熒光分光光度法測定面粉中核黃素(VB2).ppt

04 06 43 熒光分光光度法測定面粉中核黃素 vb2 一 實驗?zāi)康亩?實驗原理三 fl 4500型氣相色譜儀四 實驗步驟五 數(shù)據(jù)處理六 思考題 復(fù)旦化學(xué)系教學(xué)實驗中心包慧敏 04 06 43 1 掌握面粉樣品的消化方法 了解溶液的ph值等對核黃素熒光強度的影響 2 了解熒光分光光度計的主要結(jié)構(gòu)及工作原理 掌握其正確使用方法 3 熒光分析法基本原理和學(xué)習測繪核黃素的激發(fā)光譜和熒光光譜 標準曲線法定量分析 一 實驗?zāi)康?04 06 43 二 實驗原理 1 熒光 熒光分子 熒光物質(zhì)2 熒光分析法 特點 定量方法3 核黃素vb2 結(jié)構(gòu) 性質(zhì) 面粉中提取方法4 熒光分光光度計 結(jié)構(gòu) 原理 操作 04 06 43 熒光產(chǎn)生的機制 去活化過程 問題1 熒光 熒光分子 04 06 43 強熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)特點 共軛 體系 剛性平面結(jié)構(gòu) 取代基 如熒光素和酚酞結(jié)構(gòu)十分相似 熒光素在溶液中有很強的熒光 而酚酞沒有 如芴和聯(lián)苯在相同的條件下 熒光量子產(chǎn)率約為1和0 18 04 06 43 影響熒光發(fā)射溶液環(huán)境因素p 362 a 溶劑效應(yīng) 取決于熒光體和溶劑的化學(xué)結(jié)構(gòu) 極性 重原子效應(yīng) b 溫度 t f c ph平衡解離關(guān)系對 f max f均有影響 溶液熒光的猝滅p 364熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子之間相互作用而導(dǎo)致熒光強度下降的現(xiàn)象稱為熒光的猝滅 或熄滅 引起熒光猝滅的物質(zhì)稱為熒光猝滅劑 04 06 43 問題2 分子熒光分析法 04 06 43 1 原子光譜與分子光譜原子光譜 電子能級躍遷 分子光譜 電子能級 振動能級 轉(zhuǎn)動能級躍遷2 吸收光譜與發(fā)射光譜吸收光譜 從低能級向高能級躍遷 使光的強度減弱 發(fā)射光譜 從高能級躍遷回低能級 相應(yīng)的能量以光的形式輻射出來3 關(guān)系原子光譜 原子吸收光譜 原子發(fā)射光譜 分子光譜 分子吸收光譜 可見 紫外 紅外吸收光譜 光譜名稱的問題 04 06 43 原子光譜v s 分子光譜 原子光譜 線光譜 電子躍遷能級 單重態(tài) 三重態(tài) 分子光譜 帶光譜 電子躍遷能級分子振動能級分子轉(zhuǎn)動能級 04 06 43 激發(fā)光譜熒光光譜 em max處if ex 吸收光譜v s 發(fā)射光譜 04 06 43 圖15 3三維熒光光譜的兩種表示 b 等高線光譜圖 a 等角三維投影圖 分子熒光光度法的一些基本概念激發(fā)光譜 熒光光譜 三維熒光光譜用途 04 06 43 熒光強度if與熒光物質(zhì)的溶液濃度c成線性關(guān)系 if 2 3 fi0 bc b 試樣的吸收光程 摩爾吸光系數(shù) f 熒光發(fā)射的量子產(chǎn)率 if 熒光強度 當i0及b一定 稀溶液中 c 試樣濃度 if kc i0 入射光強度 熒光定量分析的基礎(chǔ) 04 06 43 標準曲線法 工作曲線法 1 最大激發(fā)波長 最大吸收波長的選擇 2 系列標準溶液繪制工作曲線 3 測定未知溶液 查得其濃度 標準曲線法求解k 1 圖解法 2 解析法 04 06 43 靈敏度高 測定下限在0 1 0 001 g