Bax抑制肽對(duì)HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C及Caspase3蛋白的影響

Bax抑制肽對(duì)BD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C及Oaspase一3蛋白的影響于葡妻目的 觀察Bax-抑制肽(Baxinhibiting peptide，BIP)對(duì)缺氧缺血性腦損傷(hypoxiaischemic brain damage，HIBD)新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞色素C(cytocllrome C，Cyt C)及促凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶(caspase一3)的影響，以探討B(tài)ax抑制肽對(duì)HIBD后的神經(jīng)保護(hù)作用，為臨床治療新生兒缺氧缺血性腦損傷提供理論依據(jù)。方法182只7日齡Wistar大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=14只)、對(duì)照組(n=84只)、干預(yù)組(n=84只)。對(duì)照組與干預(yù)組通過(guò)結(jié)扎新生大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈和8低氧處理2h制備新生大鼠HIBD模型，假手術(shù)組僅游離左側(cè)頸總動(dòng)脈，不予結(jié)扎及低氧處理。干預(yù)組于HI即刻、6h、12h、24h、48h、72h左側(cè)側(cè)腦室內(nèi)注射5ugBIP(即5u1)，對(duì)照組于相同時(shí)間點(diǎn)予等量生理鹽水(5u1)左側(cè)側(cè)腦室內(nèi)注射，按注射時(shí)間點(diǎn)不同分別分為6個(gè)不同亞組。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于術(shù)后7d處死。應(yīng)用HE染色、末端脫氧核甘酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的生物素化-dUTP原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)及蛋白免疫印跡法(Western Blot)觀察各組病理變化、細(xì)胞凋亡及Cyt C、Caspase一3蛋白釋放情況。結(jié)果 (1)海馬區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目變化：對(duì)照組及干預(yù)組HIBD后左側(cè)大腦海馬區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)較假手術(shù)組顯著增加，差異有極顯著性意義(尸001)。干預(yù)組與對(duì)照組在0h、6h、12h、24h、48h亞組比較，凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P001)，干預(yù)組0h亞組凋亡細(xì)胞數(shù)較干預(yù)組6h、12h、24h、48h亞組減少(PO05)；(2)活性caspase一3及Cyt C的含量變化：對(duì)照組及干預(yù)組caspase一3活性片段、Cyt C釋放量較假手術(shù)組顯著增加，差異有極顯著性意義(p001)。干預(yù)組與對(duì)照組在Oh、6h、12h、24h、48h亞組比較，caspase-3活性片段、Cyt C釋放量顯著減少(PO01)，干預(yù)組0h亞組caspase一3活性片段、Cyt C釋放量較干預(yù)組6h、12h、24h、48h亞組減少(PO05)。結(jié)論Bax一抑制肽治療能顯著降低HIBD新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生率，HI后48小時(shí)內(nèi)為BIP最佳治療時(shí)間窗，治療時(shí)間越早作用越顯著，以HIBD即刻注射效果最佳。其機(jī)制可能與保護(hù)線粒體膜，減少Cyt C釋放，減輕或抑制caspase一3蛋白酶活性有關(guān)。碩士研究生 于茂敏(兒科學(xué))指導(dǎo)教師 姜紅教授關(guān)鍵詞： capase一3；細(xì)胞色素C；Bax抑制肽；缺氧缺血，腦；凋亡；新生，大鼠Effect of Baxinhibiting peptide on cytochrome C and Caspase-3expression in Neonatal Rats with hypoxic-ischemicAbstractbrain damageIIMIIIkklIIllllIIIIllIIIIImIIIIIIIJY2338742objectives To observe the effects of cytochrome C and Caspase3 expression byBax-inhibiting peptide(BIP)in different interval intracerebroventricular injection inneonatal rats with hypoxic-ischemic brain damage(HIBD)，and to explore theneuroprotective effect Bax-inhibiting peptide after hypoxic-ischemic brain damage，providing a theoretical basis for the clinical treatment of neonatal hypoxicischemicbrain damageMethods 1 82 sevenday-old Wistar rats were randomly divided intosham。