烏塌菜復等位基因雄性不育系的定向轉育.doc

精品論文烏塌菜復等位基因雄性不育系的定向轉育王秋實，馮輝，劉志勇（沈陽農業(yè)大學園藝學院，沈陽市 110161）5摘要：本研究設計了一個“定向轉育方案”轉育復等位基因雄性不育系，用以解決烏塌菜雜種生產難題。以奶白菜復等位基因雄性不育系為不育源， 以烏塌菜高代自交系為目標品 系，利用連續(xù)回交的方法同時轉育不育性和其他植物學性狀。采用測交的方法鑒定植株基 因型。成功的將不育基因從 “s01”轉入“wt01”中，育成了新的烏塌菜雄性不育系， 其具有 100%不育度和 100%不育株率且植物學性狀與目標親本相似。由不育系 gms-4 作為10母本配制了四個雜交組合，從中選出一個最優(yōu)雜交組合 c1。關鍵詞：蔬菜學；烏塌菜；核基因雄性不育；轉育中圖分類號：s634.4directional transfer of a multiple-allele male sterile line in15brassica campestris l. ssp. chinensis (l.) makino var.rasularis tsen et leewang qiushi, feng hui, liu zhiyong(depertment of horticuture, shenyang agricultural university, shenyang, 110161)abstract: to produce hybrid seeds of wutacai (brassica campestris l. ssp. chinensis (l.) makino20var. rosularis tsen et lee), a “directional transfer program” was designed to breed themultiple-allele male sterile line of wutacai. a multiple-allele male sterile line of naibaicai (brassica campestris l. ssp. chinensis l., s01) was used as the male sterile resource, and an inbred line of wutacai (wt01) was used as the target line. recurrent backcrossing was employed to transfer the male sterility and other botanical traits simultaneously, while the genotype was25identified through test crossing. the male sterility was successfully transferred from s01 to wt01.a new male sterile line, gms-4, with similar botanical traits to wt01, a 100% sterility degree and a 100% sterility rate, was bred. four hybrid combinations were generated with gms-4 as the female parent. one hybrid (c1) that contained the most desirable traits was developed from thenew male sterile line.30key words: vegetable; brassica campestris l. ssp. chinensis (l.) makino var. rosularis tsen etlee; multiple-allele male sterile line; breeding0引言烏塌菜（brassica campestris l. ssp. chinensis（l.）makino var. rosularis tsen et lee）原產于35中國，是蕓薹屬白菜亞種的一個變種，廣泛分布于長江流域1。烏塌菜葉色墨綠，葉面褶皺 有光澤，蓮座葉排列緊密，成輪狀生長，外形美觀，有“葉牡丹”的美稱2。烏塌菜口感鮮嫩 爽脆，富含豐富的 vc，因此被稱為“維他命”菜，同時含有豐富的胡蘿卜素、鈣、鐵、磷、 鋅等微量元素3。烏塌菜是一種典型的兩性花異花授粉作物，雜種優(yōu)勢顯著4。于缺乏理想的雜交制種手基金項目：高等學校博士學科點專項科研基金(20092103110001)作者簡介：王秋實(1983-)，女，博士研究生，主要研究方向：蔬菜遺傳育種通信聯(lián)系人：馮輝（1961-），男，教授，主要研究方向：蔬菜遺傳育種. e-mail: - 10 -40段，目前生產上使用的品種為常規(guī)品種。