培養(yǎng)基手冊(cè).doc

培養(yǎng)基手冊(cè)MEDIA HANDBOOK（2005）一、培養(yǎng)基的歷史體外培養(yǎng)（in vitro culture）包括：組織培養(yǎng)（tissue culture）、細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture）、器官培養(yǎng)（organ culture）。顧名思義，就是將活體結(jié)構(gòu)成分（如活體組織、活體細(xì)胞或者活體器官等）從體內(nèi)或其寄生體內(nèi)取出，放在類似于體內(nèi)生存環(huán)境的體外環(huán)境中，讓其生長(zhǎng)發(fā)育的方法。廣義組織培養(yǎng)與體外培養(yǎng)同義。體外培養(yǎng)已經(jīng)歷了約一百年的發(fā)展歷史，但發(fā)展初期進(jìn)程比較緩慢，沒(méi)有引起很多學(xué)者的重視。直到上世紀(jì)50年代后期，體外培養(yǎng)技術(shù)才廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，使這項(xiàng)技術(shù)得到飛速發(fā)展?，F(xiàn)在體外培養(yǎng)已成為細(xì)胞工程、基因工程、抗體工程的重要組成部分。細(xì)胞培養(yǎng)指從生物機(jī)體取出部分組織分散成單個(gè)細(xì)胞或直接從機(jī)體取出單個(gè)細(xì)胞，也可把體外培養(yǎng)細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞在體外條件下培養(yǎng)，細(xì)胞能繼續(xù)存活與增殖。培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞不再形成組織。發(fā)展與完善細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)圍繞防止污染、改進(jìn)培養(yǎng)方法、設(shè)計(jì)新型培養(yǎng)容器、設(shè)計(jì)不同的培養(yǎng)液等幾個(gè)方面進(jìn)行。1885年Roux溫生理鹽水培育雞胚組織；1903年Jolly，1906年Beebe等發(fā)明了蓋片懸滴培養(yǎng)；1907年Harrison培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)成功，開(kāi)始創(chuàng)建蓋片凹玻璃懸滴培養(yǎng)法； 1910、1912年Carrel采用無(wú)菌操作、更新培養(yǎng)基、傳代，完善了懸滴培養(yǎng)法； 1924年Maximow采用雙蓋片懸滴培養(yǎng)法；1923年Carral設(shè)計(jì)創(chuàng)立了卡氏瓶培養(yǎng)法，用此法可根據(jù)需要隨時(shí)更換培養(yǎng)液，既有利于組織不斷生長(zhǎng)，又可以運(yùn)用不同種類的營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)不同的細(xì)胞，極大地推動(dòng)了當(dāng)時(shí)組織培養(yǎng)研究。Earle等加以改進(jìn)，使大量細(xì)胞能直接生長(zhǎng)于玻璃瓶壁上，培養(yǎng)了正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞株。至此大多數(shù)研究人員都采用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞。組織培養(yǎng)從二十世紀(jì)40年代起迅速發(fā)展,在培養(yǎng)容器、培養(yǎng)基和培養(yǎng)技術(shù)等方面出現(xiàn)了很多革新。在培養(yǎng)容器方面, 由簡(jiǎn)單的用試管、旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)，發(fā)展到多種培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，近年來(lái)，塑料瓶、皿、多孔培養(yǎng)板的使用已日趨普遍。在培養(yǎng)基方面，從50年代初，Parke、Eagle等設(shè)計(jì)出合成培養(yǎng)基后，從純天然培養(yǎng)基到合成培養(yǎng)基、從雞胚浸出液發(fā)展到動(dòng)物血清（促細(xì)胞生長(zhǎng)物），直至60年代設(shè)計(jì)出無(wú)血清培養(yǎng)基。首先反映在設(shè)計(jì)不同種類的緩沖鹽溶液，以用來(lái)培養(yǎng)不同的細(xì)胞和洗滌細(xì)胞。Earle在1948年設(shè)計(jì)了含有碳酸氫鈉等鹽類的Earle氏鹽溶液，Hanks在1949年設(shè)計(jì)了Hanks氏鹽溶液。在培養(yǎng)技術(shù)方法方面，革新進(jìn)展更為迅猛，Earle、Dulbecco等于1943年創(chuàng)建單層細(xì)胞培養(yǎng)法，首建長(zhǎng)期傳代的L-細(xì)胞系。 1948年Sanford創(chuàng)建單細(xì)胞分離培養(yǎng)法，獲L-細(xì)胞純系。 1951年Gey首建人腫瘤細(xì)胞Hela細(xì)胞系。 1961年Hayflick首建人二倍體細(xì)胞系25種，開(kāi)辟了應(yīng)用新方向。從50年代末開(kāi)始，組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用進(jìn)入了一個(gè)繁盛的階段，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究各個(gè)領(lǐng)域。 誘變建立遺傳缺陷細(xì)胞株、雜交瘤技術(shù)制備單抗、發(fā)展細(xì)胞大量培養(yǎng)技術(shù)、利用重組技術(shù)構(gòu)建工程細(xì)胞株，已成為生物工程的重要生產(chǎn)手段。 