12C6+離子輻射對細胞存活增殖及模擬失重和輻射對家蠶卵發(fā)育的影響.docVIP

12C6+離子輻射對細胞存活增殖及模擬失重和輻射對家蠶卵發(fā)育的影響作者：續(xù)惠云羅明志孟芮張維高翔李文建商澎【摘要】目的：觀察重離子輻射后人骨肉瘤細胞MG63、人胚胎皮膚成纖維細胞ESF1和人胚胎肝正常細胞HEL1的生存和增殖情況，及重離子輻射和模擬失重環(huán)境處理后家蠶卵的孵化和發(fā)育情況，初步探討重離子輻射對細胞及復合環(huán)境對家蠶卵的一些生物學效應.方法：利用超導磁體模擬失重環(huán)境，利用重離子加速器產(chǎn)生12C6+離子，用不同劑量輻射細胞和家蠶卵，檢測在重離子輻射后細胞的存活和克隆形成能力及復合條件下家蠶卵的發(fā)育情況.結(jié)果：HEL1細胞在0.1Gy時存活率已經(jīng)開始降低，且隨輻射劑量的增大這種影響也增加，到1.5Gy時存活率降低50%.ESF1細胞在1.5Gy時存活率下降約20%，但輻射對骨肉瘤MG63細胞的存活率影響不大.HEL1和ESF1細胞受到0.1Gy的輻射后克隆形成能力就明顯降低90.2%和79.1%，而MG63細胞一直保持較高的克隆形成率，直到1.5Gy時迅速降低75%.家蠶的出蟻率隨輻射劑量的增大而降低，到30Gy時出蟻率降到2.22%.當輻射劑量為010Gy時，家蠶卵在兩種不同重力條件下的孵化率沒有明顯差異.但當輻射劑量增加到15,20和30Gy時，失重環(huán)境明顯促進了家蠶卵的孵化.另外，失重環(huán)境下家蠶卵的孵化時間比正常條件下縮短約3d左右.同時，高劑量的輻射處理會延遲家蠶幼蟲的生長.結(jié)論：重離子輻射降低了細胞的存活和增殖能力，同時影響了家蠶從受精卵到幼蟲的發(fā)育，降低了出蟻率.失重環(huán)境可以縮短家蠶卵的孵化時間.【關鍵詞】重離子輻射；失重；輻射效應；細胞增殖；家蠶卵；發(fā)育0引言輻射和微重力在深空環(huán)境同時存在，且都是對航天員生命安全威脅很大的環(huán)境因素1，研究兩者的復合生物學效應，可以為深空探測中航天員的健康保障提供理論支持.對此，國外已經(jīng)進行了地基水平和真實空間的一些研究，如2002年開始在國際空間站啟動的ALTEA/ALTEINO計劃，研究了復合效應對航天員中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響，并做了地基的對照實驗1-2.我國科學家對復合效應的研究還剛剛起步，進行了一些地基實驗，主要集中在對這兩種危害的防護方面3-4.本研究利用中國科學院蘭州近代物理研究所的重離子加速器（HIRFL）作為地面模擬深空輻射的平臺，利用大梯度強磁場超導磁體作為模擬失重環(huán)境的地基平臺，初步探討重離子輻射對細胞及復合環(huán)境對家蠶卵的一些生物學效應.1材料和方法1.1材料大梯度強磁場超導磁體由西北工業(yè)大學自行設計、日本制造.人胚胎皮膚成纖維細胞ESF1和人胚胎肝正常細胞HEL1購自中國醫(yī)學科學院細胞庫，人骨肉瘤細胞MG63購自中國科學院上海細胞庫.家蠶品種為大造P50，蠶卵購自江蘇省鎮(zhèn)江蠶業(yè)研究所.飼養(yǎng)用家蠶人工養(yǎng)殖飼料購自山東蠶業(yè)研究所.1.2方法1.2.1細胞培養(yǎng)ESF1細胞和HEL1細胞培養(yǎng)在含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，MG63細胞培養(yǎng)在含100mL/L胎牛血清的MEM培養(yǎng)液中.輻射前1d將細胞接種在直徑35mm的培養(yǎng)皿中，置于37,50mL/LCO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后進行輻射.1.2.2家蠶飼養(yǎng)蠶卵在溫度25，相對濕度70%下孵化，孵化后，均在常規(guī)條件下飼養(yǎng).1.2.3重離子輻射重離子種類為12C6+，LET為49.3keV/m，劑量率為200mGy/m，能量為45MeV/A.