GB29688-2013食品安全國家標準牛奶中氯霉素殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法.pdf

ICS G 中 華 人 民 共 和 國中 華 人 民 共 和 國 國國 家 標 準家 標 準 GB 296882013 食品安全國家標準 牛奶中氯霉素殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 Determination of Chloramphenicol residues in milk by Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometric method （電子版本僅供參考，以標準正式出版物為準） 2013-09-16 發(fā)布 2014-01-01 實施 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會 發(fā)布 I 目目 次次 目 次 . I 前 言 . II 牛奶中氯霉素殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 . 1 范圍 . 2 規(guī)范性引用文件 . 3 原理 . 4 試劑和材料 . 5 儀器和設(shè)備 . 6 樣品的制備與保存 . 6.1 樣品的制備 . 6.2 樣品的保存 . 7 測定步驟 . 7.1 提取 . 7.2 凈化 . 7.3 標準曲線的制備 . 7.4 測定 . 7.5 空白試驗 . 8 結(jié)果計算和表述 . 9 檢測方法靈敏度、準確度、精密度 . 9.1 靈敏度 . 9.2 準確度 . 9.3 精密度 . 附錄 A . II 前前 言言 本標準的附錄 A 為資料性附錄。 本標準系國內(nèi)首次發(fā)布的國家標準。 牛奶中氯霉素殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 1 范圍范圍 本標準規(guī)定了牛奶中氯霉素殘留量檢測的制樣和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。 本標準適用于牛奶中氯霉素殘留量的檢測。 2 規(guī)范性引用文件規(guī)范性引用文件 下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。 GB/T 1.1-2000 標準化工作導則 第 1 部分：標準的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則 GB/T 6682-1992 分析實驗室用水規(guī)則和試驗方法 3 原理原理 試料中殘留的氯霉素，用乙酸乙酯提取，正己烷除脂，C18柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，內(nèi)標法定量。 4 試劑和材料試劑和材料 以下所用的試劑，除特別注明者外均為分析純試劑；水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。 4.1 氯霉素標準品：含量97%。 4.2 內(nèi)標物：氘代氯霉素標準品：含量為 100g/mL（作為內(nèi)標物標準貯備液）。 4.3 甲醇：色譜純。 4.4 乙腈：色譜純。 4.5 乙酸乙酯 4.6 氯化鈉 4.7 正己烷 4.8 C18固相萃取柱：500 mg/3 mL，或相當者。 4.9 4%氯化鈉溶液 ：取氯化鈉 4g，用水溶解并稀釋至 100 mL。 4.10 100 g/mL 氯霉素標準貯備液：精密稱取氯霉素標準品 10 mg，于 100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為 100 g/mL 的氯霉素標準貯備液。 -20以下保存，有效期 1 年。 4.11 100 g/L 氯霉素標準工作溶液 精密量取 100 g/mL 氯霉素標準貯備溶液 100 L，于 100 mL量瓶中，用 50%乙腈溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為 100 g/L 的標準工作液。28保存，有效期1 個月。 4.12 20 g/L 氘代氯霉素標準工作溶液 精密量取氘代氯霉素標準品 20 L，于 1000 mL 量瓶中，用50%乙腈溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為 20 g/L 的氘代氯霉素標準工作液。28保存，有效期 3個月。 5 儀器和設(shè)備 5.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源。 5.2 分析天平：感量 0.000 01 g。 5.3 天平：感量 0.01 g。 5.4 漩渦振蕩器 5.5 振蕩器 5.6 組織勻漿機 5.7 冷凍離心機 5.8 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 5.9 離心管：50 mL。 5.10 雞心瓶：50 mL 5.11 固相萃取裝置 5.12 氮吹儀 5.13 濾膜：0.22 m。 6 試料試料的制備與保存的制備與保存 6.1 試料的制備 取適量新鮮或冷藏的空白或供試牛奶，混合，并使均質(zhì)。 取均質(zhì)后的供試樣品，作為供試試料。 取均質(zhì)后的空白樣品，作為空白試料。 取均質(zhì)后的空白樣品，添加適宜濃度的標準工作液，作為空白添加試料。 6.2 試料的保存 -20以下保存。 7 測定步驟測定步驟 7.1 提取 取試料（10 0.05）g，于50 mL離心管中，加氘代氯霉素內(nèi)標工作液250 L，再加乙酸乙酯20 mL，振蕩15 min，6 000 r/min離心10 min，取乙酸乙酯層液于雞心瓶中。再加乙酸乙酯20 mL重復(fù)提取一次，合并兩次提取液于雞心瓶中，于45水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用4%氯化鈉溶液5 mL溶解殘留物，加正己烷5 mL振蕩混合1 min，靜置分層，棄正己烷液。