在連續(xù)灌注培養(yǎng)工藝方面，美國(guó)Ohashi,Ryo等人2001年報(bào)道采用2L一次性生物反應(yīng)器灌注培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體，以Becton Dickenson Cell Mab+10%胎牛血清+1聚醚F-68為培養(yǎng)基，最高活細(xì)胞密度超過(guò)1107cells/ml；2001年瑞士Heine, Holger等人用帶超聲細(xì)胞分離器(UCS)的連續(xù)灌注攪拌罐生物反應(yīng)器培養(yǎng)鼠雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體，穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)時(shí)活細(xì)胞密度超過(guò)2107cells/ml；2004年德國(guó)Thomas等人在1L攪拌罐生物反應(yīng)器中培養(yǎng)rCHO細(xì)胞生產(chǎn)人MUC-1糖蛋白，采取葡萄糖濃度限制的高產(chǎn)率灌注工藝減少有害代謝物，代謝轉(zhuǎn)向TCA循環(huán)增加，活細(xì)胞密度保持在(12)107cells/ml。在流加懸浮培養(yǎng)工藝方面，美國(guó)麻省理工Xie Liangzhi等人2000年報(bào)道在2L生物反應(yīng)器中流加培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)控制降低氨和乳酸的比生成速率，補(bǔ)充培養(yǎng)基包括營(yíng)養(yǎng)成分、胎牛血清和痕量金屬，最大活細(xì)胞密度達(dá)到1.7107cells/mL。二、細(xì)胞培養(yǎng)目的與用途 1 科學(xué)研究（1）藥物研究開(kāi)發(fā)，如新藥篩選，疫苗、基因工程藥物、細(xì)胞工程藥物 研究與開(kāi)發(fā)、單克隆抗體制備等。（2）基礎(chǔ)研究，如藥物作用機(jī)理、基因功能、疾病發(fā)生機(jī)理等研究。2 生物制藥 （1）疫苗生產(chǎn)：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等)，多肽疫苗（腫瘤疫苗)等。（2）基因工程藥物生產(chǎn)：如EPO等。（3）抗體藥物、基因治療藥物生產(chǎn)。（4）細(xì)胞工程藥物生產(chǎn)：生物細(xì)胞內(nèi)的一些生物活性多肽，生物活性物質(zhì)等。（5）利用細(xì)胞法體外測(cè)定生物活性物質(zhì)的活性；并預(yù)測(cè)其在體內(nèi)的藥效和替代體內(nèi)法檢測(cè)其成品的生物活性。三、細(xì)胞培養(yǎng)基的定義人工模擬細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，維持細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),它是提供細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。包括：1 天然培養(yǎng)基指來(lái)自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一些培養(yǎng)基，如動(dòng)物血漿、胚胎浸出液、血清和人血清，水解乳蛋白等。2 合成培養(yǎng)基人工設(shè)計(jì)、配制的培養(yǎng)基，如MEM、199、DMEM、RPMI1640等。四、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)平臺(tái)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)已成為生物制藥領(lǐng)域最重要的關(guān)鍵技術(shù)之一，并以其研究的深入和進(jìn)展推動(dòng)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展。專家預(yù)言：蛋白治療藥物如糖蛋白、抗體和多肽藥物僅僅只是剛剛開(kāi)始進(jìn)入市場(chǎng)，預(yù)計(jì)在下一個(gè)10年或20年會(huì)有更為快速的發(fā)展。屆時(shí)，蛋白治療藥物的迅速增長(zhǎng)和市場(chǎng)需求將遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)全世界的生產(chǎn)能力。動(dòng)物細(xì)胞規(guī)?；a(chǎn)重組蛋白和抗體的工藝選擇可考慮使用當(dāng)前較成熟的工業(yè)化支持技術(shù)平臺(tái)，以縮短產(chǎn)品工藝研發(fā)的時(shí)間，加快工業(yè)化進(jìn)程。當(dāng)前已獲FDA批準(zhǔn)的生物技術(shù)產(chǎn)品以及公開(kāi)發(fā)表的生產(chǎn)工藝中，占有主流優(yōu)勢(shì)的是攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)，工藝設(shè)計(jì)是流加或灌注培養(yǎng)。其大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)所面臨的挑戰(zhàn)是獲得最大生產(chǎn)力的同時(shí)注重維持產(chǎn)品的質(zhì)量；去除所有培養(yǎng)環(huán)境中外源因子的污染；更為精確有效的工藝控制手段；規(guī)?；囵B(yǎng)中氧氣的限定與溶解CO2濃度累積的控制等。1996年1月至2002年12月美國(guó)獲得成功批準(zhǔn)的不同的治療劑和診斷劑產(chǎn)品共31種，其中用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的就有21種。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為一個(gè)受到普遍信任的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)，并逐步形成商業(yè)化操作水平。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)集中在細(xì)胞系、細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞生物反應(yīng)容器三個(gè)方面，構(gòu)成生物制品生產(chǎn)的必要條件。其中細(xì)胞是病毒、蛋白的表達(dá)載體，細(xì)胞質(zhì)量直接影響蛋白的表達(dá)量或病毒的滴度，故篩選、馴化優(yōu)質(zhì)細(xì)胞是關(guān)鍵。