趙百孝灸法的創(chuàng)新應用與臨床應用研究.ppt

北京中醫(yī)藥大學,艾蒿與艾灸生成物的成分及其效應機制和安全性評價研究,灸法作用的基本原理與應用規(guī)律研究,趙百孝,計劃任務完成情況,艾燃燒生成物的安全性評價,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質基礎研究,課題組自從2007年起收集蘄艾，并于2009年起委托湖北蘄春縣李時珍工作辦公室負責在蘄艾生產和質量體系建設試驗示范基地，每年在端午前后2個月內，由專人定期采集蘄艾艾葉。同時，在2010端午當天年采集了全國20個不同產地的艾葉。經北京市藥品檢驗所藥用植物專家鑒定，辨別出湖北蘄春等16個產地的為正品艾葉（Artemisia argyi Levl.et Vant.），其它4個為偽品艾葉。 艾絨及艾條的收集與制備：用于艾絨揮發(fā)油成分及煙氣分析的艾絨由課題組自行制備，用于毒理學及臨床研究艾絨和艾條，委托河南南陽漢醫(yī)艾絨廠按要求制備。此外，還收集了市場上銷售的品質不同的艾絨和艾條產品，用于對照研究。,艾葉及艾絨標本的采集制備,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質基礎研究,艾葉與艾絨的植物性狀,艾葉為菊科植物艾Artemisia argyi Levl.et Vant.的干燥葉（中國藥典2010年版），也是艾絨的主要來源。完整葉片展平后呈卵狀橢圓形，羽狀深裂，裂片橢圓狀披針形，邊緣有不規(guī)則的粗鋸齒；上表面灰綠色或深黃綠色，有稀疏的柔毛和腺點；下表面密生灰白色絨毛。符合中國植物志對艾的描述。,艾葉與艾絨的植物性狀,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質基礎研究,顯微鏡下可見正品艾葉的顯微結構：主葉脈橫切面的維管束上方均有厚壁細胞，艾葉主葉脈橫切面呈“D”型，且維管束個數(shù)較少。,艾葉與艾絨的植物性狀,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質基礎研究,光鏡下觀察可見，艾絨是由非腺毛、腺毛、殘損的維管束、細小的葉肉粉末、氣孔等構成。其中主體部分是非腺毛（T型非腺毛居多）。,艾絨顯微結構,不同比例艾絨光鏡圖,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質基礎研究,通過GC-MS法分析2007-2009年份的蘄艾典型樣品中24種揮發(fā)油成分，從中鑒定了9個化合物：桉葉油醇、側柏酮、菊槐酮、樟腦、龍腦、4-萜烯醇、石竹烯、石竹素、刺柏腦 。,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質基礎研究,艾葉揮發(fā)油指紋圖譜研究,將各產地的艾葉揮發(fā)油色譜圖輸入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004版）共11個樣品生成共有指紋圖譜，正品相似度在81%-97%之間。,非正品艾葉揮發(fā)油與正品艾葉揮發(fā)油生成對照圖譜比較,艾葉揮發(fā)油指紋圖譜匹配圖,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質基礎研究,研究發(fā)現(xiàn)年份越久，易揮發(fā)的成分(分子量小)相對含量越少，如桉葉油醇、側柏酮等；難揮發(fā)的成分（分子量大）相對含量較高，如刺柏腦、石竹烯、石竹素等。,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質基礎研究,不同年份、不同比例艾絨揮發(fā)油含量變化趨勢顯示，艾葉制成3:1艾絨后多種揮發(fā)性成分含量明顯降低，此后各比例艾絨揮發(fā)油含量趨于穩(wěn)定。提示3：1為艾絨加工的基礎比例，結合臨床研究*表明3年陳艾優(yōu)于1年艾。,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質基礎研究,艾煙成分的分析,建立了固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用技術測定艾煙的方法，分離出61個峰，鑒定出26種成分。檢出物質分三部分，0-10min為有呋喃結構的物質，10-40min基本為芳香族化合物，40-70min為酯類、烷烴或含羥基類化合物。其中芳香族化合物多為小分子芳香烴類，未檢出苯并吡等毒性物質。