雄性不育是開發(fā)利用雜種優(yōu)勢的一種重要手段5-7。 這種方法不僅能保證高質量的雜交種純度，同時可以保護育種者的知識產權。許明和魏毓棠 8將 ogura 細胞質雄性不育性轉入烏塌菜中，不育性可達 100%，但是其存在種種缺陷，例 如葉片黃化，蜜腺退化，生長緩慢等，不能廣泛的應用于雜交種生產。馮輝9發(fā)現(xiàn)了大白菜 復等位雄性不育材料，并提出了“核復等位基因雄性不育遺傳假說” ，根據(jù)這一假說，不育45性受細胞核內同一位點 msf、ms 和 ms 三個復等位基因控制。其中，ms 為不育基因，msf為恢復基因，ms 為可育基因。三者之間的顯隱關系為 msfmsms。甲型“兩用系”不育株基 因型為“msms”，可育株基因型為“msfms”，臨時保持系基因型為（msms）。用甲型“兩用系” 內不育株（msms）與臨時保持系（msms）雜交，即可獲得具有 100%不育株率的雄性不育系（msmsmsmsmsms）。甲型兩用系可通過系統(tǒng)內不育株與可育株兄妹交的方式來保存50（msms msfms msms, msfms）(圖 1)。這種不育材料以不育性穩(wěn)定和完全不育為特 征，并且沒有細胞質的負面影響。徐巍10以該假說為依據(jù)，將青梗白菜復等位雄性不育轉入 烏塌菜中，育成了具有 100%不育率的烏塌菜核不育系，然而這一不育系是由兩個不同親本轉 育而成，遺傳背景存在較大差異，使得由此不育系配成的 f1 代雜交種整齊度差。本研究旨在找到適當?shù)姆椒▉磙D育烏塌菜不育系。采用了新的不育材料奶白菜核復等位55基因雄性不育系為不育源，設計了“定向轉育方案”來轉育烏塌菜不育系。圖 1 大白菜復等位基因雄性不育系遺傳模式fig.1. genetic model for multiple-allele male sterile line in chinese cabbage1材料方法601.1材料本研究所用材料均由遼寧省十字花科蔬菜重點實驗室提供。采用奶白菜不育系 s01 為不 育源和測交材料。烏塌菜高代自交系 tw01 為待轉育親本。品比實驗選用四個性狀優(yōu)良、穩(wěn) 定遺傳的烏塌菜常規(guī)品種的高代自交系 p1、p2、p3、p4 為父本，以日本品種vitamin為 對照。651.2方法本試驗于 20082011 年在沈陽農業(yè)大學園藝研究基地進行。每年完成兩個有性世代繁 殖。春季在日光溫室播種育苗，待真葉長到 67 片時，移栽至 22cm 直徑泥盆中，5 月末開 花授粉，采用套袋隔離，常規(guī)手工授粉技術。秋冬季利用日光溫室加代。種子在 2c 冰箱中 春化 25 天。測交鑒定的材料春花后直接在穴盤中育苗，不需要移栽定植，待到抽薹開花直70接進行育性鑒定。 采用常規(guī)有性雜交、自交、回交和測交方法實施轉育。在每一個回交世代選擇與輪回親本植物學性狀相似的植株。樣本容量和適合性測驗分別采取、兩式。樣本容量公式:n log（0.01）/log(1-p)75 有育性分離的進行卡平方測定考查其適合性：x2= (oe)2/e其中 p 為出現(xiàn)的概率，o 為實測值，e 為理論值。 采用化學方法對葉片營養(yǎng)成分進行測定：包括 vc、可溶性糖、蛋白質、有機酸、粗纖維含 量以及微量元素含量。vc 含量的測定采用分光光度計法11；可溶性糖含量的測定采用蒽酮 法12；蛋白質含量的測定采用考馬斯亮蘭 g-250 法13；有機酸含量的測定采用酸堿滴定法；80粗纖維含量的測定采用酸堿洗滌法14；微量元素的測定采用原子吸收分光光度法15。2結果與分析2.1烏塌菜待轉育品系 wt01 基因型的確定根據(jù)“大白菜核不育復等位基因遺傳假說”，普通可育品系在核不育位點上的基因型有 4種：msfmsf、msms、msfms 和 msfms，由于 msfms 基因型在育種過程中發(fā)生性狀分離而被淘85汰，剩余 3 種基因型可以通過與甲型兩用系不育株（msms）雜交后代的育性分離比率加以 鑒別。以奶白菜甲型兩用系不育株（msms）為母本，與烏塌菜待轉育品系 wt01 雜交， f1代 45 株全部為可育株，證明待轉育品系wt01的基因型為 msfmsf （圖 2）。90圖 2 tw01 基因型鑒定fig. 2 genotype identification of the target line tw012.2定向轉育遺傳模式按照可育品系基因型測定的結果設計定向轉育遺傳模式，選擇基因型為 msms 的奶白菜95不育系為不育源，基因型為 msfmsf 的目標品系作為輪回親本。不育源與烏塌菜親本雜交后， 以“甲型兩用系方向”來表示各回交世代中用于篩選甲型兩用系的群體，同樣，“臨時保持系 方向” 用來表示各回交世代中用于篩選臨時保持系的群體。如圖 3 所示。100105110圖 3 烏塌菜復等位基因雄性不育系定向轉育模式fig. 