而只有好的細(xì)胞培養(yǎng)基才可能篩選、馴化出優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞。細(xì)胞生物反應(yīng)容器也在不斷發(fā)展，以轉(zhuǎn)瓶、反應(yīng)器為主要細(xì)胞生產(chǎn)設(shè)備，配合高密度培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)技術(shù)，均需要相適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基以充分發(fā)揮作用,獲得高表達(dá)、高產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。清大天一公司致力于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的開(kāi)發(fā)和服務(wù)，跟隨生物技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)各種生物制品特點(diǎn)不斷開(kāi)發(fā)針對(duì)性培養(yǎng)基新產(chǎn)品，建立多種細(xì)胞體系的疫苗、抗體藥物生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)平臺(tái)，以提高相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)水平和生物制品表達(dá)水平，促進(jìn)生物制藥發(fā)展。l 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)生物制品成本的影響1 表達(dá)量提高通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷改進(jìn)可以充分利用現(xiàn)有設(shè)備，大幅度提高生物制品表達(dá)量，降低生物制品的單位制造成本；同時(shí)，由于產(chǎn)量提高并不新增固定資產(chǎn)投資，也帶來(lái)生物制品的單位固定成本的降低。因此提高表達(dá)量可以有效降低生物制品的單位成本，既降低變動(dòng)成本，也降低固定成本，使得制品利潤(rùn)率提高，市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)能力增強(qiáng)。2 培養(yǎng)液成本降低在很多使用牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液中，為牛血清支付的成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于培養(yǎng)液中的細(xì)胞培養(yǎng)基等其它成分，因此通過(guò)采用低血清細(xì)胞培養(yǎng)基，降低牛血清用量，可以降低細(xì)胞培養(yǎng)液總成本。3 純化成本低，制品安全性提高牛血清的使用量不僅增加了細(xì)胞培養(yǎng)液的成本，更嚴(yán)重的是帶來(lái)動(dòng)物來(lái)源成分、雜蛋白，以及不安全因素，這些成分越多，純化的成本越高、生物制品原液損失越大，生物制品的成本越大。因此采用低血清、無(wú)血清培養(yǎng)細(xì)胞可以有效降低純化成本何損失，提高生物制品成品率和利潤(rùn)率。4 綜合成本降低綜上所述，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生物制品產(chǎn)業(yè)化的核心技術(shù)之一，在生產(chǎn)中，應(yīng)該系統(tǒng)、全面的研究細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)生物制品成本的綜合影響，不斷追求最佳的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，提高生產(chǎn)效率，有效降低生物制品成本，提高利潤(rùn)率，增強(qiáng)產(chǎn)品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。五、細(xì)胞生存條件 1 基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（1） 糖六碳糖主要能源、維持滲透壓，含葡萄糖1-5%。（2） 氨基酸維持生存需12種氨基酸（精、胱、亮、異亮、賴、蛋、苯丙、蘇、色、組、酪、纈）。谷氨酰胺需量最大,缺乏時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)不良。單細(xì)胞培養(yǎng)或細(xì)胞量少時(shí),所需氨基酸的種類和量增多，細(xì)胞主要利用左旋氨基酸異構(gòu)體。（3） 維生素細(xì)胞大部分需水溶性B族維生素，Vitc不可少，1-10mg/100ml可促進(jìn)正常細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖。2 促生長(zhǎng)因子、激素類物質(zhì)3 其它物質(zhì)基本元素、微量元素、促細(xì)胞貼附物質(zhì)(纖粘連蛋白、層粘連蛋白laminin、IV型膠原、氨基多糖類)4 水主要成分和生存環(huán)境,要求高純度水。5 溫度哺乳動(dòng)物及人源細(xì)胞最適培養(yǎng)溫度為3537,對(duì)低溫耐受力比高溫強(qiáng)。39以上受損死亡；不低于0時(shí)（0-34），細(xì)胞能生存，但代謝降低、分裂延緩。6 氣體環(huán)境和pH需O2、CO2，通氧量過(guò)大對(duì)細(xì)胞有毒害。CO2主要與維持pH有關(guān)，細(xì)胞培養(yǎng)最佳pH為7.27.4，通過(guò)緩沖系統(tǒng)和調(diào)節(jié)CO2含量，維持正常pH。開(kāi)放培養(yǎng)要求5%CO2環(huán)境、HEPES(羥乙基哌嗪乙硫磺酸)1050mmol/ml可防止pH變化。含Earles緩沖系統(tǒng)的培養(yǎng)基適合于5CO2的培養(yǎng)條件，Hanks緩沖系統(tǒng)的培養(yǎng)基僅含有0.35g/L NaHCO3，不能用于5CO2的環(huán)境，若放入CO2培養(yǎng)箱，溶液將迅速變酸，使用時(shí)應(yīng)注意。7 濕度和光開(kāi)放培養(yǎng)相對(duì)濕度控制在95%。