ml 比分光光度法高2 4個數(shù)量級 光強i與i0的信號差別 熒光發(fā)射的光強選擇性高 適當選擇激發(fā)光波長和熒光測定波長產(chǎn)生熒光的化合物有限 不及分光光度法廣泛 干擾物質(zhì)較少 分子熒光分光光度法v s 紫外 可見分光光度法 04 06 43 三 f 4500型熒光分光光度計 比色皿 樣品槽 04 06 43 f 4500型熒光分光光度計光路圖 04 06 43 1 開機power xelamp main啟動軟件flsolutionsprogram f 4500型熒光分光光度計的使用 04 06 43 2 波長掃描wavelength scanstart method sample pre scan measure 數(shù)據(jù)處理 reportmethod f 4500型熒光分光光度計的使用 04 06 43 1 試樣溶液制備2 實驗條件的選擇3 標準曲線的繪制及樣品的測定 四 實驗步驟 04 06 43 關(guān)于核黃素vb2 面粉中提取方法 面粉主要成分淀粉 蛋白質(zhì) 脂肪 礦物質(zhì) 維生素等 營養(yǎng)強化面粉國家標準 面粉中核黃素含量1 10 6 5 10 4g l 回收率為98 105 方法檢出限4 10 8g l 核黃素又稱維生素b2 維他命b2riboflavinec17h20o6n4微溶于水 對空氣 氧氣穩(wěn)定 對光敏感 在430 440nm藍光照射下會在525nm附近發(fā)綠色熒光 在ph6 7的水溶液中熒光最強 在ph為11時熒光消失 04 06 43 面粉10g400ml燒杯加0 1mol l鹽酸100ml冷卻后 用naoh調(diào)至ph6 0 6 5 然后立即加稀鹽酸至ph4 5將混合物定量轉(zhuǎn)移至250ml容量瓶 用 5 95 醋酸溶液定容 離心取清液 避光 待測 1 試樣溶液制備 劇烈攪拌 倒入150ml沸水 維持微沸30min并攪拌使均勻分散核黃素在堿性溶液中不穩(wěn)定 要邊加邊搖防止局部堿性過強加1滴丁醇配平 離心取上清 04 06 43 1 激發(fā)光波長 熒光波長選擇吸取核黃素標準溶液1ml于25ml容量瓶 用 5 95 醋酸溶液定容 暫設(shè)定熒光波長即發(fā)射光波長ex 525nm 在400 500nm波長范圍對激發(fā)波長進行掃描 記錄激發(fā)光譜曲線 取最大激發(fā)波長em 在400 500nm波長范圍對熒光波長進行掃描 記錄熒光光譜曲線 確定最佳激發(fā)光波長 熒光波長 2 酸度選擇取三個25ml容量瓶 各加入核黃素標準溶液1ml 然后分別用1 1鹽酸 5 95 醋酸 5 naoh溶液稀釋到刻度 分別測定溶液ph值 測定熒光強度 考察酸度對熒光強度的影響 從中確定最佳酸度 2 實驗條件的選擇 3 標準曲線的繪制及樣品的測定 04 06 43 五 數(shù)據(jù)處理 1 從熒光光譜圖上讀出最大激發(fā) ex 和發(fā)射波長 em 2 軟件繪制標準工作曲線法3 計算面粉提取液中維生素b2的含量 04 06 43 本實驗注意事項 1 溶液的配制 鹽酸濃度 naoh調(diào)節(jié)ph理論計算等2 標準溶液移取與稀釋操作3 系列標液的測定順序4 樣品保存 防止光降解5 熒光儀的開關(guān)機順序 04 06 43 六 思考題 1 在熒光測量中 為什么激發(fā)光的入射與熒光的接收不在一直線上 而呈一定角度 2 試述熒光分光光度計與紫外 可見分光光度計在結(jié)構(gòu)上的有哪些不同點 3 定量測定維生素b2可用的方法有哪些 試比較各種方法的優(yōu)缺點 04 06 43 氧化型 還原型 問題3 面粉的主要成分 淀粉 蛋白質(zhì) 脂肪 礦物質(zhì) 維生素等