抗生素產生菌的菌種篩選及優(yōu)化.ppt

第一章 抗生素產生菌的菌種及培養(yǎng),1、抗生素與產生菌,半數(shù)以上抗生素由放線菌產生；真菌與細菌。 放線菌抗生素兩千多種，主要由鏈霉菌屬產生。,真菌抗生素,真菌抗生素有數(shù)百種，主要是點青霉和產黃青霉產生的青霉素，蕁麻青霉和灰黃青霉產生的灰黃霉素。 灰黃霉素抗真菌（皮膚病與灰指甲?。瑢毦鸁o效。 青霉素抗G+菌有效，對G-菌作用很弱，對人的副作用小，有過敏反應。,青霉素是一類群化合物，不同青霉素的側鏈R各異。常用青霉素G，R為苯甲基。低濃度抑菌，高濃度殺菌。有的細菌產生青霉素酶，使酰胺環(huán)開裂而失去作用。苯甲基青霉素鈉鹽0.6g 為一個單位，1mg苯甲基青霉素鈉鹽等于1，667個單位。 細菌抗生素多是多肽類化合物。如短桿菌的短桿菌素S，枯草芽孢桿菌的枯草桿菌肽，多粘芽孢桿菌的多粘菌素等，對動物有毒性，只限外用。,抗生素產生菌的分離和篩選,目前新抗生素的獲得途徑： 1、從自然界分離篩選新抗生素產生菌 從土壤到海洋 一般常見到極端微生物 從微生物到植物、海洋生物。 2、改造現(xiàn)有的已知抗生素的產生菌，再經(jīng)篩選獲得新得抗生素產生菌。 3、從已知的抗生素進行結構改造，經(jīng)篩選獲得新的半合成抗生素。,4、采用新的篩選方法 如：應用定向生物合成和突變生物合成的原理，以及培養(yǎng)超敏細菌以尋找微量的抗生素，選用新的腫瘤模型來篩選抗腫瘤的抗生素。,5、采用現(xiàn)代分子生物學技術產生新抗生素 （1）基因克隆產生新抗生素：首先獲得某已知抗生素的結構基因，然后通過一定的載體將基因片段導入特定的另一種抗生素產生菌中，則可能產生完全符合人們設計要求的新抗生素。 （2）沉默基因的激活： 引入抗生素生物合成的調控基因，有可能激發(fā)抗生素產生菌處于休眠狀態(tài)或沉默狀態(tài)的基因系統(tǒng)，從而開啟另一結構抗生素的生物合成開關，得到新抗生素。,絕大多數(shù)抗生素的原始產生菌是從自然界分離篩選獲得，以傳統(tǒng)的分離土壤放線菌為例，說明新抗生素產生菌的常規(guī)分離和篩選過程。,一、土壤微生物的分離 1、采土 以春、秋兩季采土為宜。去除表土， 采取5-10cm深處的土壤，裝入無菌容器。 2、分離菌株 將2-4克土壤均勻散布水中待其沉降，上清部分經(jīng)適當稀釋后（一般為10-3-104），涂布于適宜培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)，挑取單個菌落移種純培養(yǎng)，根據(jù)菌落的特征，初步排除相同菌。,二、篩選 ：是指從大量待篩選微生物中，盡快地鑒別出有實用價值的抗生素產生菌的實驗過程。,1、篩選模型： 是指篩選工作中所使用的實驗菌。為了避免感染病原菌的危險，盡可能選用非致病的、且能代表某些類型致病菌的微生物作為實驗菌。,常用的實驗菌和代表的致病微生物,實驗菌 代表的致病微生物 金黃色葡萄球菌 革蘭陽性球菌 枯草芽孢桿菌 革蘭陽性桿菌 恥垢分支桿菌 結核分枝桿菌 大腸埃希菌 革蘭陰性桿菌 白假絲酵母菌 酵母狀真菌 曲霉 絲狀真菌 噬菌體 病毒、腫瘤細胞,2、篩選方法 抗菌抗生素一般采用瓊脂擴散法。,先制備含實驗菌的平板，然后以無菌濾紙片蘸取各放線菌的搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵液或切取一定大小的放線菌瓊脂培養(yǎng)塊，置于含菌平板上，培養(yǎng)后觀察有無抑菌圈產生。,無分支單細胞微生物的群體生長曲線,1.遲緩期 （1）主要特征：代謝活躍，大量合成細胞分裂所需的酶類、ATP等；體積增大；分裂遲緩。 （2）原因：在新的環(huán)境，缺乏分解或催化相關底物的酶。 （3）縮短和消除遲緩期的方法有：增加接種量、采用最適種齡、選用繁殖速度快的菌種以及盡量保持接種前后所處的培養(yǎng)基介質和條件一致。,2.對數(shù)期 （1）特點：分裂速度最快、代時最短、代謝活動旺盛、對環(huán)境變化敏感。 （2）作用：作為代謝、生理等研究的好材料和發(fā)酵生產中用作種子的最佳菌齡。,3.穩(wěn)定期 （1）特點：新生的細胞和死亡的細胞數(shù)目相等、總菌數(shù)達到最大值、代謝活力鈍化。 （2）原因：營養(yǎng)物質的逐漸消耗以及代謝廢物的積累抑制了生長。 （3）功能：產生次生代謝產物（抗生素、生物堿、色素等）、芽孢；對穩(wěn)定期的研究發(fā)展了連續(xù)培養(yǎng)技術。,4.死亡期 特點：活的細胞數(shù)目以對數(shù)速率急劇下降、細胞裂解 或自溶。,1.微生物群體生長的規(guī)律,生長曲線代表在新的適應環(huán)境中生長、分裂直至衰老、死亡全過程的動態(tài)變化規(guī)律。分為遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和死亡期四個主要的時期。 生長曲線的不同時期反映的是群體而不是單個細胞的 生長規(guī)律。 認識和掌握微生物的生長曲線有重要的實踐意義。如 設法縮短遲緩期、延長對數(shù)期以及在穩(wěn)定期收集菌體。,絲狀微生物的群體生長 1.特征：絲狀生長和沉淀生長兩種方式。 2.絲狀微生物生長以單位時間內微生物的物質量的變化來 表示。,三、連續(xù)培養(yǎng),（一）分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng) 1.概念： 分批培養(yǎng)：指將微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中，經(jīng) 過培養(yǎng)生長，最后一次收獲的培養(yǎng)方式。 連續(xù)培養(yǎng)：在一個恒定容積的流動系統(tǒng)中培養(yǎng)微生物，一方面以一定速率不斷地加入新的培養(yǎng)基，另一方面又以相同的速率流出培養(yǎng)物(菌體和代謝產物)，以使培養(yǎng)系統(tǒng)中的細胞數(shù)量和營養(yǎng)狀態(tài)保持穩(wěn)定。,2.連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)的類型,第三節(jié) 環(huán)境因素對微生物生長的影響,一、溫度,溫度太低：使原生質膜處于凝固狀態(tài)，不能正常進行 營養(yǎng)物質的運輸或形成質子梯度。 溫度太高：蛋白質、核酸和細胞的其他組成發(fā)生不可 逆的變形作用。 最低生長溫度 三種基本溫度 最適生長溫度 最高生長溫度,根據(jù)生長溫度分類： 1. 嗜冷微生物 2.嗜溫微生物 3.嗜熱微生物 4.嗜高熱微生物,小結：,1.嗜冷微生物能夠在低溫條件下生長的原因是：其所含 的酶在低溫能有效地催化生化反應；在低溫下主動運輸 仍能正常進行，有效的吸收必須的營養(yǎng)物質，是其原生 質膜中含有較多的不飽和脂肪酸，在低溫下仍可維持膜 的流動性。 