細(xì)胞培養(yǎng)需避光，紫外線或可見(jiàn)光可造成核黃素、酪氨酸、色氨酸等產(chǎn)生有毒的光產(chǎn)物，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，降低其貼壁能力。8 影響細(xì)胞生長(zhǎng)的其它因素接觸橡膠用品、收集細(xì)胞時(shí)離心速度過(guò)大、細(xì)胞接種濃度過(guò)低等。六、細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求1 營(yíng)養(yǎng)成分氨基酸、單糖、維生素、無(wú)機(jī)離子與微量元素。2 促生長(zhǎng)因子及激素3 滲透壓4 pH5 無(wú)毒、無(wú)污染七、細(xì)胞培養(yǎng)基組成及作用1 氨基酸組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同種類的細(xì)胞對(duì)氨基酸的要求各異，但有幾種氨基酸細(xì)胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，這幾種氨基酸稱為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)不良而死亡。必需氨基酸包括L-谷氨酰胺、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-纈氨酸等。2 維生素維持細(xì)胞生長(zhǎng)的生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞代謝中起調(diào)節(jié)及控制作用。在細(xì)胞培養(yǎng)中，盡管血清是維生素重要來(lái)源， 但是許多培養(yǎng)基中添加了各種維生素以適合更多的細(xì)胞系生長(zhǎng)。l 脂溶性維生素如：A、D、E、K。l 水溶性維生素如：B1、B2、B6、B12、泛酸、葉酸、生物素、C、煙酰胺等。許多維生素參與構(gòu)成各種酶的活性基團(tuán)的成分，沒(méi)有它們，酶便沒(méi)有活性，代謝活動(dòng)將無(wú)法進(jìn)行。VA是細(xì)胞合成糖蛋白時(shí)寡糖基的載體，對(duì)上皮細(xì)胞有重要的維護(hù)作用。VD參與調(diào)節(jié)鈣的吸收。VE是抗氧劑，可防止組成生物膜的磷脂中不飽和脂肪酸被氧化。VK缺乏會(huì)引起低凝血酶原及凝血時(shí)間延長(zhǎng)。葉酸是合成四氫葉酸的重要原料，四氫葉酸在核酸的生物合成和蛋白質(zhì)的生物合成過(guò)程中起重要作用。生物素是一些特異羧化酶的組成部分，參與糖代謝和脂肪酸的合成過(guò)程。3 碳水化合物碳水化合物是細(xì)胞生長(zhǎng)主要能量來(lái)源，其中有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸等。4 無(wú)機(jī)離子鈉、鉀、鎂、鈣、磷等基本的無(wú)機(jī)離子，這些都是細(xì)胞組成所必須并參與細(xì)胞的代謝。培養(yǎng)液中無(wú)機(jī)鹽的主要功能是幫助細(xì)胞維持滲透壓平衡。此外，通過(guò)提供鈉，鉀和鈣離子，幫助細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞膜功能。培養(yǎng)液的滲透壓是一個(gè)非常重要的因素, 細(xì)胞通?？赡褪?60mOsm/kg 320 mOsm/kg。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液的滲透壓在此范圍內(nèi)波動(dòng)。特別注意：向培養(yǎng)液中加入其它物質(zhì)有可能會(huì)明顯改變培養(yǎng)液的滲透壓，特別是溶于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿中的物質(zhì)。Na+是細(xì)胞外液中最主要的陽(yáng)離子，對(duì)維持滲透壓的恒定有決定性的作用。K +主要分布在細(xì)胞內(nèi)液，細(xì)胞內(nèi)K +的對(duì)于激活某些酶是必需的，它在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡也有極重要意義。 Ca2+ 在細(xì)胞外液中的作用是將組織內(nèi)部細(xì)胞之間相互粘著，在細(xì)胞內(nèi)參與許多重要的細(xì)胞生理活動(dòng)，如傳導(dǎo)、參與肌肉細(xì)胞收縮等。 Mg2+ 是構(gòu)成細(xì)胞間質(zhì)的重要成分，對(duì)于細(xì)胞間相互穩(wěn)定結(jié)合有很重要的意義。磷的化合物對(duì)細(xì)胞物質(zhì)代謝和生理功能調(diào)控的功用是十分廣泛而不可缺少。八、細(xì)胞培養(yǎng)基發(fā)展趨勢(shì)1 無(wú)血清培養(yǎng)基是設(shè)計(jì)用來(lái)在無(wú)血清條件下促使特殊類型的細(xì)胞生長(zhǎng)或進(jìn)行專門應(yīng)用的培養(yǎng)基。需要添加生長(zhǎng)因子和/或細(xì)胞因子，含有個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。其主要優(yōu)點(diǎn)：l 增加確定性；l 性能更一致；l 容易進(jìn)行純化和下游加工；l 提高制品安全性和/或產(chǎn)量。2 無(wú)蛋白培養(yǎng)基培養(yǎng)基中沒(méi)有添加蛋白，但仍然可能包含一些動(dòng)物或植物來(lái)源的成分（如低分子量肽的各種水解物）。3 化學(xué)限定培養(yǎng)基培養(yǎng)基中不包含有蛋白、水解產(chǎn)物或未知結(jié)構(gòu)的組分，所有的成分均有已知的化學(xué)結(jié)構(gòu)。九、培養(yǎng)基的品質(zhì)1 外觀顏色、粉末細(xì)度須均勻。2 溶解性培養(yǎng)基完全溶解，可以避免培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分的流失。3 pH值哺乳類動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)需要合適的酸堿度，同時(shí)pH值的測(cè)定也可以檢查培養(yǎng)基的批間差異。 