琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制

琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制,學(xué)習(xí)動(dòng)物的處死與組織勻漿的方法。 學(xué)習(xí)離心機(jī)的使用方法。 進(jìn)一步理解酶的競爭抑制原理。,實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?實(shí)驗(yàn)原理：,競爭性抑制是指分子結(jié)構(gòu)與底物相似的抑制劑可與底物競爭性結(jié)合酶的活性中心，抑制酶的活力。競爭性抑制劑的抑制程度取決于抑制劑與酶的親和力及與底物的相對(duì)比例。 草酸與琥珀酸的分子結(jié)構(gòu)相似，是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑。琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸。在體內(nèi)，琥珀酸脫下的2H 經(jīng)電子傳遞鏈傳遞，最后與氧結(jié)合生成水，并釋放出能量。在體外則可用甲烯藍(lán)（藍(lán)色）作為受氫體，甲烯藍(lán)接受琥珀酸脫下的2H 而被還原為甲烯白（無色）。在甲烯蘭含量一定的條件下，藍(lán)色消退的快慢程度可指示琥珀酸脫氫酶的活力，因此，可依據(jù)藍(lán)色消退時(shí)間來判斷該酶活力被抑制的程度。,06,二、實(shí)驗(yàn)原理,抑制劑和底物的結(jié)構(gòu)相似，可與底物競爭酶的活性中心，阻礙酶-底物復(fù)合物的形成。,酶的競爭性抑制作用,抑制程度取決于抑制劑與酶的相對(duì)親和力以及抑制劑與底物濃度的相對(duì)比例（I/S）,HOOCCH2CH2COOH,HOOCCH=CHCOOH,FAD,FADH2,MBH2甲烯白（無色）,MB甲烯藍(lán)（藍(lán)色）,在無氧條件下，以甲烯藍(lán)褪色時(shí)間來判斷琥珀酸脫氫酶活性的改變。,草酸 HOOCCOOH,琥珀酸脫氫酶,實(shí)驗(yàn)器材與試劑:,（一）試劑 pH=7.4的磷酸緩沖液 0.25%琥珀酸鈉溶液 0.5%草酸鈉溶液 0.01%甲烯藍(lán)溶液 生理鹽水 液體石蠟,實(shí)驗(yàn)器材與試劑：,（二）器材 研缽.手術(shù)剪.手術(shù)鑷子 2mL移液管 1000 uL微量可調(diào)儀器 10mL離心管 低速離心機(jī),實(shí)驗(yàn)操作：,(1)肝糜液的制備 用頸椎脫臼法處死小白鼠 將肝臟取出置于研缽，用生理鹽水洗凈，剪碎肝臟充分研磨至糊狀 分批加入磷酸緩沖液，邊加邊磨，總共7ml 攪勻后倒入圓底離心管，離心3分鐘 將上清液倒入一支試管中備用，即為含有琥珀酸脫氫酶的肝糜液,實(shí)驗(yàn)操作： 另取中試管5支，標(biāo)號(hào) 琥珀酸脫氫酶活力的測定,搖勻，靜置于37攝氏度的水浴中（此后再勿搖動(dòng)）注意觀察各管的顏色變化，記錄各管顏色消退的順序和時(shí)間，分析原因，振蕩褪色的反應(yīng)液，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象并分析產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因。,1肝臟一定要充分研磨至糊狀，一使琥珀酸脫氫酶盡量釋放到溶液里 2離心時(shí)注意離心管一定要精確平衡，并將重要相等的離心管對(duì)稱放置 3離心結(jié)束后拿取離心管時(shí)動(dòng)作要輕柔，不要振蕩離心管，以免肝糜液重新變渾濁,注意事項(xiàng)：,思考題：,1:為什么反應(yīng)開始后，反應(yīng)液必須靜止，不能在搖動(dòng)? 避免空氣中的氧接觸反應(yīng)溶液，使的還原性的甲烯白重新氧化成甲烯藍(lán),思考題：,2:本實(shí)驗(yàn)為何選擇肝臟來提取琥珀酸脫氫酶？本實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵是什么？,思考題：,3：抑制劑還可以選用什么物質(zhì)？ 還可以選用丙二酸 4：利用本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，說明酶競爭性抑制的特點(diǎn)？ 競爭性抑制劑往往是酶的底物類似物或反應(yīng)產(chǎn)物；b.抑制劑與酶的結(jié)合部位與底物與酶的結(jié)合部位相同；c.抑制劑濃度越大，則抑制作用越大；但增加底物濃度可使抑制程度減??；d.動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Km值增大，Vm值不變。