3. genetic model for directional transfer of the multiple allele male sterile line inwu ta cai2.3轉育結果分析如表 3 所示，不育系（msms）與輪回親本（msfmsf）雜交后，f1 后代基因型有 msfms 和 msfms 兩種，鑒定的方法是：隨機選取 7 株 f1 代植株自交獲得的 f2 群體。根據(jù) f2 群體植 株育性分離比率來確定 f1 代植株基因型。結果見表 1。表 1 f2 代植株可育與不育分離比率代號可育株/不育株 理論分離比率0.05, 1(s01wt01)-150/0all fertilemsfmsmsfmsf, msfms, msms(s01wt01)-235/133:1(0.111)msfmsmsfmsf, msfms, msms(s01wt01)-336/123:1(0.000)msfmsmsfmsf, msfms, msms(s01wt01)-439/143:1(0.057)msfmsmsfmsf, msfms, msms(s01wt01)-546/0all fertilemsfmsmsfmsf, msfms, msms(s01wt01)-649/0all fertilemsfmsmsfmsf, msfms, msms(s01wt01)-739/163:1(0.491)msfmsmsfmsf, msfms, msmstab 1. segregation ratio for fertility and sterility in the f2 generation(x2= 3.84) f1 植株基因型 f2 群體基因型115同時這 7 株 f1 植株與輪回親本回交來建立 bc1 群體。根據(jù) f1 植株基因型鑒定結果將bc1 代的植株分為甲型兩用系方向和臨時保持系方向（表 2）。在下一世代中，從 bc1 代兩 個方向的群體中各選出 7 株植株分別與輪回親本回交，同時這些植株與 s01 測交鑒定基因型， 即得到了 bc2 群體。在 bc2 群體中，選擇基因型為 msfms 和 msfms 的植株繼續(xù)進行回交轉 育，即 bc2 代兩用系方向 msfms 植株和臨時保持系方向 msfms 植株被保留，淘汰 msfmsf 植株（表 3）。測交鑒定遺傳模式如圖 4。按照這一程序，選育出 bc3，bc4 代甲型兩用系方向和臨時保持系方向。120fig. 4. genetic model for test cross表 2 bc1甲型兩用系方向和保持系方向的鑒定tab 2. identification of the ab line direction and temporary maintainer direction in bc1125回交一代轉育方向f1 植株基因型bc1 植株基因型(s01wt01)-1wt01保持系方向msfmsmsfmsmsfmsf(s01wt01)-2wt01兩用系方向msfmsmsfmsmsfmsf(s01wt01)-3wt01兩用系方向msfmsmsfmsmsfmsf(s01wt01)-4wt01兩用系方向msfmsmsfmsmsfmsf(s01wt01)-5wt01保持系方向msfmsmsfmsmsfmsf( s01wt01)-6wt01 (s01wt01)-7wt01保持系方向兩用系方向msfmsmsfmsmsfmsmsfmsfmsfmsmsfmsf表 3 bc2 代植株 msfms 基因型和 msfms 基因型的鑒定tab 3. genotype identification results of msfms and msfms in the bc2 generation可育株/代號理論分離比率植株基因型(x不育株20.05, 1= 3.84)s01 (bc1-4wt01)-149/0all fertilemsfmsfs01( bc1-4wt01)-223/271:1(0.320)msfmss01 (bc1-4wt01)-346/0all fertilemsfmsfs01 (bc1-4wt01)-442/0all fertilemsfmsfs01 (bc1-4wt01)-520/271:1(1.160)msfmss01( bc1-4wt01)-622/261:1(0.400)msfmss01 (bc1-4wt01)-749/0all fertilemsfmsfs01 (bc1-5wt01)-148/0all fertilemsfmsfs01 (bc1-5wt01)-245/0all fertilemsfmsfs01 (bc1-5wt01)-343/0all fertilemsfmsfs01 (bc1-5wt01)-448/0all fertilemsfmsfs01 (bc1-5wt01)-540/173:1(0.708)msfmss01 (bc1-5wt01)-638/143:1(0.103)msfmss01 (bc1-5wt01)-746/0all fertilemsfmsf130表 4 所列為烏塌菜各回交世代入選的植株基因型鑒定結果，測交結果接近理論分離比率同時植物學性狀與親本相似的植株入選。