operated group(n 2 1 4)，control group(n 2 84)，treatment group(n=84)，Theright carotid arteries of rats in sham-operated group were only isolated，withoutligation，ischemia，hypoxia and medication，while control group and treatment groupwere made by shearing fight carotid arteries communis and breathing 8oxygen fortwo hoursThe newborn rats of treatment group and control group was separatelyinjected Bax-inhibitory peptide(5 u1)and normal saline(5 u1)through the left laeralventricular respectively in immediately、6 h，1 2 h、24 h、48 h and 72 h after HIBDmodel establishment，divided into 6 subgroups by inj ection time pointAll newbornrats included in this study were put to death at 7 days after HIBD model establishmentCerebral pathomorphological changes was observed by HE staining and TUNELmethodThe cytochrome C and Caspase3 expression in neonatal rats brain，asexamined by Western blot detectionResults(1)Changes in the number of TUNELpositive cells in the hippocampus：Compared with sham-operated group，TUNEL-positive cells in the left hippocampuswere significantly increased in control group and treatment group after HIBDThedifference was very significant(PO0 1)The number of TUNEL positive cells intreatment group was lower than that in control group significantly at 0 h，6 h，1 2 h，24h，48 h after HIBD(P00 1)The number of TUNEL positive cells in Oh group waslower than that in 6h，1 2h，24h，48 group(P00 1)(2)Expression of active caspase-3and Cyt C：Compared with sham-operated group，The amount of active caspase3 andCyt C were significantly increased in control group and treatment group after HIBDThe difference was very significant(PO0 1)The amount of active caspase3expression and Cyt C in treatment group was lower than that in control groupsignificantly at 0 h，6 h，1 2 h，24 h，48 h after HIBD(P00 1)The amount of activecaspase一3 expression and Cyt C in Oh group was lower than that in 6h，1 2h，24h，48hgroup fP001)Conclusions Bax-inhibiting peptide treatment attenuates neuronal apoptosisfollowing HIBDThe effective treatment time window of Bax inhibitor peptide inhypoxia ischemia time is within 48h after HIBDIts mechanism may be related toprotect the mitochondrial membrane，through a reduction in Cyt C release frommitochondria and an inhibition of caspase3 enzyme activityPostgraduate student：Yu Maomin(Pediatrics)Directied by ProfJiang HongKey words Capase-3；Cytochrome C；Bax-inhibiting peptide；Hypoxiaischemicbrain；Cell apoptosis；Neonatal rats目錄引言一l第1章材料與方法311 材料3111 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物31i2 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑3113 主要實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備412 方法4121 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組與處理4122 標(biāo)本采集5I23 制備腦組織切片5124 HE切片制作6125 TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡6I26 Western blot檢測(cè)caspase一3和細(xì)胞色素C的釋放量7第2章數(shù)據(jù)采集及處理“821 數(shù)據(jù)采集822 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理8第3章結(jié)果93I 新生大鼠HIBD模型建立后的神經(jīng)行為評(píng)價(jià)一932 新生大鼠腦組織海馬區(qū)HE染色形態(tài)學(xué)改變”933 TUNEL技術(shù)檢測(cè)新生大鼠海馬區(qū)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)934 Western blot檢測(cè)細(xì)胞色素C的釋放量1035 Western blot檢測(cè)活性caspase3的釋放量11第4章討論1 3第5章 結(jié)論1 9剛圖表20參考文獻(xiàn)24綜杰盎29攻讀學(xué)位期間的研究成果37iil：謝3 8學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明、學(xué)位論文知識(shí)產(chǎn)權(quán)權(quán)屬聲明39引言Bax抑制肽對(duì)BD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C及Caspase一3蛋白的影響引言缺氧缺血性腦損傷(hypoxicIschemicbraindamage，HIBD)是由于胎兒宮內(nèi)窘迫、新生兒窒息等引起的新生兒腦部嚴(yán)重?fù)p傷，目前仍是新生兒期最多見(jiàn)及最嚴(yán)重的疾病之一，發(fā)病率及死亡率居高不下，也是導(dǎo)致智能落后和腦性癱瘓等兒童傷殘的主要原因，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。