4 水分培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成份很豐富，利于微生物的滋長(zhǎng)，因此水分的含量控制可以延長(zhǎng)有效期。5 冰點(diǎn)滲透壓細(xì)胞必須生活在合適的滲透壓環(huán)境中；同時(shí)滲透壓值的測(cè)定也可以檢查培養(yǎng)基的批間差異。6 菌落總數(shù)粉末培養(yǎng)基不是無(wú)菌制劑，培養(yǎng)基本身的營(yíng)養(yǎng)成分很豐富，容易滋生微生物，因此菌落的控制可以延長(zhǎng)有效期7 細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)可檢查細(xì)胞培養(yǎng)基是否有促生長(zhǎng)的能力，以及是否有不利細(xì)胞生長(zhǎng)的毒素。8 細(xì)菌內(nèi)毒素為滿足生物制品細(xì)菌內(nèi)毒素的控制要求，作為生物制品生產(chǎn)原料的培養(yǎng)基同樣需要細(xì)菌內(nèi)毒素控制。9 穩(wěn)定性確定產(chǎn)品的儲(chǔ)存、運(yùn)輸條件，產(chǎn)品的保質(zhì)期限。10 一致性驗(yàn)證產(chǎn)品的均一性。十、常見(jiàn)問(wèn)題解答1 如何選用培養(yǎng)基？選擇培養(yǎng)基沒(méi)有一定標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考：（1） 建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚單墨I(xiàn)，或在購(gòu)買細(xì)胞株時(shí)咨詢。（2） 本單位慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。（3） 根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來(lái)選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株多選1640；進(jìn)行細(xì)胞雜交、基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，可選擇IMDM。（4） 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，可以用生長(zhǎng)曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。2 選擇便宜的培養(yǎng)基品種成本就低嗎？（1） 通常，培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞，細(xì)胞也可以在不同培養(yǎng)液中生長(zhǎng)；例如在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)。（2） 培養(yǎng)基養(yǎng)份不同會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)效果不同，病毒或蛋白表達(dá)不同，應(yīng)該選擇效果最好的培養(yǎng)基，考慮生物制品的綜合成本；（3） 最終目的是追求生物制品的得率得率高則成本低。3 L谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？L谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的，脫掉氨基后， L谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源，參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。 但L谷氨酰胺在溶液中不穩(wěn)定，在高溫下會(huì)分解成吡咯烷酮和羧酸，也有一些毒降解產(chǎn)物如NH4+會(huì)不可逆轉(zhuǎn)地?fù)p壞細(xì)胞壁。L-谷氨酰胺在不同溫度、不同pH值條件下的穩(wěn)定性研究如下。4 為什么培養(yǎng)基中可以省去酚紅？酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為pH值的指示劑，研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素），為避免固醇類反應(yīng)，用無(wú)酚紅培養(yǎng)基。5 在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，有效期是多長(zhǎng)？ 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_(kāi)始降解。6 為什么不要用碳酸氫鈉調(diào)pH值？如圖所示，培養(yǎng)基pH值隨著碳酸氫鈉量的增加，呈拋物線增長(zhǎng)，當(dāng)碳酸氫鈉加到一定量時(shí)，pH變化越來(lái)越小。而培養(yǎng)基的滲透壓值隨著碳酸氫鈉量的增加，呈直線增長(zhǎng)，碳酸氫鈉量越大，滲透壓值越大。如果為了達(dá)到工作pH值僅加入少量的碳酸氫鈉，而忽略滲透壓，一來(lái)可能會(huì)達(dá)不到緩沖效果而引起細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中pH值變化較劇烈，二來(lái)會(huì)使培養(yǎng)基成為低滲溶液，在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)易造成細(xì)胞膨脹破裂；如果為了達(dá)到工作pH值而加入大量碳酸氫鈉，一來(lái)可能會(huì)難以達(dá)到期望的pH值，二來(lái)會(huì)使培養(yǎng)基成為高滲溶液，在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)易造成細(xì)胞萎縮。生產(chǎn)中最好通過(guò)實(shí)驗(yàn)找到合適滲透壓和pH值情況下的碳酸氫鈉加入量。下面是DMEM(HED)和MEM培養(yǎng)基的碳酸氫鈉與pH值、滲透壓的曲線。（1） DMEM(HED)培養(yǎng)基 （2） MEM培養(yǎng)基 7 細(xì)胞生長(zhǎng)質(zhì)量很好，為什么病毒、蛋白表達(dá)量沒(méi)有提高？細(xì)胞生長(zhǎng)質(zhì)量高是高表達(dá)的必要條件。