DNA的復制與重組.ppt

,DNA的復制與重組,一，DNA的復制,*,WastonandCrick,1953,現代生物化學和分子生物學的一個最基本的觀點在生命有機體中，基因是唯一能夠復制，并且能永遠存在的單位，而其意義最終須通過蛋白質才體現出來。從DNA到蛋白質，遺傳信息的流動遵循著中心法則。,1中心法則,2DNA的半保留復制,半保留復制（semiconservativereplication）即新的雙鏈DNA中，一股鏈來自模板，一股鏈為新合成的。,半保留復制的意義復制的這種方式可保證親代的遺傳特征完整無誤的傳遞給子代，體現了遺傳的保守性。,半保留復制實驗依據1958年M.Messelson等用實驗予以了證實雙螺旋結構是半保留復制的分子基礎,3DNA的半不連續(xù)復制,前導鏈（leadingstrain）:為連續(xù)合成，合成方向與解鏈方向一致，它的模板DNA鏈是53鏈。隨從鏈（laggingstrain）：不連續(xù)合成，在RNA引物基礎上分段合成DNA小片段（岡崎片段），方向與解鏈方向相反，它的模板DNA是35鏈。,（以原核生物大腸桿菌為例）1.原料：dNTP，Mg+2.雙鏈DNA模板3.引物（primer），小片段的DNA或RNA，常是RNA，有游離的3OH。4.引物酶（primase，DnaG），用于合成復制所必需的RNA引物5.解螺旋酶(helicase),DnaB,由DnaA和DnaC協助在復制的起始點（OriC）上解開雙螺旋。,4DNA的復制過程,4.1與復制有關的酶和因子,單鏈結合蛋白（SSB，singlestrandedbindingprotein）穩(wěn)定已經解開成兩股的DNA單鏈，防止其退火復性。7.拓撲異構酶(DNAtopoisomerase)DNA分子中存在打結，纏繞、連環(huán)的超螺旋現象。I型酶：切開雙鏈中的一股，使DNA不致打結，切口的3端可通過自由轉動一周再與5端磷酸連接，不需ATP。II型酶：切斷處于超螺旋狀態(tài)中雙股鏈中的某個部位，通過切口使超螺旋松弛，利用ATP使DNA恢復復制所要求的負超螺旋狀態(tài)。(注:拓撲一詞的含義是指物體或圖象作彈性移位而又保持物體不變的性質。),8.DNA聚合酶（DNApolymerase）,聚合酶III主要的復制酶，兼有校讀、糾錯的功能有從53延伸多核苷酸鏈的聚合酶活性，有模板依賴性，其延伸的方式是依據堿基互補配對的原則，將原料dNTP與末端核苷酸游離的3OH以3,5磷酸二酯鍵連接，同時釋出一個PPi。DNA聚合酶延伸多核苷酸鏈的方向總是53有從35外切酶的活性，以切除可能錯配的核苷酸,聚合酶I用于切除引物RNA,并填補留下的空隙有從53延伸多核苷酸鏈的聚合酶的活性；有從35外切酶的活性，以切除可能錯配的核苷酸；有從53外切酶的活性，其作用是切除引物聚合酶II活性弱,作用與聚合酶III相似有從53延伸多核苷酸鏈的聚合酶活性；有從35外切酶的活性,真核的DNA聚合酶真核DNA的復制至少涉及5種復制酶、和，其中、參與染色體DNA的復制。有引物要求；負責DNA的修復；的功能是線粒體DNA的復制。,9.DNA連接酶（ligase）,將不連續(xù)的DNA片段以3，5磷酸二酯鍵連接起來，原核生物通過分解NAD為NMN和Pi提供能量，真核生物則消耗ATP,5原核生物DNA的復制,In1963,JohnCairnsTechnique:GrewE.coliin3HthymidineWaitedtillcellswereinthemiddleofreplicationLysedthecellsveryverygentlySpreadthelysateonanEMgridExposedthegridtoX-rayfilmforTWOmonths.,ReplicationoftheE.colichromosome,WhatCairnsexperiment(1963)showed:,E.colihasacircularchromosome.E.colihasasingleoriginofreplication.InE.coli,replicationandunwindingaresimultaneous.,大腸桿菌(E.coli)的OriC復制原點,大腸桿菌基因組的復制原點位于天冬酰胺合酶和ATP合酶操縱子之間，全長245bp,稱為oriC。,復制的起始,大腸桿菌DNA復制的步驟,復制的延伸,復制的終止,6真核生物DNA的復制,真核生物DNA的復制特點,有多處復制起始點；在全部完成復制之前，各個起始點上DNA的復制不能再開始；DNA復制只在S期進行。復制子相對較小，為40-100千堿基對。,真核生物DNA的復制子被稱為ARS(autonomouslyreplicatingsequences)，長約150bp左右，包括數個復制起始必需的保守區(qū)。,真核生物DNA復制的起始需要起始點識別復合物（originrecognitioncomplex，ORC）參與，ORC結合于ARS，它是由6種蛋白質組成的啟動復合物。