HBID的發(fā)生受多種因素影響，目前尚缺乏特異的治療方法晗1，如何及時(shí)采取有效的干預(yù)措施，改善預(yù)后，提高患兒的生存質(zhì)量是臨床工作者亟待解決的問(wèn)題。HIBD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及能量代謝障礙、氧自由基損傷、鈣超載、N0的神經(jīng)毒性作用、興奮性氨基酸的毒性作用等因素，最終引起神經(jīng)元多發(fā)性損傷而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞死亡存在壞死及凋亡兩種形式。其中細(xì)胞凋亡是后期神經(jīng)細(xì)胞缺失和功能障礙的主要原因。Hill口1等用新生7日齡大鼠制成HIBD模型證實(shí)了缺氧缺血性腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的存在，缺氧缺血后導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞死亡其機(jī)制比較復(fù)雜并涉及多條信號(hào)傳導(dǎo)途徑，其中線粒體在不同死亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，成為調(diào)控細(xì)胞凋亡的靶點(diǎn)。已知至少有兩條通路可導(dǎo)致線粒體通透性增加H剖。一種是存在于線粒體內(nèi)膜的滲透性轉(zhuǎn)換孔(PT)的開(kāi)放；另一種是依賴于BaxBak的線粒體外膜的直接開(kāi)放。在成熟腦中缺血可以引起線粒體PT孔道開(kāi)放導(dǎo)致細(xì)胞壞死。抑制PT孔道對(duì)成年腦損傷有保護(hù)作用。但是在未成熟腦中，線粒體PT孔道抑制劑對(duì)缺氧缺血性腦損傷無(wú)任何保護(hù)作用。而B(niǎo)ax在未成熟腦中呈高表達(dá)盯1，并且在線粒體通透性調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。Bax途徑導(dǎo)致的線粒體膜通透性的改變可能是引起幼年腦損傷的重要環(huán)節(jié)。Bax是Bcl一2家族中一種促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白，在未成熟腦中呈高表達(dá)，通常在胞質(zhì)中以單體的形式存在，細(xì)胞接受到死亡信號(hào)的刺激時(shí)，胞漿中的促凋亡蛋白Bax發(fā)生構(gòu)象改變睛3。激活Bax蛋白并使其移位至線粒體內(nèi)形成同源二聚體蛋白通道，線粒體膜上的細(xì)胞色素C通過(guò)插入到線粒體外膜上的Bax通道釋放到胞漿，在ATPdATP的參與下，在胞質(zhì)中與Apaf一1結(jié)合形成寡聚體，Apaf-l通過(guò)其氨基端和Caspase一9前體的功能前區(qū)相互作用，導(dǎo)致Caspase一3激活成為具有活性的酶，從而降解下游底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。近年來(lái)對(duì)細(xì)胞凋亡的研究認(rèn)為細(xì)胞色素C和半胱氨酸蛋白酶caspase一3是凋亡發(fā)生和調(diào)控機(jī)制中最重要的組成部分。缺氧缺血等因素可使線粒體膜通透性增加，線粒體受破壞，釋放細(xì)胞色素C和其他死亡因子(如青島大學(xué)碩士學(xué)位論文凋亡誘導(dǎo)因子AIF)到胞漿中，胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C與凋亡蛋白活性因子工(apoptoticprotease activatingfactor一1，Apaf一1)結(jié)合使之活化，后Apaf一1者可導(dǎo)致caspase9的自身剪切與活化，活化的caspase 9可激活caspase 3，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡u2。1。Bax抑制肽(BIPs)是一種從Ku70(一種核蛋白)提取的細(xì)胞通透性多肽，能夠通過(guò)血腦屏障，通過(guò)Bax蛋白結(jié)合域與促凋亡蛋白Bax相互作用，阻止其構(gòu)象發(fā)生改變和線粒體移動(dòng)，從而保護(hù)細(xì)胞免受Bax介導(dǎo)的凋亡的影響，可以有效地阻斷Caspase依賴的細(xì)胞凋亡n引。目前已有研究發(fā)現(xiàn)Bax抑制性肽可以降低未成熟腦缺氧缺血后線粒體膜腔隙中的促凋亡蛋白的釋放以及Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活減輕腦損傷u71。國(guó)外已有相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Bax一抑制肽具有良好的細(xì)胞膜穿透能力，其氨基酸序列與bax的結(jié)合結(jié)構(gòu)域相對(duì)應(yīng)，可與胞漿中的內(nèi)Bax蛋白相結(jié)合，抑制Bax結(jié)構(gòu)的改變及向線粒體的移位，進(jìn)而抑制線粒體膜上bax通道開(kāi)放，阻止線粒體膜通透性下降，抑制細(xì)胞色素C從線粒體中釋放，阻斷capase蛋白酶系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞對(duì)抗細(xì)胞凋亡H引。