接觸時(shí)，就停止分裂增殖。因此長成單層的細(xì)胞經(jīng)過一段時(shí)間，一定須再重新分散后分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，使其繼續(xù)分裂增殖，這叫傳代。,貼壁培養(yǎng)：是指必須貼附在固體介質(zhì)表面上生長的細(xì)胞培養(yǎng)。大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞屬于貼壁依賴性細(xì)胞。 通常，細(xì)胞貼壁的步驟包括：貼壁因子吸附于培養(yǎng)表面、細(xì)胞與表面接觸、細(xì)胞貼壁于培養(yǎng)表面和貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)表面上擴(kuò)展等幾個(gè)。,細(xì)胞在培養(yǎng)表面貼壁過程,優(yōu)點(diǎn)：單層細(xì)胞培養(yǎng)比較容易完全換液，經(jīng)清洗單層細(xì)胞后便可加入新鮮的培養(yǎng)液。 缺點(diǎn)：擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，花費(fèi)較大；使用更多的空間；不能有效地監(jiān)測細(xì)胞的生長；在測定和控制培養(yǎng)參數(shù)上比較困難的。,（3）微載體系統(tǒng),培養(yǎng)方法：細(xì)胞可貼附在微載體表面上，并懸浮于培養(yǎng)基中，逐漸生長成細(xì)胞單層。 優(yōu)點(diǎn)：具有比表面積大，由于微載體的比表面積大，單位體積培養(yǎng)基細(xì)胞產(chǎn)率高。微載體懸浮于培養(yǎng)基中，細(xì)胞生長環(huán)境均一，簡化了這些環(huán)境因素的監(jiān)測和控制。收獲過程簡單，勞動強(qiáng)度小和占用空間小等特點(diǎn)。,（4）固定化培養(yǎng),在體內(nèi)，細(xì)胞是在三維間質(zhì)組織之中的，而固定培養(yǎng)正是模擬這個(gè)生理狀態(tài)。用此法可達(dá)到較高的細(xì)胞密度，并且很多固定材料可保護(hù)懸浮細(xì)胞免受由于培養(yǎng)液流動產(chǎn)生剪切力的損害。 固定化培養(yǎng)既適用于懸浮生長的細(xì)胞，也適用于貼壁生長的細(xì)胞培養(yǎng)。,各種固定化方法的特點(diǎn),(i)吸附：選擇適當(dāng)?shù)臈l件，將細(xì)胞和支持物混合，細(xì)胞便貼附在支持物表面。缺點(diǎn)主要是負(fù)荷能力低，有細(xì)胞脫落的危險(xiǎn)。 (ii)共價(jià)貼附 ：細(xì)胞和支持物通過化學(xué)鍵結(jié)合，減少了細(xì)胞泄漏，但需要化學(xué)試劑處理，這對細(xì)胞活性不利。 (iii)離子共價(jià)交聯(lián) ：如果用聚合物(聚胺等)處理細(xì)胞懸液，聚合物則會在細(xì)胞之間形成橋使之絮結(jié)。通常細(xì)胞活性高，但機(jī)械穩(wěn)定性差，時(shí)常還發(fā)生細(xì)胞泄漏。 (iv)微膠囊化 ：用一些無機(jī)溶劑和乳化劑將細(xì)胞包在半透膜中，這些試劑對細(xì)胞存在著潛在危險(xiǎn)。微囊化的細(xì)胞具有抗機(jī)械剪切的能力，但由于半透膜孔徑通常較小，大分子量的基質(zhì)通常難以進(jìn)入，由于這種擴(kuò)散障礙，并不是使所有細(xì)胞都處于最佳狀態(tài)。 (v)包埋 ：將細(xì)胞和多聚物或單體混合，隨著凝膠的形成，細(xì)胞嵌入多聚物的網(wǎng)絡(luò)中。此法步驟簡單，條件溫和，且負(fù)荷量大，細(xì)胞泄漏減少，多聚物網(wǎng)絡(luò)能保護(hù)細(xì)胞抗機(jī)械剪切。當(dāng)然，它亦存在一些缺點(diǎn)，如擴(kuò)散限制并非所有細(xì)胞都能接觸最佳基質(zhì)濃度。由于大分子基質(zhì)不能滲透多聚物網(wǎng)絡(luò)，因而往往有一些物質(zhì)被排斥在外。