2.嗜高溫微生物在高溫條件下生長的原因是：其酶和其他蛋白質在高溫時更穩(wěn)定；其蛋白質合成機構和細胞質膜（富含飽和脂肪酸等）等結構成分是熱穩(wěn)定。,3.微生物耐熱性在實踐中的重要性： 發(fā)酵生產的優(yōu)點是發(fā)酵周期短，效率高；有利于非 氣體物質在發(fā)酵液中的擴散和溶解，以及防止雜菌的污 染；可節(jié)約冷卻發(fā)酵熱量所需的成本。,二、pH,1.pH影響微生物生長的原因：介質pH影響生活環(huán)境中 營養(yǎng)物質的可給態(tài)和有毒物質的毒性；影響菌體細胞膜 的帶電荷性質、膜的穩(wěn)定性及膜對物質的吸收能力；使 菌體表面蛋白變性或水解。 2.分類： 嗜酸性微生物（pH5.4） 嗜中性微生物（pH5.4pH8.5） 嗜堿性微生物（ pH7.0 pH11.5）,3.嗜酸或嗜堿微生物耐酸或耐堿的原因：主要是由于 細胞本身具有維持胞內pH值接近中性的能力。嗜酸微生 物在酸性環(huán)境中，細腦膜可以阻止H進入胞內、不斷將 胞內H排出胞外。而嗜堿或耐堿微生物，則可以阻止 OH進人胞內并將其排出胞外，以維持胞內接近中性pH。,生產中常用菌種的分離、選育和保藏,帶圖象分析系統(tǒng)的微生物菌種 顯微觀察裝置,一、菌種的來源,根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買； 從大自然中分離篩選新的微生物菌種。,二、分離思路,新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準確地把所需要的菌種挑選出來。 實驗室或生產用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進行分離純化。 有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進的設備與之配合。,定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。 采樣：有針對性地采集樣品。 增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。 分離：利用分離技術得到純種。 發(fā)酵性能測定：進行生產性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產品品種和產量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。,三、新種分離與篩選的步驟,（一）采樣,1、采樣對象 以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。,從自然界篩選,2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。 3、采土方式：在選好適當?shù)攸c后，用小薩子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。,培養(yǎng)基的組成原則,大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復雜底物的瓊脂平板上進行的。除嗜溫性放線菌外，其他放線菌一般在培養(yǎng)4-20天內在分離平板上緩慢形成菌落。 在放線菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌的繁殖。 選擇性地添加抗生素。 分離瓊脂平板制備好后，一般皆應在37培養(yǎng)箱中存放3天。,放線菌的分離,土樣中放線菌的非選擇性分離：土樣風干，磨碎，無菌海綿壓印土樣后壓印平板后培養(yǎng)。 植物體上放線菌的分離：無菌取植物組織，干燥以減少細菌數(shù)量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。 水中放線菌的分離： 為使所要分離的放線菌的數(shù)量種類增多，一般將水樣離心或濾紙過濾，取離心沉積或濾紙表面沉積進行系列稀釋和涂布。,次代培養(yǎng)及純化,菌落形成后可根據(jù)肉眼可見的菌落形態(tài)上的差異，作初步的鑒定和區(qū)分。 通過高倍放大進行鏡檢，可了解氣生和營養(yǎng)孢子形成情況。 成功地分離出各種不同的放線菌屬及種的關鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識別不同的生長形態(tài)、從而初步地加以鑒定，在分離放線菌時顯得尤為重要。 將分離平板上所形成的菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鉤形針或無菌牙簽挑取，點接到瓊脂平板上進行影印培養(yǎng)，以進一步篩選和分離。,工業(yè)菌種的育種方針,工業(yè)菌種的育種： 是運用遺傳學原理和技術對某個用于特定生物技術目的的菌株進行的多方位的改造。通過改造，可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強化，或去除不良性質或增加新的性狀。,工業(yè)菌種育種的方法,誘變 基因轉移 基因重組,育種過程,包括下列3個步驟： (1)在不影響菌種活力的前提下，有益基因型的引入。 (2)希望基因型的選出。 (3)改良菌種的評價(包括實驗規(guī)模和工業(yè)生產規(guī)模)。,選擇育種方法時綜合考慮的因素,(1)待改良性狀的本質及與發(fā)酵工藝的關系(如批式或連續(xù)發(fā)酵試驗)； (2)對這一特定菌種的遺傳和生物化學萬面認識的明了程度； (3)經(jīng)濟費用。 如果對特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少，則多半采用隨機誘變、篩選及選育等技術： 如果對其遺傳及生物化學方面的性狀已有較深的認識，則可選擇基因重組等手段進行定向育種。,工業(yè)菌種改良方法,(1)解除或繞過代謝途徑中的限速步驟：通過增加特定基因的拷貝數(shù)或增加相應基因的表達能力來提高限速酶的含量；在代謝裔途徑中引伸出新的代謝步驟，由此提供一個旁路代謝途徑。 (2)增加前體物的濃度。 (3)改變代謝途徑，減少無用副產品的生成以及提高菌種對高濃度的有潛在毒性的底物、前體或產品的耐受力。,(4)抑制或消除產品分解酶。 (5)改進菌種外泌產品的能力。 (6)消除代謝產品的反饋抑制。如誘導代謝產品的結構類似物抗性。,提高特定基因的表達水平,(1)引入強轉錄及翻譯信號，可通過在一高效表達載體上克隆靶基因；在靶基因的上游引入強啟動子；修改現(xiàn)有表達信號，提高基因效力等。 (2)誘導解除基因表達抑制的突變。,改進菌種的生長效率,提高菌株對底物的利用率方法： a. 通過確定并改變代謝中的耗能部分; b. 