目前尚缺乏Bax抑制肽在體內(nèi)阻止線粒體膜通透性下降，抑制細(xì)胞色素C從線粒體中釋放，與Caspase一3等蛋白酶結(jié)合發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)的相關(guān)報(bào)道，因此本研究在選用新生7日齡Wistar大鼠制備圍產(chǎn)期缺氧缺血腦損傷HIBD模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變(MPT)激活的第二條途Bax途徑，在新生大鼠HIBD后不同時(shí)間點(diǎn)予側(cè)腦室注射Bax一抑制肽，利用HE、TUNEL、免疫組織化學(xué)染色、Western Blot技術(shù)定量分析Bax抑制肽對(duì)細(xì)胞色素C和促凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶caspase一3在新生大鼠HIBD后大腦皮質(zhì)海馬區(qū)的改變，以評(píng)價(jià)Bax抑制肽的線粒體保護(hù)作用，防治新生大鼠缺氧缺血性腦損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡的療效，為臨床應(yīng)用神經(jīng)類營(yíng)養(yǎng)藥物提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。2材料與方法第一章材料與方法11材料111實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新生7日齡Wistar大鼠SCXK(魯)20090007，雌雄不限，體質(zhì)量12169，共182只，由青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。1。12實(shí)驗(yàn)藥品和試劑1 細(xì)胞色素C抗體產(chǎn)品編號(hào)：BS-0013R英文名稱：AntiCytochrome C生產(chǎn)商名：北京博奧森生物技術(shù)有限公司2 活化半胱胺酸蛋白酶蛋白一3抗體產(chǎn)品編號(hào)：BS0081R英文名稱：AntiCaspase一3(Active)生產(chǎn)商名：北京博奧森生物技術(shù)有限公司4 Bax一抑制肽英文名稱：BaxInhibiting Peptide，V5產(chǎn)品批號(hào)：196810生產(chǎn)商名：德國(guó)默克醫(yī)藥公司產(chǎn)品規(guī)格：5 mgmL5 高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品貨號(hào)：CW0049生產(chǎn)商名：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司6 細(xì)胞凋亡試劑盒英文名稱：(Roche)Tunel試劑盒產(chǎn)品貨號(hào)：11684817生產(chǎn)商名：上海羅氏公司7 自各試劑及用品手術(shù)器械載玻片及蓋玻片防脫片用多聚賴氨酸02molL磷酸氫二鈉儲(chǔ)存液：500ml蒸餾水加Na2HP0412H20 3581902molL磷酸二氫鈉儲(chǔ)存液：500ml蒸餾水加NaH2P042H20 1560902molL磷酸緩沖液(pH 76)1青島大學(xué)碩士學(xué)位論文4中性緩沖多聚甲醛固定液：40甲醛與001M PBS之比為l：9配制1 0水合氯醛溶液8氮氧混合氣體：青島華瑞氣體科技有限公司113主要實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備1 顯微鏡及顯微成像系統(tǒng)2微量注射器(10u1)3腦組織切片機(jī)4 蛋白電泳系統(tǒng)5 蛋白轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)6 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)7 常壓缺氧艙裝置12方法OLYMPUS BX4 1上海醫(yī)用儀器廠Leika2235BioRad MiniPROTEANTetra II北京六一DYY一7C型Fusion X7型自制(見(jiàn)照片3)121實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組與處理1 動(dòng)物分組新生7日齡Wistar大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量12169，共182只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=14只)、對(duì)照組(n=84只)、干預(yù)組(n=84只)，干預(yù)組和對(duì)照組根據(jù)側(cè)腦室注射Bax-抑制肽和生理鹽水的時(shí)間點(diǎn)不同分為0h、6h、i2h、24h、48h、72h六個(gè)亞組。模型制作過(guò)程、側(cè)腦室穿刺過(guò)程及后期喂養(yǎng)過(guò)程中共死亡12只，按隨機(jī)原則以經(jīng)過(guò)相同處理的動(dòng)物補(bǔ)充。2新生大鼠HIBD模型制作HIBD模型制作：參照Rice法n81制作HIBD模型，選擇新生7目齡Wistar大鼠根據(jù)體質(zhì)量腹腔注射10水合氯醛3mlkg進(jìn)行麻醉，仰臥位，頭部和四肢固定在手術(shù)板上，局部消毒頸部皮膚。于頸部作一O6 cm正中切口，暴露與氣管平行的胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌和胸鎖乳突??；將胸骨舌骨肌和肩胛舌骨肌分離，沿胸骨舌骨肌做分離，暴露并游離出左側(cè)頸總動(dòng)脈(圖1)，并予雙線結(jié)扎，用4-0號(hào)線縫合切口(手術(shù)時(shí)間在lO分鐘之內(nèi))。術(shù)后將新生鼠放回母鼠籠內(nèi)恢復(fù)2小時(shí)；將蘇醒大的鼠放入透明密閉容器缺氧處理，向容器內(nèi)輸入經(jīng)濕化處理的8氮氧混合氣體(速度為2Lmin)，密閉容器置于37。C恒溫水浴箱中；缺氧2小時(shí)后，取出大鼠放回母鼠身邊喂養(yǎng)，避免強(qiáng)光和噪音刺激。建立HIBD模型成功的指標(biāo)：新生鼠術(shù)后出現(xiàn)感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)功能障礙、體重增長(zhǎng)遲緩、與正常的腦組織相比較，病變側(cè)腦組織在形態(tài)上及組織病理上存在明顯差異。新生鼠于缺氧20分鐘左右時(shí)出現(xiàn)煩躁、紫紺、呼吸急促；30分鐘左右時(shí)出現(xiàn)站立不穩(wěn)、抽搐；l小時(shí)左右開(kāi)始出現(xiàn)嗜睡、昏迷等狀態(tài)。缺血缺氧性腦損傷可以導(dǎo)致4材料與方法大腦皮層下運(yùn)動(dòng)中樞損害，本實(shí)驗(yàn)約有64的新生鼠在模型建立后可出現(xiàn)自發(fā)或夾尾左旋，符合HIBD模型制備成功的行為學(xué)特征，進(jìn)一步證實(shí)本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒊晒Α?