,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質基礎研究,艾絨與其他可燃材料的煙氣成分比較,艾煙與其他材料-如香煙、棉花等燃燒煙氣成分有顯著差異，其中含有大量小分子芳香烴類物質。,艾煙,香煙,棉花,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質基礎研究,不同處理方式煙氣成分分析,定量濾紙樣品和滴有甲醇提取液的定量濾紙樣品所含成分種類較少；滴有艾葉揮發(fā)油的定量濾紙樣品色譜峰顯示的都是艾葉的揮發(fā)性成分，推測是點燃的瞬間揮發(fā)油受熱揮發(fā)到空氣中；用甲醇提取揮干后的艾絨樣品成分種類與艾絨燃燒后的煙氣成分相同，只是含量有所減少提示甲醇提取物對艾煙的生成有貢獻，但不是主要影響因素。,艾絨煙氣總離子流圖,滴有艾葉揮發(fā)油的定量濾紙樣品煙氣 總離子流圖,用甲醇提取揮干后的艾絨樣品煙氣 總離子流圖,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質基礎研究,艾絨燃燒過程煙氣成分分析,結果表明加熱溫度到達60后，揮發(fā)性成分增多，于150后達到頂點，進入燃點后，揮發(fā)性成分濃度快速減少至低值，其他成分成為煙氣主要組成。,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質基礎研究,實驗室特定條件下，樣品燃燒產生的苯甲醛、苯酚、鄰位甲酚、萘的濃度在0.56-2.07、4.37-16.69、1.31-4.16、1.03-6.27mg/m之間； 臨床診室艾煙中四種成分的實測濃度為其1/9； 苯甲醛是一種天然的植物揮發(fā)油，常用于香精、香料等，無毒無害；而風險物質苯酚、鄰位甲酚、萘的濃度大大低于國家限量標準。（10mg/m，10 mg/m，50 mg/m PC-TWA工作場所有害因素危害特性實用手冊）,艾煙中主要成分的含量測定,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質基礎研究,艾燃燒灰燼色譜分析,灰燼中殘留有機物質量極少； 所含物質為含共軛體系的烯烴或芳香族化合物。,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質基礎研究,艾煙指紋圖譜研究,研究建立了艾煙指紋圖譜。將各艾煙樣品色譜圖輸入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004版），生成共有指紋圖譜，相似度在88.7-99.7%之間，可以用于控制艾煙質量。,艾煙指紋圖譜匹配圖,艾煙生成對照圖譜,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質基礎研究,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質基礎研究,1 利用指紋和特征圖譜，通過matlab的主成分分析法，將不同精細度的艾絨分別聚類，結果與直觀分析結果基本一致； 2 南陽陳艾條艾絨、黃金艾絨等離散樣品，煙氣分析存在差異，提示其質量存疑。,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質基礎研究,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質基礎研究,建立了艾葉揮發(fā)性成分指紋圖譜，可準確區(qū)分正品與偽品，形成了艾葉質量標準草案，填補了當前艾葉質量標準空白。 艾絨中揮發(fā)性成分隨著儲存時間延長和加工比例提高，含量明顯減少，組成比例發(fā)生改變，提示傳統(tǒng)艾絨加工方式主要是減少揮發(fā)油含量，調整組成。表明3:1是艾絨加工的基礎比例。 艾煙分析結果表明，其穩(wěn)定組成包括大量的小分子芳香類化合物、少量的揮發(fā)油類物質。該組成與其他煙氣相比具有特征性。 首次建立了艾煙的指紋圖譜和數(shù)字特征圖譜，可用于控制和評價煙氣質量，形成穩(wěn)定的煙氣化學模型，為課題研究提供質控方法。,小 結,計劃任務完成情況,艾燃燒生成物的安全性評價,第二部分：艾燃燒生成物的安全性評價,第二部分：艾燃燒生成物的安全性評價,艾煙2729mg/m3組未發(fā)現(xiàn)毒性反應；中、高劑量組均出現(xiàn)體重降低、肺功能cdyn下降；高劑量組引起WBC和PLT等降低、Tbill升高及肺臟病理改變。