采用細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗是體外培養(yǎng)一定量的動(dòng)物細(xì)胞并接種病毒，利用病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖，得到預(yù)期的病毒抗原，然后制成疫苗。細(xì)胞生長(zhǎng)質(zhì)量包括細(xì)胞密度和形態(tài)，沒(méi)有好的細(xì)胞生長(zhǎng)質(zhì)量就不可能有高的表達(dá)量。但要注意的是，細(xì)胞生長(zhǎng)質(zhì)量好、密度厚度大時(shí)候病毒接種量也應(yīng)該相應(yīng)增大，表達(dá)量才會(huì)提高，否則前期的高質(zhì)量細(xì)胞培養(yǎng)就可能浪費(fèi)了。同時(shí)病毒、蛋白的表達(dá)、分泌在一定濃度下可能會(huì)飽和，因此如欲獲得高表達(dá)，還須研究合適的收液時(shí)間和次數(shù)。8 污染是培養(yǎng)基質(zhì)量不好引起的嗎？（1） 培養(yǎng)基不是無(wú)菌產(chǎn)品，但有菌落數(shù)量控制。（2） 培養(yǎng)基在使用前通過(guò)高壓或過(guò)濾滅菌。（3） 防止污染應(yīng)該注意以下事項(xiàng)：A. 從污染的源頭開(kāi)始l 確認(rèn)工作細(xì)胞庫(kù)是否被污染：用細(xì)菌、真菌及支原體無(wú)菌試驗(yàn)來(lái)確認(rèn)并排除。同時(shí)要對(duì)無(wú)菌試驗(yàn)培養(yǎng)基的靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證。l 確認(rèn)毒種工作種子批是否被污染：用細(xì)菌、真菌及支原體無(wú)菌試驗(yàn)來(lái)確認(rèn)并排除。同時(shí)要對(duì)無(wú)菌試驗(yàn)培養(yǎng)基的靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證。l 確認(rèn)所用培養(yǎng)基及其添加成分（如小牛血清、NaHCO3等）是否被污染：用細(xì)菌、真菌及支原體無(wú)菌試驗(yàn)來(lái)確認(rèn)并排除。同時(shí)要對(duì)無(wú)菌試驗(yàn)培養(yǎng)基的靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)際生產(chǎn)中，可以從配制好的培養(yǎng)液中取少量加入營(yíng)養(yǎng)瓊脂于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48小時(shí)即可觀察有無(wú)污染。一些單位在使用血清時(shí)候往往不經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌處理便直接加入到培養(yǎng)液中，可能帶來(lái)污染。l 其它：高壓滅菌設(shè)備、過(guò)濾除菌設(shè)備均應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證，確保滅菌和除菌效果；前者應(yīng)在投產(chǎn)前及其后的每6個(gè)月進(jìn)行驗(yàn)證，后者應(yīng)在每次除菌前、后進(jìn)行驗(yàn)證工作（至少應(yīng)在除菌后進(jìn)行一次）。l 另外，應(yīng)將有毒區(qū)與無(wú)毒區(qū)嚴(yán)格分開(kāi)，并有各自獨(dú)立的空氣凈化系統(tǒng)及孵室，有毒區(qū)對(duì)無(wú)毒區(qū)應(yīng)保持相對(duì)負(fù)壓，防止病毒對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞（尤其是細(xì)胞庫(kù)）的污染。B. 從GMP管理、SOP操作方面加強(qiáng)管理力度l 每二周（或每周）對(duì)無(wú)菌操作室及潔凈區(qū)域按GMP要求進(jìn)行檢測(cè)l 人員的GMP管理和無(wú)菌操作強(qiáng)化培訓(xùn) C. 一些特殊情況l 細(xì)菌的大小從0.1-700m，為防止細(xì)小細(xì)菌的污染，過(guò)濾除菌應(yīng)盡量采用0.1m的濾膜或?yàn)V芯。l 大面積污染時(shí)，應(yīng)對(duì)所有設(shè)施、用具及操作環(huán)境進(jìn)行徹底消毒。 9 如何消除組織培養(yǎng)的污染？當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí)，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開(kāi)，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái)，檢查HEPA過(guò)濾器。高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂(lè)菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。（1） 在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。（2） 分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0，8.0 mg/ml。（3） 每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。（4） 確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度23倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞23代。（5） 在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。（6） 重復(fù)步驟4。（7） 在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)46代，確定污染是否已被消除。十一、培養(yǎng)基培養(yǎng)基產(chǎn)品分為細(xì)胞培養(yǎng)基、平衡鹽、細(xì)菌培養(yǎng)基產(chǎn)品。（一） 平衡鹽（balanced salt solution，BSS）1885年Sydney Ringer開(kāi)發(fā)生理鹽水發(fā)展而來(lái)，由無(wú)機(jī)鹽、葡萄糖和水組成。