根據(jù)以前的一些實驗結(jié)果，細胞的輻射劑量定為0，0.1，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，3Gy.家蠶卵隨機分為兩組，一組用0，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，5，10，15，20，30Gy的劑量進行幅照后常規(guī)孵化，另一組在這些劑量輻射后放入超導磁體進行孵化.1.2.4細胞存活實驗輻射后細胞放置4h，用40g/L臺盼藍染色，分別對死活細胞進行計數(shù)，檢測重離子輻射對三種細胞存活率的急性影響.1.2.5細胞克隆形成實驗輻射后將細胞稀釋成單細胞懸液，按不同的預置數(shù)接種在60培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)10d，固定染色后統(tǒng)計多于50個細胞的集落數(shù).細胞克隆生成率=(集落數(shù)/接種細胞數(shù))100%.1.2.6家蠶卵孵化發(fā)育實驗輻射后在25培養(yǎng)箱中孵化家蠶，計算其孵化率.并將孵化出的蠶進行飼養(yǎng)，觀察其生長過程和結(jié)繭時間，計算孵化率.從孵化第12日開始稱量家蠶幼蟲體質(zhì)量.每2d稱量1次，每組隨機稱量30頭，繪制生長曲線.待蠶結(jié)繭后，稱量繭質(zhì)量（每組隨機稱量30個蠶繭）.統(tǒng)計學處理：所有實驗數(shù)據(jù)都利用Prism3.0軟件采用t檢驗方法進行統(tǒng)計分析.2結(jié)果2.1重離子輻射對細胞存活率的影響HEL1細胞受到輻射的影響最大，在0.1Gy時存活率已經(jīng)開始降低，且隨輻射劑量的增大這種影響也增大，到1.5Gy時存活率降低50%，差異有統(tǒng)計學意義（P0.01）.ESF1細胞在1.5Gy時存活率下降約20%，但差異無統(tǒng)計學意義，而MG63細胞的存活率在輻射后4h時受到的影響很?。▓D1），差異無統(tǒng)計學意義.圖1重離子輻射對細胞存活率的影響2.2重離子輻射對細胞克隆形成能力的影響與0Gy時相比，HEL1細胞和ESF1細胞在0.1Gy的輻射劑量時克隆形成的能力降低90.2%和79.1%，并隨輻射劑量變化有一些波動，但其下降都在50%以上.而MG63細胞一直保持比正常細胞更高的克隆形成能力，直到0.5Gy才開始降低，并在1.5Gy時迅速降低到未輻射細胞的25%（圖2）.圖2重離子輻射對細胞克隆形成能力的影響2.3重離子輻射對家蠶卵孵化和發(fā)育的影響輻射后家蠶的出蟻率都隨著照射劑量的增大而降低，至30Gy輻射劑量時，出蟻率降到2.22%（圖3）.當輻射劑量為010Gy時，家蠶卵在兩種不同重力條件下的孵化率差異無統(tǒng)計學意義.但當輻射劑量增加到15,20，30Gy時，失重環(huán)境與正常條件相比，明顯促進了家蠶卵的孵化（P<；0.05）.另外，比較兩種不同重力條件對家蠶孵化的影響發(fā)現(xiàn)，相同輻射劑量的時候，在磁體中發(fā)育的家蠶比磁體外發(fā)育的出蟻時間提前了3d.bP<；0.01vs模擬失重組.圖3重離子輻射對家蠶卵孵化率的影響家蠶發(fā)育實驗的結(jié)果顯示，在失重和常重力兩種條件下，重離子輻射對家蠶生長有影響，但差異無統(tǒng)計學意義（圖4）.兩種重力水平下均表現(xiàn)出隨輻射劑量的增加，家蠶生長的減慢.低劑量的重離子輻射對家蠶幼蟲的生長影響不明顯，但隨輻射劑量增加到10Gy，輻射組家蠶與對照組相比生長減慢，且隨著照射劑量的增加，影響程度加大（圖5，失重條件下數(shù)據(jù)未顯示）.蠶繭稱量的結(jié)果顯示，不同的輻射和重力水平對繭重的影響不明顯.但重離子輻射能造成家蠶結(jié)繭時間的延遲，當劑量增加到20Gy時，家蠶結(jié)繭時間平均延遲約34d.圖4不同重力條件對家蠶幼蟲生長的影響3討論載人深空探測是各航天大國今后進一步進行空間資源開發(fā)的方向.在深空環(huán)境，輻射是在失重下的輻射，失重又伴隨著輻射，研究兩者的復合生物學效應，對航天員健康保障具有重要的指導意義.