,思考題：,5：本試驗(yàn)在設(shè)計(jì)上存在某些缺陷，指出存在的缺陷與改進(jìn)方案？,補(bǔ)充：,琥珀酸脫氫酶（Succinatedehydrogenase，簡稱SDH），黃素酶類，是線粒體內(nèi)膜的結(jié)合酶，屬膜結(jié)合酶，是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，可為真核細(xì)胞線粒體和多種原核細(xì)胞需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子，為線粒體的一種標(biāo)志酶。 琥珀酸脫氫酶有兩種，一種是以泛醌作為受體的，另一種是作用于所有受體。,琥珀酸脫氫酶活力測定方法目前主要有五種 1.硫酸甲酯吩嗪（PMS）反應(yīng)法 2.鐵氰化鉀K3Fe（CN）6還原法 3.TTC（氯化三苯四氮唑）法 4.MTT法 5.NBT（氯化硝基四氮唑藍(lán)）法,1.硫酸甲酯吩嗪（PMS）反應(yīng)法 琥珀酸脫氫酶能通過一系列人工電子受體，如與PMS（吩嗪二甲酯硫酸鹽），DCPIP（2，6-二氯酚靛酚）等發(fā)生反應(yīng)催化琥珀酸的氧化，而借助這些中間產(chǎn)物的顏色變化，通過分光光度計(jì)檢測即可加以定量反映，其反應(yīng)式為：SuccinatePMSFumaratePMSH2；PMSH2DCPIPPMSDCPIPH2。DCPIP呈藍(lán)色，標(biāo)準(zhǔn)的吸收光譜在600nm處，這種色澤可因其還原而漸次變淡，從而600nm處的光密度的變化與DCPIP含量成正比，測定2.6-DPIP的還原速度可以推算出SDH的活力。一分子DCPIP被還原，即代表一分子琥珀酸被氧化。故可測定此反應(yīng)系統(tǒng)在600nm處的吸收光度變化，來計(jì)算SDH的活性。SDH活性計(jì)算：（標(biāo)準(zhǔn)測定）/標(biāo)準(zhǔn)=mol/min/mg。,2.鐵氰化鉀K3Fe（CN）6還原法 以鐵氰化鉀K3Fe（CN）6和琥珀酸鈉為底物，使琥珀酸脫氫酶催化反應(yīng)將鐵氰化鉀還原為亞鐵氰化鉀K4Fe（CN）6，K4Fe（CN）6再與Fe3作用生成普魯士藍(lán)，在700nm波長測定吸光值，以檢測普魯士藍(lán)之生成量，作為琥珀酸脫氫酶的還原力，吸光值愈高表示琥珀酸脫氫酶活力愈強(qiáng)。,3.TTC（氯化三苯四氮唑）法 無色TTC（2，3，5-氯化三苯基四唑）作為人造受氫體，它在細(xì)胞呼吸過程中接受氫，還原成三苯基甲膳（TF）。后者以紅色晶體的形式存在于細(xì)胞內(nèi)，采用有機(jī)溶劑（如甲苯、乙酸乙醋、三氯甲烷、丙酮或乙醇等）進(jìn)行萃取。萃取液測定485nm吸光度后，以TTC還原量表示脫氫酶活性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TF生成量，進(jìn)而求出TTC-脫氫酶活性,4.MTT法 MTT是一種黃顏色的染料?；罴?xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT，同時(shí)在細(xì)胞色素C的作用下生成藍(lán)色（或藍(lán)紫色）不溶于水的甲臜（Formazana），經(jīng)異丙醇作用顆粒溶解顯色。在通常情況下，甲臜生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)光密度570nm處OD值推測出活細(xì)胞的數(shù)目。,5.NBT（氯化硝基四氮唑藍(lán)）法 NBT易溶于水，呈淡黃色，以NBT為受氫體，接受由琥珀酸鈉鹽被酶作用而脫下的氫，進(jìn)而形成紫藍(lán)色的沉淀，于反應(yīng)體系中加入PMS，混勻，37保溫30min，之后加入TCA終止反應(yīng)。加異丙醇溶解顯色，混勻，即可于548nm測OD值。規(guī)定：30min內(nèi)548nm下OD值為1.0時(shí)的酶量為1個(gè)活力單位。比活力=活力單位數(shù)/毫克蛋白。,競爭性抑制的機(jī)理, 競爭性抑制劑往往是酶的底物類似物或反應(yīng)產(chǎn)物； 抑制劑與酶的結(jié)合部位（活性中心）與底物與酶的結(jié)合部位相同； 抑制劑濃度越大，則抑制作用越大；但增加底物濃度可使抑制程度減小； 動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Km值增大，Vm值不變。抑制程度取決于抑制劑與酶的親和力及與底物的相對(duì)比例 注意：結(jié)合在酶的同一部位以及結(jié)構(gòu)類似并不是競爭性抑制的必要條件，抑制劑結(jié)合的部位阻礙底物和酶的結(jié)合，即產(chǎn)生空間位阻也可以造成競爭性抑制。,琥珀酸脫氫酶,琥珀酸脫氫酶是唯一嵌入到線粒體內(nèi)膜的酶