,真核生物DNA復制叉的移動速度大約只有50bp/秒。因此，人類DNA中每隔30,000-300,000bp就有一個復制起始位點。,已發(fā)現的真核生物DNA聚合酶有15種以上。在哺乳動物細胞中主要有5種DNA聚合酶，分別稱為DNA聚合酶、和。,真核生物DNA聚合酶的特性比較,DNA聚合酶主要參與引物合成。,DNA聚合酶活性水平穩(wěn)定，主要在DNA損傷的修復中起作用。,DNA聚合酶主要負責DNA的復制。,DNA聚合酶與后隨鏈合成有關，在DNA合成過程中核苷切除以及堿基的切除修復中起著重要的作用。,DNA聚合酶在線粒體DNA的復制中發(fā)揮作用。,免疫學信息網,免疫學信息網,免疫學信息網,免疫學信息網,免疫學信息網,RF-Cisafive-subunitcomplexAllsubunitsarerelatedinsequenceandhaveATPbindingmotifsATPhydrolysisbyRF-CisassociatedwiththeloadingofPCNARF-Cisthefunctionalhomologoftheclamp-loadergcomplex,免疫學信息網,免疫學信息網,Polymeraseswitchingoccursevenonlaggingstrands;polddoesmostofDNAsynthesis,免疫學信息網,免疫學信息網,二，DNA的重組,第一節(jié)概述,一、DNA重組（recombination）1、概念：DNA分子內或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合，稱為遺傳重組（geneticrecombination）,或者基因重排(generearrangement)。2、意義：重組是遺傳學的靈魂，沒有重組就沒有生物的進化；沒有重組也就沒有現代的分子克隆技術,二、DNA重組的類型1、同源重組（HomologousRecombination）2、位點特異性重組（Site-specificRecombination）3、DNA的轉座（transposition）,第二節(jié)同源重組,一、概述1、定義：兩個DNA分子同源序列之間進行的重組2、條件：（1）兩個DNA分子有同源序列（相關的酶可以用任何一對同源序列為底物）（2）兩個DNA分子必須緊密接觸3、發(fā)生：真核生物:非姐妹染色單體交換相對應的區(qū)域。原核生物:依賴recA蛋白，并形成Holliday結構Holiday模型（1964年）,二、大腸桿菌同源重組的分子基礎（一）RecA1、作用：可促進單鏈同化或單鏈吸收RecA具有使DNA單鏈置換雙鏈中同源鏈的能力,特異地識別單鏈DNA，并能將之與同源DNA中的互補順序“退火”，同時將另一條鏈排擠出去（取代），形成雜種分子2、單鏈同化發(fā)生的三個條件（1）其中一個DNA必須存在單鏈區(qū)（2）其中一個DNA必須有一個自由3末端（3）此單鏈區(qū)和3末端必須位于兩分子之間互補的區(qū)域內,（二）RecBCD復合體1、酶的活性：（1）核酸外切酶（2）核酸內切酶（3）解旋酶2、作用：在Chi位點處產生含3游離未端單鏈.,（三）Chi位點-RecBCD識別的靶位點5GCTGGTGG33CGACCACC5是重組頻率較高的部位E.coli中每隔約510kb有一個拷貝，,斷裂和重連產生異源雙鏈DNA1.同源序列排列在一起；2.酶切。通過核酸酶和RecBCD蛋白復合體的作用在一對同源DNA上產生切口；3.入侵。含有3端切口的ssDNA被recA蛋白包裹形成recA蛋白-ssDNA細絲；RecA-ssDNA細絲尋找相對的DNA雙螺旋上的相應序列。,三、Holiday重組模型,4.游離端交叉連接，形成Holliday結構5.通過分支遷移產生異源雙鏈DNA。,十字形結構,6.空間重排。十字型兩臂旋轉180度7.解離(兩種不同方式)8.修補連接,附：基因敲除(Geneknockout),是80年代后半期應用DNA同源重組原理發(fā)展起來的一門新技術是指對一個結構已知但功能未知的基因，從分子水平上設計實驗，將該基因去除，或用其它順序相近基因取代，然后從整體觀察實驗動物，推測相應基因的功能。,基因敲除的技術路線如下：（1）構建重組基因載體（2）用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA轉入受體細胞核內,基因敲除的靶細胞目前最常用的是小鼠ES細胞（3）用選擇培養(yǎng)基篩選已擊中的細胞（4）轉入假孕母鼠使其生長成為轉基因動物，對轉基因動物進行形態(tài)觀察及分子生物學檢測。,四細菌的基因轉移與重組,3種形式：1）轉化2）轉導3）接合,1轉化（transformation）,定義：細菌品系由于吸收了外源DNA（轉化因子）而發(fā)生遺傳性狀的改變現象。,轉化子（transformant）：經轉化后出現了供體性狀的受體細胞稱為轉化子，即轉化成功的菌落。