實驗結果表明：低劑量組（2729mg/m3）為無毒性反應劑量；中劑量（160180mg/m3）、高劑量組（380400mg/m3）出現(xiàn)毒性反應，主要表現(xiàn)為可逆性的血液細胞減少反應和呼吸系統(tǒng)慢性炎癥反應伴肺功能降低。 本實驗中的低、中、高三種濃度，分別相當于臨床診室艾煙濃度的10倍，60倍，130倍。,長期毒性實驗,第二部分：艾燃燒生成物的安全性評價,第二部分：艾燃燒生成物的安全性評價,細胞毒性實驗：CHO細胞的半數(shù)抑制濃度IC50為0.087 mg/ml。 染色體畸變實驗：樣品濃度為0.01mg/ml時致CHO細胞染色體畸變增加; 微核細胞實驗：樣品濃度為0.01mg/ml時致CHO細胞染色體斷裂增加; 鼠傷寒沙門氏菌回復突變(Ames)：陽性。,特殊毒理實驗,第二部分：艾燃燒生成物的安全性評價,低劑量（2.53.5mg/m3 ）艾煙對小鼠精神神經系統(tǒng)無明顯影響，但中（8.010.0mg/m3 ）、高劑量(27.029.0mg/m3 )對小鼠有一定的鎮(zhèn)靜催眠作用。,第二部分：艾燃燒生成物的安全性評價,艾煙未引起豚鼠全身過敏反應。,艾煙未引起家兔的眼刺激性反應，對眼無刺激性。,艾煙樣品未引起豚鼠皮膚過敏反應,艾煙的過敏和刺激性實驗研究,呼吸道刺激性實驗,艾煙未引起家兔的呼吸道刺激性反應，對呼吸道無刺激性。,第二部分：艾燃燒生成物的安全性評價,長期毒性（6個月，20min/天）實驗表明，臨床艾煙濃度60倍時方出現(xiàn)毒性反應。 長期毒理實驗（3個月，200min/天）表明艾煙濃度在艾灸診室的平均濃度、3倍濃度、9倍濃度時未見毒性反應。,小 結,特殊毒理實驗的體外實驗結果陽性應結合長期的生殖毒性試驗和哺乳動物長期致癌試驗進一步研究。 根據(jù)大鼠與人的劑量換算關系得出人體的無毒性反應濃度為27mg/m3。實測診室平均濃度為2.53.5mg/m3，說明艾灸診室煙氣濃度在安全范圍內。,計劃任務完成情況,艾燃燒生成物的安全性評價,第三部分：艾燃燒生成物的效應機制研究,第三部分：艾燃燒生成物的效應機制研究,艾灸與香煙灸（神闕穴）對高脂血癥模型大鼠影響的比較研究,香煙灸,大鼠毛色深黃色，體型偏小，體重明顯減輕。,升高血脂TC、LDL-C含量，升高全血和血漿粘度,香煙組肝細胞體積增大，中度脂肪變性，大量肝細胞空泡化，肝細胞腫脹明顯,炎癥細胞浸潤,(艾煙濃度為臨床診室濃度10倍),(香煙濃度與艾煙濃度相同),第三部分：艾燃燒生成物的效應機制研究,艾煙樣品可以提高大鼠肺泡巨噬細胞NR8383的吞噬功能。 NR8383細胞的ROS隨著艾煙冷凝物濃度的升高而呈現(xiàn)出降低的趨勢。 隨著艾煙樣品染毒濃度的增加和時間的增長，NR8383 細胞的增殖出現(xiàn)先增強后抑制的現(xiàn)象。,艾煙樣品對大鼠肺泡巨噬細胞NR8383 的活性研究,第三部分：艾燃燒生成物的效應機制研究,艾煙對健康人群心率變異性的影響,臨床觀察發(fā)現(xiàn)試驗組與對照組受試者在受試期間皆出現(xiàn)心率變異性各項指標升高現(xiàn)象。 試驗組各項指標改變率顯著高于對照組 提示：艾煙具有提高心率變異性，調整自主神經功能的作用。,第三部分：艾燃燒生成物的效應機制研究,艾煙對高脂血癥大鼠的脂質代謝有一定的良性調節(jié)作用。 艾煙樣品對巨噬細胞NR8383的吞噬功能隨著艾煙樣品濃度的升高而呈現(xiàn)出增強的趨勢，而NR8383細胞的ROS隨著艾煙樣品濃度的升高而呈現(xiàn)出降低的趨勢。 艾煙可以健康人群心率變異性，對植物神經功能具有一定的調節(jié)作用。,小 結,研究水平與創(chuàng)新性,首次研究并形成了艾煙的指紋圖譜和數(shù)字特征圖譜，建立了艾燃燒生成物的化學評價與控制模型。,通過系統(tǒng)研究證明艾燃燒生成物是艾灸作用機制之一。從而證實了課題提出的“艾燃燒生成物是艾灸效應中的一個關鍵環(huán)節(jié)”的研究假說。,闡明艾絨的制備和儲藏目的在于減少艾葉中揮發(fā)性成分，改變組成比例。揭示了艾絨傳統(tǒng)加工、儲存方式的科學內涵。,首次明確了艾燃燒生成物主要是煙氣，主要來自特定植物組織的燃燒，揮發(fā)性成分的貢獻較少。含有大量小分子芳香族化合物是艾煙特征。,首次開展系統(tǒng)的艾煙毒理學研究，證明了在臨床艾灸環(huán)境的安全性。解除了長期以來民眾對艾煙安全性的擔憂。,1,2,3,4,5,操作繁瑣，費時費力,溫度不穩(wěn)定，容易造成燙傷,艾灸煙霧的安全性問題,現(xiàn)代針灸發(fā)展中面臨很大危機（理療、艾灸本身的缺陷）,器械研發(fā)不足，技術落后,艾灸療法的創(chuàng)新,各種艾灸用具,日本 韓國,各種艾