,2.3 細(xì)胞融合技術(shù),細(xì)胞融合：是指不同的細(xì)胞在離體條件下接觸，用無性的方法使其成為一體而產(chǎn)生雜種細(xì)胞的技術(shù)。植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞常因有細(xì)胞壁不能直接用于融合，須經(jīng)酶法除去細(xì)胞壁而得原生質(zhì)體而后再進(jìn)行融合，又稱原生質(zhì)體融合。,細(xì)胞融合的過程：細(xì)胞在促融因子的作用下，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，然后，細(xì)胞之間的質(zhì)膜發(fā)生粘連，細(xì)胞開始融合，然后在培養(yǎng)過程中，進(jìn)而發(fā)生核融合，形成雜種細(xì)胞。,促融因子,生物學(xué)法：采用病毒促進(jìn)細(xì)胞融合。如仙臺病毒。但這種方法存在著許多問題，如病毒 制備困難、操作復(fù)雜等，目前，這種方法主要適用于動物細(xì)胞融合，用于實(shí)驗(yàn)室研究。 化學(xué)融合劑法：如PEG法：融合的程序大致有以下幾步：從雙親分別制備原生質(zhì)體；混合二親本的原生質(zhì)體；誘導(dǎo)融合處理；緩緩加入幾滴高pH高鈣液，持續(xù)15分鐘，加入沖洗液，最后將稀釋液收集于離心管中，離心收集原生質(zhì)體；將處理后的原生質(zhì)體作鏡檢并作培養(yǎng)。 電融合法：這是80年代出現(xiàn)的細(xì)胞工程技術(shù)。采用直流電脈沖的誘導(dǎo)，可改變原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷，使異種原生質(zhì)體粘合，并使原生質(zhì)膜瞬間破裂，相鄰的原生質(zhì)體連接、閉合、產(chǎn)生融合體。電融合的優(yōu)點(diǎn)是，對原生質(zhì)體的損害小，融合率高、重復(fù)性強(qiáng)。另外，它省去用PEG誘導(dǎo)后必須洗滌的步驟，方法簡單。缺點(diǎn)是必須購置專用的細(xì)胞電融合設(shè)備。,植物原生質(zhì)體的制備,（1）取材與除菌 取活躍生長的器官和組織 較臟的外植體要肥皂水清洗再以清水洗2-3次，再浸入70%酒精消毒，用3%次氯酸鈉處理。最后用無菌水漂洗數(shù)次，并用無菌濾紙吸干。 （2）酶解 為除去植物細(xì)胞的細(xì)胞壁，需經(jīng)酶解。除菌后的葉片除去下表皮 切塊放入反應(yīng)液不時(shí)輕搖 反應(yīng)液轉(zhuǎn)綠。反應(yīng)液轉(zhuǎn)綠是酶解成功的一項(xiàng)重要指標(biāo)，說明已有不少原生質(zhì)體游離在反應(yīng)液中。 （3）分離 在反應(yīng)液中除了大量的原生質(zhì)體外，還有一些殘留的組織塊和破碎的細(xì)胞。為取得高純度的原生質(zhì)體需進(jìn)行原生質(zhì)體的分離?？刹捎眠^濾法、低速離心法或比重漂浮法。 （4）洗滌 剛分離得到的原生質(zhì)體往往還含有酶及其他不利于原生質(zhì)體培養(yǎng)、再生的試劑，需用新的原生質(zhì)體培養(yǎng)液離心洗滌2-4次。 （5）鑒定 確認(rèn)是否已獲得原生質(zhì)體。比如放入低滲溶液中，很容易脹破的就是原生質(zhì)體。,融合子的鑒定,雜合細(xì)胞的顯微鏡鑒別：根據(jù)兩親本原生質(zhì)體的形狀和結(jié)構(gòu)的差異來鑒別雜合體。如一方細(xì)胞基本無色，另一方為綠色，則白綠色結(jié)合的細(xì)胞就是雜合細(xì)胞。 互補(bǔ)法篩選雜合細(xì)胞 ：在獲得各種遺傳突變細(xì)胞株系的前提下，可用遺傳互補(bǔ)法來篩選雜合子。如甲細(xì)胞株缺外源激素A不能生長，乙細(xì)胞株需要提供外源激素B才能生長，則甲株與乙株融合，雜合細(xì)胞在不含激素A、B的選擇培養(yǎng)基上可以生長。 細(xì)胞與分子生物學(xué)的方法鑒別雜合體：分子生物學(xué)的方法，如染色體核型分析、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性等分析融合子，以確定其是否結(jié)合了雙親本的遺傳素質(zhì)。 