由另一菌株的高效低能代謝途徑代謝來實現(xiàn)。 c. 賦予菌種對多種底物，特別是價廉而豐富的底物的利用能力，由此可降低操作費用。,誘變育種,以微生物的自然變異作為基礎的生產選種的機率并不很高，一個基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。 誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A的育種，是迄今為止國內外提高菌種產量、性能的主要手段。,誘變,物理、化學或生物誘變方法,一、誘變劑和誘變處理,物理誘變劑：射線如紫外線、X射線、射線，快中子； 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產菌株的選育都用過紫外線，對于一般實驗室、中小型工廠都適用，也很安全。 其他的幾種射線都是電離性質的，有一定的穿透力，一般都由專業(yè)人員在專門的設備中使用，否則有一定危險性。,化學誘變劑： 化學因子如堿基類似物、5氟尿嘧啶、烷化劑等。 化學誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。 使用化學誘變劑的優(yōu)缺點： 1、大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。,2、化學誘變劑是很經(jīng)濟的，因為只需要少量的合適的誘變劑，設備是實驗室的一般玻璃器皿，一個蒸氣罩。而用電離輻射行工作時，設備費用大，并要注意安全性。 3、大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹慎，要避免化學誘變劑與皮膚接觸，且切勿吸入其蒸氣，有人對某些誘變劑極其敏感，甚至未直接接觸就會過敏，這就更要當心。,誘變劑的選擇,1堿基類似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使用，回復突變率高，效果不大。 2亞硝酸和烷化劑應用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。,3吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。 4紫外線仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復的缺突變。但它可能影響鄰近基因的性能。,二、誘變育種步驟,出發(fā)菌株的選擇 處理菌懸液的制備 誘變處理 中間培養(yǎng) 分離和篩選,(一)出發(fā)菌株的選擇,1自然界新分離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，容易達到好的效果。 2在生產中經(jīng)生產選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。 3每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。 4出發(fā)菌株開始時可以同時選23株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。,5要盡量選擇單倍體細胞、單核或核少的多細胞體來作出發(fā)誘變細胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產基因。 6根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因為同一誘變劑的重復處理會使細胞產生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營養(yǎng)細胞，就要選對數(shù)期的細胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。,(二)處理菌懸液的制備,這一步驟的關鍵是制備單細胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。,(三)誘變處理,根據(jù)前面有關誘變劑及誘變處理的介紹，結合誘變對象的實際，設計誘變處理方案。,(四)中間培養(yǎng),由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個表現(xiàn)延遲的過程，即細胞內原有酶量的稀釋過程(生理延遲)，需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。這個過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。,方法： 讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，以讓細胞的遺傳物質復制，讓細胞繁殖幾代，以得到純的變異細胞。這樣，隱性的變異就會顯現(xiàn)出來，若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。,(五)分離和篩選,篩選分初篩和復篩。初篩以迅速篩出大量的達到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。 復篩則是精選，以質為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異. 例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產物與某些染料或基質的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復篩者，而將90%的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細比較參加復篩和再復篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復篩階段，還應不斷結合自然分離，純化菌株。,紫外線的誘變育種,紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長為2537A燈與處理物的距離為1530cm，照射時間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在7080%為宜。,被照射的菌懸液細胞數(shù)，細菌為106個ml左右，霉菌孢子和酵母細胞為106107個ml。由于紫外線穿透力不強，要求照射液不要太深，約0.51.0cm厚，同時要用電磁攪拌器或手工進行攪拌，使照射均勻。 由于紫外線照射后有光復活效應，所以照射時和照射后的處理應在紅燈下進行。,(二)操作步驟 1將細菌培養(yǎng)液以3000rmin離心5min，傾去上清液，將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。 