經 4 次連續(xù)回交后，每個方向選 7 株植株自交，同 時測交。根據(jù)測交結果，選擇基因型為 msfms 和 msfms 植株的自交后代作為目標群體，來 篩選甲型兩用系和臨時保持系（表 5）。135表 4 雄性不育系定向轉育過程中各個世代入選植株基因型的鑒定結果tab 4. genotype identification of selected plants in each backcross generation during transfer of the male sterile line回交代號植株代號可育株/ 理論分離比率不育株 (x2 = 3.84) 植株基因0.05, 139/14 3:1(0.057) msfmsbc1(f1wt01)-4bc2( bc1wt01)-622/261:1(0.400)msfmsbc3(bc2wt01)-724/221:1(0.087)msfmsbc4(bc3wt01)-624/231:1(0.021)msfmsbc1(f1wt01)-546/0all fertilemsfmsbc2( bc1wt01)-638/143:1(0.103)msfmsbc3(bc2wt01)-139/143:1(0.057)msfmsbc4(bc3wt01)-738/153:1(0.308)msfms型140表 5 bc4 代自交后代基因型的鑒定tab 5. genotype identification of progenies from bc4 selfing轉育方向 自交組合測交結果理論分離比率(x可育/不育20.05, 1植株基因型= 3.84)兩用系方向bc4-625/231:1(0.083)msfmsf, msfms, msms保持系方向bc4-739/103:1(0.551)msfmsf, msfms, msms145150在甲型兩用系方向植株 msfms 的自交群體中，存在三種基因型，包括 msfmsf, msfms 和 msms，表現(xiàn)為 3：1 的育性分離比率。隨機選擇 5 株可育株（msfmsf，msfms）分別與不育 株（msms）兄妹交，若兄妹交后代群體植株育性表現(xiàn)為 1:1 分離，則該兄妹交群體即為回 交 4 代甲型兩用系（表 6），在臨時保持系方向植株 msfms 的自交群體中也存在 3 種基因型，即 msfmsf, msfms 和 msms, 表現(xiàn)型為全可育。隨機選擇 16 株自交，同時與甲型兩用系方向 的不育株（msms）測交，測交后代全不育者，證明被測植株的基因型是 msms，即回交 4 代臨時保持系（表 7）。挑選甲型兩用系中的優(yōu)秀植株與保持系雜交，即獲得了烏塌菜復等位雄性不育系，gms-4（表 8）。表 6 甲型兩用系方向兄妹交基因型鑒定tab 6. genotype identification of sib mating in the ab line direction不育株/代號理論分離比率植株基因型(x可育株20.05, 1= 3.84)a-s-1b-f -125/241:1(0.020)msfmsa-s-1b-f-227/231:1(0.320)msfmsa-s-1b-f-349/0all fertilemsfmsfa-s-1b-f-450/0all fertilemsfmsfa-s-1b-f-522/261:1(0.333)msfms注： a-s 代表 bc4-6自交后代中的不育株；b-f 代表 bc4-6 自交后代中的可育株。155160表 7 臨時保持系方向植株基因型的鑒定tab 7. genotype identification of the temporary maintainer line direction不育株/代號理論分離比率可育株基因型(x可育株20.05, 1= 3.84)a-s-2(bc4-7)-126/23 1:1(0.184) msfms a-s-2(bc4-7)-2 50/0 all fertile msfmsf a-s-2(bc4-7)-329/21 1:1(1.280) msfms a-s-2(bc4-7)-4 0/45 all sterile msms a-s-2(bc4-7)-525/22 1:1(0.191) msfms a-s-2(bc4-7)-6 0/44 all sterile msms a-s-3(bc4-7)-727/26 1:1(0.019) msfms a-s-3(bc4-7)-8 48/0 all fertile msfmsf a-s-3(bc4-7)-920/26 1:1(0.783) msfmsa-s-3(bc4-7)-1022/27 1:1(0.510) msfmsa-s-3(bc4-7)-1122/26 1:1(0.333) msfmsa-s-4(bc4-7)-120/44 