圖5常重力條件下重離子輻射對家蠶生長的影響本實驗采用加速器產(chǎn)生的重離子模擬深空輻射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種細胞對輻射的反應不同，HEL1細胞和ESF1細胞的存活率和克隆形成能力都隨輻射劑量的增大而降低，而骨肉瘤細胞MG63在輻射后4h的存活率變化不大，表現(xiàn)出了比正常細胞更強的抗輻射能力，但在輻射劑量增大到1.5Gy后，其克隆形成能力迅速降低.因此，重離子輻射能影響細胞的生存和增殖能力，但這種影響與輻射劑量和細胞種類都有關系.家蠶因為個體小、生長周期短、易于飼養(yǎng)，因此成為空間實驗好的動物模型.本實驗采用重離子輻射和失重環(huán)境處理家蠶卵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重離子輻射抑制了家蠶卵的孵化過程，并表現(xiàn)出較好的劑量效應關系.同時觀察發(fā)現(xiàn)，部分沒有孵化的蠶卵已經(jīng)轉(zhuǎn)青，提示輻射并不能完全抑制蠶卵發(fā)育的起始，而是將發(fā)育的進程終止在特定時期.家蠶卵在失重條件下孵化時間提前了3d，提示失重和輻射的復合條件會影響家蠶的早期胚胎發(fā)育過程.該結(jié)果與Shi等5的空間研究結(jié)果有較好的相似性，他們發(fā)現(xiàn)空間飛行搭載能使家蠶滯育卵的孵化時間縮短3d.另外，我們的結(jié)果還顯示高劑量的重離子輻射處理家蠶卵會影響家蠶幼蟲后續(xù)的生長，主要表現(xiàn)為延遲生長效應，該結(jié)果與一些已有的空間研究結(jié)果相一致.Kotani等6發(fā)現(xiàn)失重主要影響早期胚胎發(fā)育，而宇宙射線則主要影響了生長，且失重和宇宙輻射有協(xié)同作用.Reitz等7在“MissionD1”和“COSMOS1987”研究了昆蟲胚胎的發(fā)育情況，結(jié)果顯示失重降低了孵化率，輻射造成了結(jié)構(gòu)異常，而復合效應造成了極高頻率的結(jié)構(gòu)異常.本實驗中也觀察到失重和重離子輻射對家蠶卵早期胚胎發(fā)育的影響不是簡單的相加或相減，而是相互作用的一種復合效應.綜上所述,重離子輻射降低了細胞的存活和增殖能力，同時影響了家蠶從受精卵到幼蟲的發(fā)育，降低了出蟻率.失重環(huán)境可以縮短家蠶卵的孵化時間.致謝感謝蘭州大學高清祥老師、中科院近物所黨秉榮老師和韓晶同學在實驗中給予的幫助！【參考文獻】1FinoLD,BelliF,BidoliV,etal.ALTEAdatahandlingJ.AdvSpaceRes,2006,37:1710-1715.2NariciL,BidoliV,CasolinoM,etal.ALTEA:Anomalouslongtermeffectsinastronauts.AprobeontheinfluenceofcosmicradiationandmicrogravityonthecentralnervoussystemduringlongflightsJ.AdvSpaceRes,2003,31(1):141-146.3ZhangL,XieM,LiYZ,etal.AdjustiveeffectsofTaikongXielidecoctiononimmunologicalfunctioninsuspendedandsuspensionaddingirradiationratsJ.ChinJClinRehabil,2005,9(43):98-100.4ZhangXY,WangGZ,DingB,etal.EffectsofsimulatedweightlessnessandirradiationonmetabolismofratmyocardialcellsculturedinvitroJ.SpaceMedMedEng(Beijing),1998,11(4):258-261.5ShiZZ,ZhuangDH,GuiZZ,etal.Flightexperimentofsil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