2將菌懸液放入一巳滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶內用手搖動，以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內過濾，單細胞濾液裝入試管內，一般處于渾濁態(tài)的細胞液含細胞數(shù)可達108個ml左右，作為待處理菌懸液。,3取24m1制備的菌液加到直徑9cm培養(yǎng)皿內，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處。在正式照射前，應先開紫外線10min，讓紫外燈預熱，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射1050s。操作均應在紅燈下進行，或用黑紙包住，避免白熾光。,4取未照射的制備菌液和照射菌液各o.5ml進行稀釋分離，計數(shù)活菌細胞數(shù)。 5取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中(300ml三角瓶內裝30ml培養(yǎng)液)，120rmin振蕩培養(yǎng)46h。 6取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。 7挑取菌落進行篩選。,亞硝基胍誘變曲霉菌,N甲基N-硝基-N-亞硝基胍(NGN，MNNG或TG)對真核或原核微生物都有強烈的誘變作用。其精確的作用機制尚不很清楚，據(jù)認為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細胞內的DNA復制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。MNNG的誘變作用隨pH的升高而增強。,(二)操作步驟 1單孢子懸液制備 取斜面，加入6ml 0.1molL pH6.o的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過帶濾紙漏斗過濾，由此制得單孢子懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達l06個ml，此為待處理孢子懸液。 2MNNG溶液的制備 用分析天平稱取2mg，加入2ml 0.1molL pH 6.0磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解。,3誘變處理 吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子懸液中，30振蕩30min，立即稀釋1000倍停止作用，然后以10-2，10-4兩個稀釋度分離培養(yǎng)，30 3天后計數(shù)。 4死亡率計算 將未處理的孢子液1ml加入1ml磷酸緩沖液中，同上逐級稀釋分離， 30下培養(yǎng)3天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計算出死亡率。 5挑取菌落進行糖化酶及蛋白酶產量篩選,第五節(jié) 營養(yǎng)缺陷型的選育,營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變而產生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株。 與營養(yǎng)缺陷型對應的是野生型。,能滿足野生型菌株正常生長的培養(yǎng)基稱基本培養(yǎng)基(MM)； 在基本培養(yǎng)基中加入相應的營養(yǎng)成分的稱補充培養(yǎng)基(SM)； 能滿足各種營養(yǎng)缺陷型生長的稱完全培養(yǎng)基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。,營養(yǎng)缺陷型的用途,營養(yǎng)缺陷型在生產上和科學研究上用途很大。目前生產氨基酸、核苷酸的菌種都是各種類型的缺陷型。要研究代謝途徑，育種技術都必須有營養(yǎng)缺陷型的菌株為材料。,篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟,誘變 淘汰野生型 檢出缺陷型 確定生長譜,一、誘變方法,物理誘變 化學誘變,二、淘汰野生型,抗生素法：野生型能在MM中生長，而缺陷型不能，于是將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于休眠狀態(tài)。由于細菌或酵母對一些抗生素敏感，于是就相應加入一定量的抗生素，結果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。 菌絲過濾法：對于霉菌，因孢子生長后會長出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過。,三、檢出缺陷型,原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長情況完全不同，缺陷型在CM上生長良好，而在MM上則不生長，野生型都能生長。 具體方法：影印法、點種法、夾層法,1將一較平皿直徑小1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。 2將完全培養(yǎng)基上長出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標記方位。 3將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標記的同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復印于上。,(一)影印法,4 將CM和MM在恒溫箱中培養(yǎng)。 5二平皿相同方位進行比較， 即可發(fā)現(xiàn)在MM平皿上長出的菌落少于GM平板上的。MM上未長而相應于CM上長出的那幾個菌落就可能是缺陷型。 此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應有一定間隔。,(二)點種法,也就是任意法。 用接種針或牙簽將CM上長出的菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在相應位置點種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長情況。 此法結果明確，但工作量大。