再加正己烷5 mL，重復(fù)提取一次。取下層液備用。 7.2 凈化 C18柱依次用甲醇 5 mL 和水 5 mL 活化，取備用液過柱，控制流速 1 滴/34s，用水 5 mL 淋洗，抽干，用甲醇 5 mL 洗脫，收集洗脫液，于 50氮氣吹干。用 50%乙腈 1.0 mL 溶解殘余物，渦旋混勻，濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。 7.3 標準曲線的制備 精密量取100 g/L氯霉素標準工作溶液和20 g/L氘代氯霉素內(nèi)標工作溶液適量，用流動相稀釋，配制成氯霉素濃度為0.10、0.25、0.50、1.0、2.0、5.0 g/L，氘代氯霉素濃度為5g/L的系列標準溶液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。 7.4 測定 7.4.1 液相色譜條件 色譜柱： C18（150 mm 2.1 mm，粒徑 5 m） ，或相當者； 柱溫：30； 流速：0.2 mL/min； 進樣量：20 L； 運行時間：8 min； 流動相：乙腈+水（50+50，v/v）； 7.4.2 質(zhì)譜條件 電離模式： ESI； 掃描方式：負離子掃描； 檢測方式：多反應(yīng)檢測； 電離電壓：2.8 kV； 源溫：120； 霧化溫度：350； 錐孔氣流速：50 L/h； 霧化氣流速：450 L/h； 數(shù)據(jù)采集窗口：8 min； 駐留時間：0.3s； 定性、定量離子及對應(yīng)的錐孔電壓和碰撞電壓見表 1 表1 氯霉素定性、定量離子對和錐孔電壓及碰撞電壓 藥物 定性離子對 m/z 定量離子對 m/z 錐孔電壓 V 碰撞電壓 V 氯霉素（CAP） 321/151.6 321/151.6 30 15 321/256.8 13 氘代氯霉素（D5-CAP） 325.8/156.6 325.8/156.6 30 15 7.4.3 測定法 取試樣溶液和相應(yīng)的標準溶液，作單點或多點校準，按內(nèi)標法以峰面積比計算。對照溶液及試樣溶液中氯霉素和氘代氯霉素的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。試樣溶液中的離子相對豐度與標準溶液的離子相對豐度比符合表2的要求。 標準溶液和空白組織添加試樣溶液的總離子流和選擇離子流圖見附錄A。 表2 試樣溶液中離子相對豐度的允許偏差范圍 相對豐度（%） 允許偏差（%） 50 20 2050 25 1020 30 10 50 7.5 空白試驗 除不加試料外，采用完全相同的測定步驟進行平行操作。 8 結(jié)果計算和表述結(jié)果計算和表述 計算A321/151.6/A325.8/156.6峰面積比值，標準曲線校準。 由標準曲線方程： As/Ais=acs/cis + b 求得a和b，則 cis A c= （ - b） a Ais 試料中氯霉素殘留量（g/kg）：按下式計算： mVCX 式中: X供試供試試料中氯霉素的殘留量，g/kg； As 對照溶液中氯霉素的峰面積； AiS 對照溶液中內(nèi)標氘代氯霉素的峰面積； cs 對照溶液中內(nèi)標氘代氯霉素的濃度，ng/mL； cis 對照溶液中氯霉素的濃度，ng/mL； c 供試溶液中氯霉素的濃度，ng/mL； cis 試樣中氘代氯霉素的濃度，ng/mL； A 試樣中氯霉素的峰面積； AiS 試樣中內(nèi)標氘代氯霉素的峰面積； V 溶解殘余物的體積，mL； m 供試試料質(zhì)量，g。 注：計算結(jié)果需扣除空白值，測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。 9 檢測方法靈敏度、準確度、精密度檢測方法靈敏度、準確度、精密度 9.1 靈敏度 本方法檢測限為0.01 g/kg，定量限為0.1 g/kg。 9.2 準確度 本方法在0.020.10 g/kg添加濃度水平上的回收率為50%120%。 9.3 精密度 本方法的批內(nèi)相對標準偏差17%，批間相對標準偏差20%。 附錄 A （資料性附錄） Time0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.00%50.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.00%120.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.00%270.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.00%2405STD-2MRM of 3 Channels ES- 325.8 156.66.41e33.38405STD-2MRM of 3 Channels ES- 321 256.84353.402.872.170.210.741.380.981.945.244.344.085.044.646.455.785.486.137.836.647.506.92405STD-2MRM of 3 Channels ES- 321 151.69533.402.031.615.046.467.85405STD-2MRM of 3 Channels ES- TIC7.76e33.38 圖 A1 氯霉素標準溶液總離子和特征離子質(zhì)量色譜圖（0.25 g/L） 圖A2 牛奶空白試樣特征離子質(zhì)量色譜圖 Time0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.00%50.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.00%120.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.00%200.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.00%2M6-4MRM of 3 Channels ES- 325.8 156.65.48e33.36M6-4MRM of 3 Channels ES- 321 256.85213.401.961.8