融合處理后再生長出的植株的形態(tài)特征：表型上是否結(jié)合了雙親本的遺傳素質(zhì)。,三、動物細(xì)胞工程及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用,1. 動物細(xì)胞工程概述 動物細(xì)胞工程所涉及的主要技術(shù)有組織培養(yǎng)、細(xì)胞融合、細(xì)胞拆合、染色體或染色體組轉(zhuǎn)移，以及基因轉(zhuǎn)移等方面，是從細(xì)胞結(jié)構(gòu)的不同層次，也就是說從細(xì)胞整體水平、核質(zhì)水平、染色體水平，以及基因水平上來對細(xì)胞進(jìn)行遺傳操作的。 根據(jù)目前動物細(xì)胞工程的發(fā)展現(xiàn)況，技術(shù)中最成熟、影響也最大的當(dāng)數(shù)細(xì)胞融合。其中淋巴細(xì)胞雜交瘤在國內(nèi)外均已普遍開展，其產(chǎn)物單克隆抗體已進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)階段。,2. 動物細(xì)胞工程在食品相關(guān)領(lǐng)域中的應(yīng)用,有害物質(zhì)快速檢測 人工合成產(chǎn)品，以及生產(chǎn)過程中排出的廢水、廢氣、廢渣中所含的化學(xué)物質(zhì)，這些種類繁多的物質(zhì)，通過呼吸、飲食和體表接觸等途徑攝入體內(nèi)，其中有些會直接危害健康，有些會對人類的遺傳有潛在的危險(xiǎn)。因此，有必要從存在于人們生活和工作環(huán)境中的大量化學(xué)物質(zhì)中，迅速、準(zhǔn)確而又簡便地鑒別出哪些是有害的，以采取有效的措施減少或消除人們接觸這類物質(zhì)的機(jī)會。傳統(tǒng)的檢測方法是用動物試驗(yàn)。由于腫瘤有物種特異性，所以需要同時(shí)用幾種動物進(jìn)行試驗(yàn)。而且一次實(shí)驗(yàn)要用大量動物。并且，動物的世代較長。目前在人類環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)至少有六、七萬種，每年還有上千種新合成的化合物進(jìn)入人類社會。 利用動物試驗(yàn)來檢測遺傳效應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng)工業(yè)發(fā)展的需要。目前已建立了多種快速檢測方法，其中之一就是利用離體培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞和人體細(xì)胞為材料，可以彌補(bǔ)動物試驗(yàn)費(fèi)時(shí)長、花錢多、收效慢等不足之處。,四、植物細(xì)胞工程及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用,1.植物細(xì)胞工程概述 植物細(xì)胞工程主要包括原生質(zhì)體的培養(yǎng)技術(shù)、植物細(xì)胞雜交技術(shù)、植物單倍體的培養(yǎng)技術(shù)等。 單倍體生物是指細(xì)胞中僅含一組染色體的個(gè)體。由于它們種質(zhì)純、不受顯性等位基因的掩蓋，人們易于從中挑選出具有可用性狀的隱性突變體。不過，自發(fā)產(chǎn)生單倍體株的幾率很低，小于千分之一?？梢酝ㄟ^實(shí)驗(yàn)室的誘導(dǎo)，大量培育出符合需要的單倍體植株。,2.植物細(xì)胞工程在食品工業(yè)中的應(yīng)用,（1）利用植物細(xì)胞工程生產(chǎn)香料 利用植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)已能生產(chǎn)許多種香料物質(zhì)。如在洋蔥細(xì)胞培養(yǎng)中，從蒜堿酶抑制劑羥基胺中提取出了香料物質(zhì)的前體-烷基半胱氨酸磺胺化合物。 （2）生產(chǎn)食品添加劑 利用植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)已能生產(chǎn)較多的天然食品添加劑。如甜味劑-甜葉苷，此