all sterile msmsffa-s-4(bc4-7)-1349/0 all fertile ms msffa-s-4(bc4-7)-1442/0 all fertile ms msa-s-4(bc4-7)-1524/27 1:1(0.176) msfms4a-s-4(bc -7)-1625/23 1:1(0.083) msfms165表 8 烏塌菜雄性不育系基因型鑒定tab 8. genotype identification of the male sterile line of wutacai代號 組合不育株/理論分離比率植株基因型(x可育株20.05, 1= 3.84)170gms-4 a-s-2(bc4-7)-40/45 all sterile msms2.4雄性不育系不育性的評估為了評價烏塌菜不育系的“不育度”，從 100 棵植株中隨機選擇 1000 朵花（每株每花序10 朵，其余去除）套袋隔離，防止外界授粉。記錄由授粉袋內花朵所結種莢數(shù)。為了評估“不 育率”，種植 100 株 gms-4 植株，記錄每棵植株花朵育性（有花粉的植株）。結果表明，gms-4 不育性穩(wěn)定且徹底，具有 100%不育度和 100%不育株率。圖 9 gms-4 的育性鑒定tab 9. fertility identification of gms-4 in the wutacai不育系總花數(shù)結種子數(shù)不育度總株數(shù)可育植株不育率gms-410000100%1000100%1752.5雜交組合產量分析采用隨機區(qū)組實驗調查小區(qū)產量，小區(qū)面積 3m1.5m，株行距 30 cm 50 cm。利用新 育成的 gms-4 作為母本與四個優(yōu)良自交系 p1, p2, p3, p4 雜交，獲得四個雜交組合。進行品比 實驗。vitamin 品種作為對照。方差分析結果如表 10 所示，處理間達到極顯著差異水平。 采用新復極差法進行多重比較，結果表明 c4 和 c1 組合產量極顯著高于對照，小區(qū)產量分 別達到 15.81 kg，14.82 kg。180圖 10 烏塌菜雜交組合小區(qū)產量tab 10. plot yields of hybrid combinations in wutacaireplicationplot yieldcodecombination kg/4.5m2ck vitaminc1gms-4p1c2gms-4p2c3gms-4p3c4gms-4p410.8015.5410.1611.9416.869.0014.3111.6113.3615.4110.8014.619.4815.3615.1510.2014.82 *10.4213.55 *15.81 *185注：*顯著差異水平 5%，*顯著差異水平 1%。2.6雜交組合品質分析每個小區(qū)隨機采集樣本（葉片），三次重復，采用化學方法進行成分分析。方差分析結 果表明，處理間達到極顯著差異水平。烏塌菜各雜交組合營養(yǎng)成分整體處于較高水平，但是 某些成分含量低于對照。在四個雜交組合中，c1 組合表現(xiàn)較為突出，蛋白含量，維生素 c 含量顯著高于對照水平，可溶性糖含量顯著高于其他組合但低于對照水平，有機酸含量和粗 纖維含量顯著低于對照水平，而且微量元素含量也處于較高水平。表 11 烏塌菜雜交組合成分分析tab 11. components analysis of hybrid combinations in wutacaisoluble sugar（g/100g）protei n mg/10gvc mg/100g201.37organ ic acids%mg/100gmg/100gmg/100gmg/100gmg/100g21.2515.3160.54210.6120.16520.9206.2310.29110.8240.144*18.8285.4460.33110.4980.370*15.9134.5480.27510.670*0.11513.4096.5100.37911.0760.320*crude kfiber%p feca znck 1.756 3.4933.660c1 1.761*c2 1.570 3.4643.591c3 1.750*c4 1.545 3.4243229.342*186.117198.830191.2030.328 4.7980.194 4.0965.916*0.176*0.145 3.9145.4400.254*190注：*顯著差異水平 5%，*顯著差異水平 1%。3結論不育性穩(wěn)定且完全不育的不育系非常適合于十字花科蔬菜的育種，而且潛在的雜種優(yōu)勢 已有報道6。對于具有這些特性的復等位基因雄性不育系的育種研究工作已經被實施，并且195200205210215220225230235240幾乎在所有的大白菜生態(tài)型中獲得成功16-19。