【DB地方標(biāo)準(zhǔn)】db33 t 745-2009 飼料中甲基睪丸酮的測(cè)定 高效液相色譜法.doc

ics 65.120b 54備案號(hào)：db33浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)db33/t 7452009飼料中甲基睪丸酮的測(cè)定 高效液相色譜法determination of methyltestosterone in feedshigh performance liquid chromatography2009-04-07 發(fā)布2009-05-07 實(shí)施浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 發(fā) 布db33/t 7452009前言本標(biāo)準(zhǔn)附錄a為資料性附錄。 本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省海洋與漁業(yè)局提出并歸口。 本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測(cè)中心。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王揚(yáng)、葉磊海、宋琍琍、張海琪、鄭重鶯、馬文俊、何豐。i飼料中甲基睪丸酮的測(cè)定 高效液相色譜法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中甲基睪丸酮的液相色譜測(cè)定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于配合飼料中甲基睪丸酮的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的 修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究 是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。gb/t6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法gb/t 14699.1 飼料 采樣3原理用甲醇水溶液提取飼料中甲基睪丸酮，石油醚脫脂， 固相萃取柱凈化，高效液相色譜法檢測(cè)，外 標(biāo)法定量。4試劑與材料本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑，除特別注明外，均為分析純?cè)噭?。?shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合gb/t 6682中二級(jí)水標(biāo)準(zhǔn)。4.1甲醇：色譜純。4.2石油醚。4.3磷酸。4.495甲醇溶液：準(zhǔn)確量取 95ml 甲醇（4.1）和 5ml 水，將水加入甲醇攪拌混勻。4.5磷酸水溶液：準(zhǔn)確量取 1ml 磷酸和 600ml 水，將磷酸加入水?dāng)嚢杌靹颉?.6甲基睪丸酮（20302）：已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%。4.7標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精確稱取甲基睪丸酮 0.010 0g，用甲醇溶解配制成 1.0 mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。-4保存。有效期 6 個(gè)月。4.8標(biāo)準(zhǔn)工作液：臨用時(shí)，分別用流動(dòng)相稀釋成各質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。4.9中性氧化鋁固相萃取柱：3ml，500mg。4.10濾膜：四氟乙烯膜，孔徑 0.45m。5儀器與設(shè)備5.1液相色譜儀：配紫外檢測(cè)器。5.2電子分析天平：感量 0.01g 和 0.000 1g。5.3標(biāo)準(zhǔn)篩：孔徑 1 mm。5.4恒溫振蕩器。5.5離心機(jī)：5000 r/min。5.6氮?dú)獯蹈蓛x。5.7固相萃取裝置。5.8旋渦混勻器。1db33/t 74520095.9聚丙烯離心管：50ml。5.10玻璃離心管：10ml。6色譜條件6.1色譜柱：c18，5m，250mm4.6mm（i.d.）。6.2柱溫：30。6.3流動(dòng)相：甲醇磷酸水溶液（4.5）7228。6.4流速：0.8ml/min。6.5進(jìn)樣量：20l。6.6檢測(cè)器波長：254nm。7分析步驟7.1試樣制備按gb/t14699.1的規(guī)定選取有代表性的樣品200g500g，用四分法縮至100g， 粉碎使之全部通過1mm孔篩，充分混勻，貯于磨口瓶中于干燥避光處保存。7.2提取稱取約5.00g試樣（精確到0.01 g），于50ml聚丙烯離心管中，加入20ml甲醇水溶液（4.4）和5ml 的石油醚（4.2），加塞劇烈振蕩1min后置恒溫振蕩器（5.4）上，30振蕩提取15min，5000r/min離心10 分鐘，棄去上層石油醚層，準(zhǔn)確吸取甲醇水溶液層2ml于10ml具塞玻璃離心管中，再加0.3ml水。7.3凈化加3ml的石油醚至上述離心管中，加塞劇烈旋渦振蕩1min，靜置分層，棄去上層石油醚層，下層加 入3ml石油醚按上述方法再洗滌一次。下層甲醇液經(jīng)中性氧化鋁柱（預(yù)先1ml甲醇活化平衡好），流入10ml玻璃離心管中，再用2ml甲醇沖洗柱子，沖洗液并入離心管中，40下氮?dú)獯蹈?，?.0ml流動(dòng)相 定容，經(jīng)膜(4.10)過濾，上機(jī)分析。若溶液中甲基睪丸酮含量超出線性范圍可以用流動(dòng)相稀釋后測(cè)定。7.4工作曲線按設(shè)定的色譜條件（6），待儀器穩(wěn)定后，分別注入20ul濃度為0.055.0g/ml標(biāo)準(zhǔn)工作液于高效 液相色譜儀中，按設(shè)定的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)樣品中甲基睪丸酮含量為 橫坐標(biāo)，繪制工作曲線。7.5色譜測(cè)定取試樣濾液20l進(jìn)樣，記錄峰面積，響應(yīng)值均應(yīng)在上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍之內(nèi)。分別從工作曲 線查得樣品提取液中甲基睪丸酮含量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。注： 甲基睪丸酮的標(biāo)準(zhǔn)品(0.1g/ml)和仔豬前期配合飼料加標(biāo)4mg/kg的色譜圖參見附錄a。8結(jié)果計(jì)算與表述試樣中甲基睪丸酮的含量按下式計(jì)算：x = cv f m（1）式中：x試樣中甲基睪丸酮的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）； c試樣溶液中甲基睪丸酮的含量，單位為微克每毫升（g/ml）； v提取液定容體積，單位為毫升（ml）；f稀釋倍數(shù)； m試樣質(zhì)量，單位為克（g）。 結(jié)果表述：測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留至小數(shù)點(diǎn)后兩位。29方法定量限和回收率、精密度db33/t 74520099.1方法定量限本方法的定量限為2mg/kg。9.2回收率在本實(shí)驗(yàn)方法和條件下，測(cè)定其加標(biāo)回收率在70%120%。9.3精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10%。3db33/t 7452009附錄a（資料性附錄） 甲基睪丸酮的色譜分析圖mau1.751.51.2510.750.58.692met0.250-0.25024681012min圖 a.1 甲基睪丸酮的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖(0.1g