,(三)夾層法,先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌的MM，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，將出現(xiàn)的菌落標記，然后倒上一層CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時第二批長出的菌落就可能是缺陷型。 此法缺點是，結果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。,四、營養(yǎng)缺陷型生長譜的確定,驗證確定是缺陷型后，就需確定其缺陷的因子，即生長譜測定。,生長譜測定的方法,將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，制備成細胞懸液，與MM培養(yǎng)基(融化并涼至50)混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的56個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營養(yǎng)物的濾紙圓片。培養(yǎng)后會在某組合區(qū)長出，就可測得所需營養(yǎng)。個平皿測一個菌。,以不同組合的營養(yǎng)混合物與融化涼至50的MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個缺陷型菌株于各相應位置，培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長出可推知其營養(yǎng)因子。在56個平皿上可測20株菌以上。,第六節(jié) 基因育種,基因重組育種：是運用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細菌質?；蚱渌d體，將目的基因轉移至新的宿主細胞并使其在新的宿主細胞系統(tǒng)內進行復制和表達，或者通過細胞間的相互作用，使一個細胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質的交換而轉移給另個細胞的方法。,一個完整的基因克隆過程包括以下步驟,、獲得待克隆的DNA片段（基因）； 、目的基因與載體在體外連接； 、重組DNA分子導入宿主細胞； 、篩選、鑒定陽性重組子； 、重組子的擴增與或表達。,2.2 基因重組,一、質粒的特點,1、質粒的存在并非微生物生命活動必需。 2、每個細胞中存在的質粒數(shù)稱為該質粒的拷貝數(shù)。不同類型的質粒其拷貝數(shù)各異，同一質粒在不同條件下，拷貝數(shù)也可能差異很大，有嚴緊型和松弛型兩種。 3、質粒DNA分子常呈現(xiàn)三種形態(tài)；常見的一種是共價、閉環(huán)狀DNA(CCC DNA)；其次是由于條鏈有缺口而產生的開環(huán)DNA(ocDNA)；第三種是由雙環(huán)分子兩段均斷裂而產生的線性DNA。,質粒載體,二、各類質粒所賦予宿主細胞的不同表現(xiàn)型,抗生素抗性：抗生素的產生；大腸桿菌素的產生；腸毒素的產生；復雜有機化合物的降解；限制性核酸內切酶和修飾酶的產生；殺傷性能。 在自然條件下，許多質粒可經(jīng)細菌接合或相似方式在宿主間相互轉移。在實驗室條件下，質粒也可經(jīng)人工手段將其轉化入宿主細胞內。,三、質粒DNA的提取方法,細菌培養(yǎng)和質粒擴增； 細菌的收獲和裂解； 質粒DNA的提取。,四、遺傳轉化,轉化是指受體細胞直接攝取供體細胞游離的DNA片段，將其同源部分進行堿基配對，組合到自己的基因中，從而獲得供體細胞的某些遺傳性狀。,(二)操作步驟： 質粒DNA轉化感受態(tài)大腸桿菌 1從瓊脂平板上挑取新鮮菌落接入10ml肉湯培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)過夜。 2取0.5ml培養(yǎng)物接入50ml肉湯中，無菌添加0.4ml 2.5molLMgCl2，于37振蕩培養(yǎng)。 3將o.1molL CaCl2溶液、試管及吸管在冰浴中冷卻。,4當培養(yǎng)物OD600在o.5o.8左右時，開始收獲細胞(大約需22.5h) 5將培養(yǎng)物置冰浴中冷卻10min。 6取10ml培養(yǎng)物置2個冷離心管中棄去上清液。,7加入1ml 0.1molL CaCl2，再加0.9ml CaCl2，置冰浴中放置20min。 83000rmin離心10min，棄去上清液 9加入1ml 0.1molL CaCl2，重新懸浮細胞，置冰浴中保存。 10加入120l待轉化質粒 DNA溶液。,11在冰上放置20min，在37處理2min。再插入冰中加入0.9m1肉湯37靜置培養(yǎng)90min。 12以不同的量涂布選擇培養(yǎng)基平板。 13于37培養(yǎng)過夜。鑒定轉化菌落。,常用的遺傳轉化系統(tǒng),1、自然系統(tǒng) 2、人工誘導（完整細胞） （1）二價陽離子系統(tǒng)：Ca2+，Ca2+Mg2+，Mg2+，Ca2+輔助噬菌體，Tris+Ca 2+ （2）單價陽離子系統(tǒng)：PEG+Li+/Cs+/Rb+ （3）凍融系統(tǒng) （4）Triton處理：人工誘導（PEG/原生質體）,重組DNA中常用的工具酶,包括限制性核酸內切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、逆轉錄酶等.,限制性內切酶,切開DNA分子所需的酶：每一種酶都有其各自的作用位點。 常用限制性內切酶 種類及特性,W. Arber,H. O. Smith,限制性內切酶的剪切方式,粘性未端：切開后的兩段DNA各留下一個尾，這2個尾的核苷酸順序完全一樣，中是方向相反。它們之間是互補的，在適當條件下可以再連接一起。,其它工具酶,連接酶 T4 DNA 修補工具酶 DNA聚合酶I 末端加工酶 S1核酸酶 ， 堿性磷酸單脂酶 末端轉移酶 人工加polyA 或polyT 尾 反轉錄酶,載體宿主系統(tǒng),載體(vector)是攜帶外源DNA進入宿主細胞進行擴增和表達的DNA； 一般是通過改造質粒、噬菌體或病毒等構建的。,載體應具備以下條件：,、能在適當?shù)乃拗骷毎袕椭疲?、具有多種限制酶的單一切點（即所謂多克隆位點）以便外源DNA插入； 、具有篩選標志以區(qū)別陽性與陰性重組分子； 、載體分子較小，以便體外基因操作，同時載體DNA與宿主DNA便于分離； 、對于表達型載體還應具有與宿主細胞相適應的啟動子、增強子、加尾信號等基因表達元件。,宿主細胞必須符合以下條件,、對載體的復制和擴增沒有嚴格的限制； 、不存在特異的內切酶體系降解外源DNA； 、在重組DNA增殖過程中，不會對它進行修飾； 、重組缺陷型，不會產生體內重組； 、容易導入重組DNA分子； 、符合重組DNA操作的安全標準。,目的基因的獲取,一、通過建立基因文庫分離靶基因 基因文庫包括兩類：基因組文庫：利用限制性內切酶。 