平衡鹽通常以其發(fā)明者命名，基本平衡鹽溶液都是基于細(xì)胞需要鈉、鉀、鈣、鎂和磷酸鹽這5種離子開(kāi)發(fā)而來(lái)，只是在離子濃度和鹽的形式上有所區(qū)別。平衡鹽的主要功能是維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡、控制和維持酸堿平衡在生理范圍之內(nèi)、提供能量和代謝所需的無(wú)機(jī)離子。平衡鹽培養(yǎng)基可用于配制培養(yǎng)用液基礎(chǔ)液及細(xì)胞洗滌液。常用的平衡鹽有：1 Dulbecco,s平衡鹽（D-PBS），不含碳酸氫鈉；2 Hanks,平衡鹽（HBSS），含碳酸氫鈉少，約0.35mg/L；3 Earle,s平衡鹽（EBSS），含碳酸氫鈉多，約2.2mg/L；4 PBS平衡鹽，無(wú)Ca2+、Mg2+離子。（二） 細(xì)胞培養(yǎng)基1 傳統(tǒng)基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基及其改良培養(yǎng)基基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基通常指基礎(chǔ)合成培養(yǎng)基，主要成分為氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽、輔助物質(zhì)（核酸降解物、氧化還原劑等）。據(jù)不同細(xì)胞和研究目的，選用合適培養(yǎng)基,還可補(bǔ)加新成分。如雜交瘤中常用DMEM加丙酮酸鈉、2-巰基乙醇（相當(dāng)于胎牛血清可透析組分的作用）。合成培養(yǎng)基使用時(shí)加5-30%血清。（1） 199細(xì)胞培養(yǎng)基及其改良品種1950年由Morgan等設(shè)計(jì)，除BSS外，含有53種成分，添加適量的血清后，可廣泛用于多種細(xì)胞培養(yǎng)、病毒學(xué)、疫苗生產(chǎn)等。199（HB）細(xì)胞培養(yǎng)基，主要應(yīng)用于Vero細(xì)胞、地鼠腎細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)狂犬、乙腦等疫苗，具有高緩沖性能，能夠有效提高病毒滴度。l 改良199細(xì)胞培養(yǎng)基199（HB）細(xì)胞培養(yǎng)基狂犬疫苗生產(chǎn)實(shí)踐證明，199（HB）細(xì)胞培養(yǎng)基與傳統(tǒng)199細(xì)胞培養(yǎng)基相比，具有以下優(yōu)勢(shì)。a) 細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)好用199（HB）細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)速度相對(duì)較快，形態(tài)良好。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間199（HB）細(xì)胞培養(yǎng)基199培養(yǎng)基24小時(shí)瓶壁鋪滿85，良好，狀態(tài)飽滿瓶壁鋪滿85，良好，狀態(tài)飽滿48小時(shí)瓶壁鋪滿98以上，細(xì)胞連接緊密，狀態(tài)飽滿瓶壁鋪滿95以上，形態(tài)良好，但細(xì)胞間尚有空隙。72小時(shí)細(xì)胞鋪滿整個(gè)瓶壁，因有輕微擠壓變形成長(zhǎng)條形，排列整齊，細(xì)胞間界線清晰。細(xì)胞鋪滿整個(gè)瓶壁，有擠壓變形狀態(tài)。但排列不夠整齊，細(xì)胞間界線不是很清晰。b) 營(yíng)養(yǎng)液的pH較穩(wěn)定用199（HB）細(xì)胞培養(yǎng)基配制病毒維持液pH值較穩(wěn)定，經(jīng)過(guò)34天的細(xì)胞培養(yǎng)后pH值變化小。c) 病毒原液滴度高用199（HB）細(xì)胞培養(yǎng)基收獲的病毒原液相對(duì)用199培養(yǎng)基收獲的病毒原液平均滴度要高，尤其對(duì)二次苗的影響。199（HB）培養(yǎng)基199培養(yǎng)基一次苗滴度二次苗滴度一次苗滴度二次苗滴度6.86 6.43 6.63 5.83 注：一次苗、二次苗分別為第一次和第二次收毒。d) 純化后原液的效力明顯提高用199（HB）細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)后，對(duì)純化后原液的效力影響比較明顯，對(duì)效力有明顯提高。培養(yǎng)基199（HB）培養(yǎng)基199培養(yǎng)基平均效力4.243.49（2） BME細(xì)胞培養(yǎng)基基礎(chǔ)Eagle培養(yǎng)基（Basal Medium Eagle），1955年由Eagle設(shè)計(jì)，BSS12種氨基酸谷氨酰胺8種維生素。簡(jiǎn)單、便于添加，適于各種傳代細(xì)胞系和特殊研究用，在此基礎(chǔ)上改良的細(xì)胞培養(yǎng)基品種有MEM、DMEM、IMDM等。（3） MEM細(xì)胞培養(yǎng)基低限量Eagle培養(yǎng)基（Minimal Essential Medium），1959年修改配方，刪去賴氨酸、生物素，增加氨基酸濃度，適合多種細(xì)胞單層生長(zhǎng)，是一種最基本、適用范圍最廣的培養(yǎng)基，是一種被廣泛應(yīng)用的培養(yǎng)基。需要注意的是，MEM細(xì)胞培養(yǎng)基有含Earles平衡鹽的類型，也有含Hanks平衡鹽的類型；有高壓滅菌型的，也有過(guò)濾除菌型的；還有含非必需氨基酸的類型。生產(chǎn)和科研時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況注意選擇合適的MEM細(xì)胞培養(yǎng)基。另外，因MEM培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分所限，針對(duì)生產(chǎn)之特定細(xì)胞培養(yǎng)與表達(dá)時(shí)，并不一定是使用效果最佳或者最經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)基。（4） DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基及其改良品種DMEM由Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基，各成份量加倍，分低糖（1000mg/L）、高糖（4500mg/L）。