這類不育性也適用于其他的蕓薹屬亞種蔬菜作 物，包括小白菜20-23（b. campestris l. ssp. chinensis），中國菜心25（b. campestris ssp. parachinensis），和紫菜薹等25（b. campestris ssp. chinensis var. purpurea hort.）。然而具有 完全不育性且植物學性狀與目標親本相似的烏塌薹不育系至今未見報道。在本研究中，按照 “定向轉育計劃”，奶白菜復等位雄性不育基因被成功的轉入烏塌菜中。獲得了具有 100%不 育度和 100%不育株率的烏塌菜核復等位基因雄性不育系 gms-4。定向轉育是烏塌菜雄性不育系轉育過程中的關鍵。因為烏塌菜不育系本身相當于雜交 種，再配制雜交組合相當于三交種，為了保證整齊度，在轉育不育基因的同時要兼顧植物學 性狀和經濟性狀的轉育26。按照“定向轉育計劃”，在連續(xù)的回交之后， “兩用系”和“保持系” 相當于姊妹系，與目標品系具有相似的植物學性狀。因為具有相似的遺傳背景，由此系統(tǒng)育 成的雄性不育系的遺傳特性非常穩(wěn)定。進一步講，由此不育系配成的雜交種具有較高整齊度。一個具有高品質且具有與目標品系植物學性狀相近的不育源材料是轉育優(yōu)良不育系的 前提。本研究也選擇了一個蕓薹屬亞種蔬菜，奶白菜為雄性不育源。奶白菜具有葉色濃綠， 葉片褶皺有光澤，味道鮮美，營養(yǎng)豐富等特點。由于不育源與目標品系之間具有許多相似之 處，使得轉育進程大大加快?；亟皇来倪x擇對于定向轉育的影響也十分重要?；亟淮鷶?shù)不足，達不到定向轉育效果，回交代數(shù)過多，易造成自交衰退現(xiàn)象。因此在定向轉育進程中，回交代數(shù)應當由回交群體與 目標品系的相似度來確定。本實驗中，經過 4 次回交轉育成的不育系 gms-4，在植物學性 狀上與 wt01 近乎一致，且沒有任何衰退現(xiàn)象。對于烏塌菜定向轉育不育系而言，回交 4 次是一個合適的選擇。以 gms-4 為母本生產的雜交組合表現(xiàn)出顯著的雜種優(yōu)勢，而且雜交組合的營養(yǎng)成分含 量也達到商業(yè)生產所需水平。一些雜交組合間產量達到了極顯著差異水平。c4 產量最高， 隨后依次是 c1,c3,c2。與對照相比較，由高到低順序依次增產 54.9%，45.3%，32.8%和 2.2%。 類似的產量雜種優(yōu)勢在其他蕓薹屬作物中也有報道27-29。由不育系配成的雜交組合的營養(yǎng)成 分含量高于常規(guī)品種的平均水平3, 30-31。成分分析實驗結果顯示在各處理間均達到極顯著差 異水平。c1 組合大部分營養(yǎng)成分含量極顯著高于對照，有機酸含量和粗纖維含量低于對照 說明其口感更好。因此，綜合考慮產量和品質因素，選出一個最優(yōu)組合 c1。參考文獻 (references)1 李署軒.中國蔬菜百科全書(蔬菜卷)m.北京：農業(yè)出版社，1990. 2 李振英. 稀有蔬菜栽培技術m. 北京：科學技術出版社，2000.3 舒英杰，周玉麗. 中國烏塌菜研究j. 安徽師范學院學報，2005，19(3)：15-18.4 譚興，王玉剛. 菜薹和烏塌菜核不育位點基因頻率j. 沈陽農業(yè)大學學報，2008，39(2)：348-350.5 havey m j. the use of cytoplasmic male sterility for hybrid seed productionj. molecular biology andbiotechnology of plant organelles, 2004, 23(4)：623-634.6 柯桂蘭，趙稚雅，宋胭脂. 大白菜細胞質雄性不育系 cms3411-7 的轉育和應用j. 園藝學報，1992，19：333-340.7 張書芳，宋兆華，趙雪云. 大白菜細胞核基因互作雄性不育系選育及應用模式j. 園藝學報，1990，17：117-1258 徐巍，王玉剛. 奶白菜核復等位基因雄性不育系 ai203 的定向轉育研究j. 園藝學報，2007，34：659-664.9 馮輝，巍玉堂，許明. 大白菜核復等位基因雄性不育系的遺傳模式及其驗證j.中國科學技術協(xié)會第二 屆青年學術年會園藝學論文集，1995，458-466.10 徐巍，馮輝，劉慧英. 青梗白菜細胞核雄性不育基因向烏塌菜中的轉育j. 西北農業(yè)學報，2011，20(4)：116-119.11 李合生. 植物生理生化實驗原理及技術m. 北京：高等教育出版社，2000.12 史樹德，孫亞卿，巍磊. 植物生理學實驗指導m. 北京：中國林業(yè)出版社，2011.13 chun y l, chung s l. a modified coomassie brilliant blue g 250 staining method 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