cDNA：用mRNA反轉錄成單鏈DNA，再經(jīng)DNA聚合酶的作用產生雙鏈DNA?？扇コ婧松锘蛑胁槐磉_的內含子。,二、化學合成法制備DNA片段 從蛋白質肽鏈的氨基酸順序可以知道它的遺傳密碼，再依照密碼合成基因。 三、聚合酶鏈反應法擴增基因片段 對于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過聚合酶鏈反應（），以基因組DNA或cDNA模板擴增得到目的基因片段。,PCR技術,根據(jù)需擴增片段的兩端設計引物。 使DNA解鏈（高溫），引物結合于基因的兩端（低溫），在合適溫度下開始合成（鏈延長）反應。 特點：需要很少的DNA模板，且能直接從基因組中得到目的基因。,DNA擴增,PCR反應,DNA片斷的克隆,載體的條件 ：,a 復制起點 b 適宜的限制酶切點 c 選擇標記,DNA分子的體外連接 DNA片段的體外連接是重組DNA技術的關鍵。DNA連接是由DNA連接酶催化完成的。,一、DNA連接酶,DNA連接酶催化兩條雙鏈DNA片段相鄰的5-磷酸和3-羥基間形成磷酸二酯鍵。 在分子克隆中最有用的的DNA連接酶是來自噬菌體的DNA 連接酶。 T4 DNA連接酶在分子克隆中主要用于： 、連接具有同源互補粘性末端的片段； 、連接雙鏈DNA分子間的平端； 、在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。,重組DNA導入宿主菌,體外連接的重組DNA分子必須導入適當?shù)氖荏w細胞中才能大量的復制、增殖和表達。根據(jù)所采用的載體的性質，將重組DNA分子導入受體可有不同的方法。,一、轉 化,指以細菌質粒為載體，將外源基因導入受體細胞的過程。轉化時，細菌必須經(jīng)過適當?shù)奶幚硎怪幱诟惺軕B(tài)即容易接受外源DNA的狀態(tài)，然后利用短暫熱休克使DNA導入細菌宿主中。 此外還可用電穿孔法轉化細菌，它的優(yōu)點是操作簡便、轉化效率高、適用于任何菌株。,二、轉染和感染,利用噬菌體DNA作為載體時可經(jīng)兩種方式導入受體菌。一種是感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。另一種方式是轉染，即在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環(huán)化，再象重組質粒一樣地轉化進受體菌。但習慣上常把以噬菌體DNA為載體構建成的重組子導入細胞的過程統(tǒng)稱為轉染。,重組克隆的篩選與鑒定,基因克隆的最后一步是從轉化細菌菌落中篩選出含有陽性重組子的菌落，并鑒定重組子的正確性。 通過細菌培養(yǎng)以及重組子的擴增，獲得所需的基因片段的大量拷貝。進一步研究該基因的結構、功能，或表達該基因的產物。,一、抗藥性標志的篩選,如果克隆載體帶有某種抗藥性標志基因如ampr或tetrr ，轉化后只有含這種抗藥基因的轉化子細菌才能在含該抗菌素的平板上幸存并形成菌落，這樣就可將轉化菌與非轉化菌區(qū)別開來。如果重組DNA時將外源基因插入標志基因內，該標志基因失活，通過有無抗菌素培養(yǎng)基對比培養(yǎng)，還可區(qū)分單純載體或重組載體（含外源基因）的轉化菌落。,二、半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選,很多載體都攜帶一段細菌的lacZ基因，它編碼半乳糖苷酶N-端的146個氨基酸，稱為肽，它表達半乳糖苷酶的C-端肽鏈。 當載體與宿主細胞同時表達兩個片段時，宿主細胞才有半乳糖苷酶活性，使特異的底物X-gal 變?yōu)樘m色化合物，這就是所謂的互補。 而重組子由于基因插入使肽基因失活，不能形成互補，在含X-gal的平板上，含陽性重組子的細菌為無色菌落或噬菌斑。,三、菌落快速裂解鑒定法 從平板上直接挑選菌落裂解后，直接電泳檢測載體質粒大小，判斷有無插入片段存在，該法適于插入片段較大的重組子初篩。 四、內切酶圖譜鑒定 經(jīng)初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養(yǎng)后，再分離出重組質?；蛑亟M噬菌體DNA，用相應的內切酶切割，釋放出插入片斷；對于可能存在雙向插入的重組子，還要用內切酶消化鑒定插入的方向。,重組DNA的鑒定,遺傳學方法,第七節(jié) 雜交育種,(一)細菌雜交,在細菌中實現(xiàn)雜交的種類尚不多，主要是大腸桿菌，其他還有鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、淋病奈氏球菌等。 大腸桿菌中存著致育因子F，有F因子為F+，沒有F因子稱F-。 F因子存在于細胞中形式：游離狀態(tài)(F+細胞)；整合狀態(tài)，即F因子插入胞核質的一定位置上(Hfr細胞)。 F因子有明顯的感染性，大腸桿菌的接合，實質上是F因子的轉移，所以F+和Hfr稱供體菌，而F-稱受體菌。,（二）酵母雜交育種技術,1、酵母繁殖方式 酵母為單細胞型真菌，一般以出芽方式生殖，在通常情況下，繁殖體為雙倍體，但經(jīng)過特定條件的誘導，可使其產生單倍體孢子并可出芽產生單倍體繁殖體。,單倍體細胞具及2兩種交配型。兩種交配型細胞經(jīng)其細胞壁上特定的凝聚因子誘導而進行交配，恢復為雙倍體；同一交配型細胞之間，則因細胞壁上凝集因子的存在而不能進行交配。 在生活過程中，酵母細胞還可以形成三倍體、四倍體、多倍體或非整倍體細胞。,2、酵母雜交 一般而言，雜交育種運用了酵母的單雙倍生活周期，將不同基因型和相對的交配型的單倍體細胞經(jīng)誘導雜交而形成二倍體細胞，經(jīng)篩選便可獲得新的遺傳性狀。 酵母的雜交方法有孢子雜交法、群體交配法、單倍體細胞雜交法和罕見交配法。就啤酒酵母而言，運用罕見交配法更易獲得結果。,第八節(jié) 原生質體育種,原生質體育種技術主要有原生質體融合、原生質體轉化技術，此外尚有原生質體誘變育種等。 原生質休融合育種是基因重組的一種重要方法。 原生質體融合作為一種新的基因重組手段是1978年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學討論會上提出來的。,一、原生質體融合育種的特點,(一)雜交頻率較高：細胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形的原生質體。 (二)受接合型或致育型的限制較?。憾H株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。 (三)遺傳物質傳遞更為完整：原生質體融合是二親株的細胞質和細胞核進行類似的合二為一的過程。,(四)存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能性。 （五有可能采用產量性狀較高的菌株作融合親株。 (六)提高菌株產量的潛力較大。 (七)有助于建立工業(yè)微生物轉化體系。