細(xì)胞生長(zhǎng)快。附著稍差的腫瘤細(xì)胞、克隆培養(yǎng)用高糖效果較好，常用于雜交瘤的骨髓瘤細(xì)胞和DNA轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)。例如CHO細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)乙肝疫苗、CHO細(xì)胞表達(dá)EPO。l 改良DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM（HED）細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM（HED）細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)CHO細(xì)胞生產(chǎn)乙肝疫苗，具有較強(qiáng)細(xì)胞維持能力，可增加收液次數(shù)，有效提高蛋白表達(dá)率。生產(chǎn)和試驗(yàn)研究證明，DMEM（HED）細(xì)胞培養(yǎng)基在細(xì)胞生長(zhǎng)和病毒分泌方面均優(yōu)于使用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基。 應(yīng)用國(guó)產(chǎn)改良型DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO-C28細(xì)胞，中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2003 Vol.16 No.6 P.380-382a) 使用DMEM（HED）細(xì)胞培養(yǎng)基細(xì)胞貼壁和長(zhǎng)滿單層時(shí)間明顯快于傳統(tǒng)DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，維持2個(gè)月細(xì)胞未出現(xiàn)脫落現(xiàn)象。使用DMEM（HED）細(xì)胞培養(yǎng)基，在接種后第2天， 80細(xì)胞已伸展并開(kāi)始分裂增殖，第3天已長(zhǎng)成較密單層，細(xì)胞貼壁均勻，形態(tài)清晰，呈多邊形和梭形，細(xì)胞間略有空隙，細(xì)胞數(shù)為7.5 x 106個(gè)ml。在此后轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的60 d內(nèi)細(xì)胞數(shù)保持穩(wěn)定，無(wú)明顯增加和減少，無(wú)脫落，無(wú)明顯形態(tài)變化，培養(yǎng)液中HBsAg滴度穩(wěn)定在1：1281：512之間。而使用傳統(tǒng)DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，只有30和40的細(xì)胞伸展，至第4天才長(zhǎng)成較密單層，小方瓶與雙層轉(zhuǎn)瓶結(jié)果相同。至30 d 時(shí)已長(zhǎng)成較厚的復(fù)層，并開(kāi)始大片脫落，細(xì)胞數(shù)明顯減少，HBsAg滴度降低，最低降到1：32 。此后細(xì)胞開(kāi)始重新貼壁、增殖，至45 d左右部分細(xì)胞長(zhǎng)成單層，一部分細(xì)胞因脫落，至60 d時(shí)仍未能長(zhǎng)滿轉(zhuǎn)瓶。b) 分泌HBsAg量明顯高于傳統(tǒng)DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基組。培養(yǎng)基DMEM（HED）細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基30次收液中平均HBsAg含量3.75g/ml3.51g/ml（5） IMDM細(xì)胞培養(yǎng)基IMDM是由Iscoves改良的Eagle培養(yǎng)基，增加了幾種氨基酸和胱氨酸量?？捎糜陔s交瘤細(xì)胞培養(yǎng)，以及無(wú)血清培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。（6） RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基Moore等人于1967年在Roswell Park Memorial Institute研制，針對(duì)淋巴細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)，BSS21種氨基酸維生素11種等，廣泛適于許多種正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，也用做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。（7） Fischers細(xì)胞培養(yǎng)基用于白血病微粒細(xì)胞培養(yǎng)。（8） HamF10、F12細(xì)胞培養(yǎng)基1963年、1969年由Ham設(shè)計(jì)，含微量元素，可在血清含量低時(shí)用，適用于克隆化培養(yǎng)。F10適用于倉(cāng)鼠、人二倍體細(xì)胞，F(xiàn)12適用于CHO細(xì)胞。（9） DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM和F12細(xì)胞培養(yǎng)基按照1:1比例混合效果最佳，營(yíng)養(yǎng)成分豐富，且可以使用較少血清，或作為無(wú)血清培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。2 低血清細(xì)胞培養(yǎng)基血清對(duì)于在傳統(tǒng)培養(yǎng)基配方中生長(zhǎng)和增殖的大多數(shù)細(xì)胞系來(lái)說(shuō)是必不可少的。大部分的組織培養(yǎng)研究者非常熟悉血清添加物給予基本培養(yǎng)基配方的良好生長(zhǎng)支持特征。然而，伴隨血清的使用也帶來(lái)了很多的問(wèn)題。l 費(fèi)用因素生產(chǎn)血清費(fèi)用高而效率低。小牛血清還必須來(lái)源于沒(méi)有瘋牛病、口蹄疫和其它高度傳染性疾病的地區(qū)