,目前已知有二十多個種的G+和G-細菌具有自然轉化的能力此過程可以發(fā)生在土壤和海洋環(huán)境中，可能是自然界遺傳交換的重要方式。,（1）轉化因子本質是離體的DNA片斷或質粒DNA。轉化因子進入細胞前還會被酶解成更小的片段，約8kb。在不同的微生物中，轉化因子的形式不同，dsDNA,ssDNA.但不管何種情況，最易與細胞表面結合的仍是dsDNA。由于每個細胞表面能與轉化因子相結合的位點有限（如肺炎鏈球菌約10個），因此，從外界加入無關的dsDNA就可競爭并干擾轉化作用。質粒DNA也是良好的轉化因子，但它們通常并不能與核染色體組發(fā)生重組。轉化的頻率通常為0.11，最高為20。,（2）人工轉化,用CaCl2處理細胞，PEG介導、電穿孔、基因槍法等是常用的人工轉化手段（使細胞膜更易于透過DNA）。,在自然轉化的基礎上發(fā)展和建立的一項細菌基因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎技術。,用多種不同的技術處理受體細胞，使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的“人工感受態(tài)”。,質粒的轉化效率高（不像線型DNA那樣易于降解，而且還能在宿主中復制。任何來源的DNA將其連接到質粒上都能進入受體細胞）.,定義：噬菌體DNA被感受態(tài)細胞攝取并產生有活性的病毒顆粒。,（3）轉染(transfection)：,現在把DNA轉移至動物細胞的過程也稱轉染,提純的噬菌體DNA以轉化的（而非感染）途徑進入微生物細胞并表達后產生完整的病毒顆粒。,特點：,2轉導（transduction）,轉導：利用完全或部分缺陷噬菌體為媒介，把供體細胞的小片段DNA攜帶到受體細胞中，通過交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現象。,由轉導作用而獲得供體細胞部分遺傳性狀的重組受體細胞稱為轉導子（transductant）攜帶供體部分遺傳物質（DNA片段）的噬菌體稱為轉導噬菌體。,細菌轉導的二種類型：,普遍性轉導,局限性轉導,（1）、普遍性轉導（generalizedtransduction）,通過極少數完全缺陷噬菌體對供體菌基因組上任何小片段DNA進行誤包，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現象，稱普遍性轉導。,轉導模型,（2）.局限轉導（restrictedtransduction）定義：通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因組整合、重組，形成轉導子的現象。媒介：部分缺陷噬菌體（丟失自身一部分基因，并被同等長度的宿主基因所取代）只能轉導個別特定基因,大腸桿菌中噬菌體的正常裂解及半乳糖基因轉導噬菌體的形成過程,3、接合(conjugation),通過細胞與細胞的直接接觸而產生的遺傳信息的轉移和重組過程,（1）.接合現象的發(fā)現和證實,1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Tatum細菌的多重營養(yǎng)缺陷型雜交實驗,中間平板上長出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致！,為了減少所培養(yǎng)的結果是回復突變的機會，采用了雙重或三重營養(yǎng)缺陷型。該實驗是建立在不大可能同時發(fā)生兩種或三種回復突變的設想上的。,證實接合過程需要細胞間的直接接觸的“U”型管實驗（BernardDavis，1950）,大腸桿菌的接合型與接合,F菌株,第三節(jié)位點特異性重組,一、定義：不依賴于DNA順序的同源性，而依賴于能與某些酶相結合的特異的DNA序列的存在。二、噬菌體對E.coliDNA的整合（一）DNA存在兩種形式裂解狀態(tài)溶源狀態(tài)（二）通過位點特異性重組實現兩種類型間的轉換DNA整合到宿主DNA進入溶源狀態(tài)DNA從宿主DNA中切離進入裂解狀態(tài),（三）催化重組的酶1、整合酶Int(integrase)：有拓撲異構酶活性2、整合宿主因子（IHF，integrationhostfactor）3、切除酶（excisionase）/終止重組（四）重組位點：附著位點（attachmentsite）attP（POP）和attB（BOB）有15bp核心序列配對（五）重組過程：1、整合：POP+BOBBOPPOB2、切離：BOPPOBPOP+BOB,attP,attB,attP,attB,第四節(jié)DNA的轉座,一、轉座子（transposon）的定義：存在于染色體DNA上可自主轉移座位的基本單位二、轉座子發(fā)現：McClintockB：1938年，提出轉座基因概念1983年，獲