,二、原生質體融合育種步驟,1標記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗證。 2原生質體制備。 3等量原生質體加聚乙二醇促進融合。 4涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。 5選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗證，挑取融合子進一步試驗、保藏。 6生產性能篩選。,三、原生質體融合育種的要點,（一）標記菌種的選擇 獲得標記菌種的方法是采用常規(guī)誘變育種，篩選出營養(yǎng)缺陷型或和抗藥性菌株。這里最重要的是標記必須穩(wěn)定。 采用抗藥性菌株除可作標記外，在實驗室中還可排除雜菌污染的干擾。為的是確證融合的成功，可以采用多標記菌種。,(二)原生質體的制備,原生質體的制備主要是在高滲壓溶液中加入細胞壁分解酶，將細胞壁分離剝離，結果剩下由原生質膜包住的類似球狀的細胞，它保持原細胞的一切活性。 在放線菌和細菌中，制備原生質體主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蝸牛酶或纖維素酶等。,影響原生質體制備的因素,1菌體的前處理 為了使酶作用的效果好一些，可將菌作一些前處理。如細菌加入亞抑制劑量的青霉素。 2菌體的培養(yǎng)時間 為了使細胞易于原生質體化，一般選擇增殖期的菌體。 3 酶濃度 對于不同種屬的微生物，不僅對酶的種類要求不同，就是對酶的濃度也有差異。另外，最佳酶濃度還隨不同的生長期的菌體而變化。,4酶處理溫度 5破壁時的pH值 6滲透壓穩(wěn)定劑 等滲透壓在原生質體制備中，不僅起到保護原生質體免于膨裂，而且還有助于酶和底物的結合，滲透壓穩(wěn)定劑多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有機物和KCl和NaCl等無機物。,第九節(jié) 篩選新的代謝產物,一、開發(fā)新的代謝產物的途徑,(1)從自然界分離新的微生物菌株，或采用新的檢閱方法篩選新的代謝產物。 (2)對已知微生物的代謝產物進行化學修飾。 (3)利用微生物轉化改造代謝產物的結構。 (4)通過原生質體融合獲得新的代謝產物。 (5)DNA重組技術。,二、篩選微生物新的代謝產物 的程序,突變型菌株的篩選,一、產量性狀突變株的篩選,三、篩選微生物代謝產物的目標,篩選克服抗生素抗性菌株的活性物質； 篩選抗腫瘤、抗病毒的活性物質； 研究有藥理活性的酶抑制劑及免疫調節(jié)劑； 尋找食品工業(yè)最好的酵母培養(yǎng)物； 篩選降解有害物質的微生物以及治療上具有低毒、長效的化學藥物等。,四、篩選微生物代謝產物的方法,(一)直接方法 為了盡快確定微生物代謝產物的利用前途，在體外試驗測得活性后，可以將培養(yǎng)液的有效成分直接作用于機體，觀察被測樣品的療效。 這種直接確定代謝產物用途的方法亦稱動物體內治療試驗。,(二)間接方法 篩選醫(yī)用抗生素，可用細茵、真菌、病毒或腫瘤模型，尋找抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤抗生素、酶抑制劑、免疫制劑等有效物質。 在預篩選時，多用瓊脂平扳擴散抑菌法。通過預篩選，直接測定最初分離物的生物活性，能加速篩選過程。,五、檢測系統(tǒng),篩選過程的成功依賴于排除那些已知的或并非需要的代謝產物的檢驗方法，這樣才能識別出人們需要的化合物。,性能簽別,性能鑒別是分離和篩選微生物代謝產物中最基礎的工作。 鑒別可分為兩方面： 一是對微生物方面進行形態(tài)、培養(yǎng)、生化功能答試驗觀察，并確定微生物產生菌的類群；,二是從化學的早期鑒別來鑒別微生物的代謝產物?；瘜W的早期鑒別一般對產生菌所產生的代謝產物進行紙上層析、薄板層析、紙上電泳、抗茵譜、高壓電泳、紫外分光光度法、液相和氣相色譜等試驗，井獲得各種圖譜，與已知圖譜進行比較鑒別。,如果認為是有實用前途的代謝產物，則要進一步大量培養(yǎng)，并進行動物試驗、毒性考查、藥物代謝等實驗，并進行提高發(fā)酵水平和改善提取工藝的工作，以備投入生產。 如果是新的代謝產物一般要進一步確定其化學結構，井在此基礎上進行合成法的研究或進行化學改造，研究結構與生物活性的相互關系，并對作用機制、生物合成過程作進一步的研究。,菌種篩選方法,誘變處理后，突變細胞只占存活細胞的百分之幾，而能使生產狀況提高的細胞又只是突變細胞中的少數(shù)。 為了花費最少的工作量，在最短的時間內取得最大的篩選成效，就要求采用效率較高的科學篩選方案和手段。,菌種篩選方案,初篩：目的是刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良菌種不致于漏網(wǎng)。初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次。初篩的手段應盡可能快速、簡單。 復篩的目的是確認符合生產要求的菌株，所以，復篩步驟以質為主，應精確測定每個菌株的生產指標。,菌種篩選的手段,初篩 從菌體形態(tài)變異分析 平皿快速檢測法 具體的有紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長圈法和抑制圈法等 搖瓶培養(yǎng)法搖瓶培養(yǎng)法也可用于初篩。 初篩的搖瓶培養(yǎng)一般是一個菌株只做一次發(fā)酵測定，從大量菌株中選出10-20%較好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而復篩中搖瓶培養(yǎng)一般是一個菌株培養(yǎng)3瓶，選出3-5個較好的菌株，再做進一步比較，選出最佳的菌株。,特殊變異菌的篩選方法,營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 經(jīng)誘變處理后的菌懸液在篩選前一般應先進行誘變后培養(yǎng)，以促使變異細胞發(fā)生分離，防止出現(xiàn)表型延遲現(xiàn)象，篩選出不純的菌株。營養(yǎng)缺陷型的篩選一般包括濃縮、進一步檢出和鑒別營養(yǎng)缺陷型等步驟。,抗性突變菌株的篩選 抗性突變株的篩選相對比較容易，只要有10-6頻率的突變體存在，就容易篩選出來。抗性突變株的篩選常用的有一次性篩選法和階梯性篩選法兩種手段。,一次性篩選法 噬菌體抗性菌株、耐高溫菌株 階梯性篩選法藥物抗性突變株。,組成酶變異株的篩選 許多水解酶是誘導酶，只有在含有底物或底物類似物的培養(yǎng)環(huán)境中，微生物才會合成這些酶類，所以，誘導酶的生產不僅需要誘導物，而且受到誘導物的種類、數(shù)量以及分解產物的影響。 具體的篩選方法有恒化器法、循環(huán)培養(yǎng)法和誘導抑制物法。,1) 恒化器法：常被用于微生物的“馴化”。在培養(yǎng)基中添加不能起誘導作用的低濃度底物，菌生長速率極慢，而群體中少數(shù)組成型變異株則可合成有關的酶，分解利用該底物，生長速率較快。 為了提高組成酶變異株的優(yōu)勢，即它在群體中的比例，可以應用恒化器培養(yǎng)技術。隨著恒化器培養(yǎng)中不斷加入新鮮基質而逐漸增大組成酶變異株的優(yōu)勢，這樣就能夠比較容易地做進一步的純化分離。,2) 循環(huán)培養(yǎng)法：利用不含誘導物的培養(yǎng)環(huán)境和含有誘導物的培養(yǎng)環(huán)境進行交替循環(huán)培養(yǎng)待分離的菌懸液，從而使組成酶變異株得到富集。 當接種到不含誘導物而含有其它可利用碳源的培養(yǎng)基中時，兩種類型菌株同樣能較好地生長，但在此環(huán)境中組成型突變株已能合成有關的水解酶，而誘導型菌株就不能合成。,將它們轉接入含誘導物的培養(yǎng)基中時，變異株能迅速利用誘導底物進行生長繁殖，而誘導型出發(fā)菌株需經(jīng)歷一個誘導合成酶的階段，兩類菌株的生長就不同步，組成酶變異株所占的比例將逐漸增大。,3) 誘導抑制劑法：有些化合物能阻止某些誘導酶的合成，當在誘導物和誘導抑制劑同時存在的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)待分離菌群時，誘導型菌株不能產生誘導酶，無法正常生長，只有組成型變異株能夠利用底物進行生長繁殖。,第十節(jié) 工業(yè)微生物菌種保藏技術,在生產發(fā)酵中，具有高產有重要經(jīng)濟價值的某一期待代謝產物主能力的微生物菌種的保存和長期保藏，對于一成功的工業(yè)發(fā)酵過程極為重要。,一、理想的菌種保藏方法應具備的條件,(1) 經(jīng)長期保藏后菌種存活健在； (2) 保證高產突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級代謝產物和次級代謝產物生產的高產能力。 (3)菌種保藏的基本措施是低溫、干燥、真空。,二、工業(yè)微生物菌種保藏技術,(1)冷凍干燥或真空干燥保藏； (2)超低溫或在液氮中冷凍保藏； (3) 轉接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?(4)土壤或陶瓷珠等載體于燥保藏。,2.1 冷凍保藏,冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡單而有效的方法。 通過冷凍，使微生物代謝活動停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了獲得滿意的冷凍結果，通常應在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護劑。冷凍保藏時溫度要求在-20以下，同時應認真掌握好冷凍速度和解凍速變。 冷凍深藏的缺點之一是培養(yǎng)物運輸較困難。,冷凍保藏種類,一、普通冷凍保藏技術(-20) 二、超低溫冷凍保藏技術(-60一-80) 三、液氮冷凍保藏技術,普通冷凍保藏技術(-20),將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細胞分接到試管或指管肉，然后貯藏于一冰箱的冷藏室中，或于溫度范圍在-5-20的普通冰箱(-20)中。或者，將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴格封好，同上置于冰箱中保存。 用此方法可以維持若干微生物的活力12年。,應注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。 保藏過程中應注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應嚴格密封。 這一方法雖簡便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。,二、超低溫冷凍保藏技術(-60一-80),要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在-60以下進行保藏。 在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是： 1離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細胞； 2用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細胞； 3加入等體積的20甘油或10二甲亞砜； 4混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70超低溫冰箱中保藏。,如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含10甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-2min。若干細菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。,三、液氮冷凍保藏技術,(一)冷凍保護劑 在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10、二甲亞砜5。所使用的甘油般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。,(二)液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟 1待冷凍保藏菌種懸液的制備 (1)從生長斜面制備菌懸液：每一斜面加入5ml含10甘油的營養(yǎng)液體培養(yǎng)；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細胞懸液；0.5lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，,(2)從浸沒培養(yǎng)物制備菌懸液： 在浸沒培養(yǎng)液中加入等體積20%無菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散；0.5-lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置于5冰箱中3min，以使細胞和懸浮培養(yǎng)基之間達到平衡。,2控速冷凍 (1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中； (2)將此金屬容器置于控速冷凍機的冷凍室中； (3)以1-2/min的致冷速度降溫，直到溫度達到相對溫度之上幾度的細胞凍結點(通常為-30)； (4)補加一定量的液氮至系統(tǒng)中，使細