三點(diǎn)測(cè)交、伴性遺傳、雙因子雜交綜合大實(shí)驗(yàn).doc

山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告 2013年 05 月 08 日姓 名 班 級(jí) 同組人 科 目 遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn) 題 目 雙因子雜交、伴性遺傳和三點(diǎn)測(cè)交 組 別 第五組 一、研究背景 果蠅（Drossphila）是遺傳學(xué)試驗(yàn)中最常用的多年生物之一。屬昆蟲(chóng)綱，雙翅目，果蠅科，果蠅屬。果蠅的染色體數(shù)目少（僅四對(duì)，2n=8），具有許多自然的或誘發(fā)的可遺傳突變性狀，世代周期短（25下1012天一代，個(gè)體小易于飼養(yǎng)，培養(yǎng)費(fèi)用低廉，繁殖能力強(qiáng)，后代數(shù)目繁多，故被作為遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)的典型模式生物。后續(xù)實(shí)驗(yàn)要作果蠅的雜交實(shí)驗(yàn)，需要大量的果蠅，本次實(shí)驗(yàn)可以學(xué)會(huì)識(shí)別果蠅的各種形狀、區(qū)分果蠅的性別以及基本的飼養(yǎng)方法，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。 黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)，果蠅科(Drosophilidae)果蠅屬(Drosophila)昆蟲(chóng)。因其生活史短（在25左右溫度下十天左右繁殖一代），繁殖力強(qiáng)（雌性可一次產(chǎn)下400個(gè)0.5毫米大小的卵），相對(duì)性狀明顯且可遺傳，易于培養(yǎng)，培養(yǎng)成本低（酵母和細(xì)菌，腐爛水果），符合上述遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)研究要求，同時(shí)因其染色體僅4對(duì)，基因組僅約165Mb，并且基因組超過(guò)60%的片段同人類(lèi)疾病基因相似。故已將其作為一種常見(jiàn)的模式生物(model organism）大量使用在遺傳學(xué)(genetics)和發(fā)育生物學(xué)(developmental biology)的研究。2、 研究目的1、通過(guò)對(duì)果蠅的雜交實(shí)驗(yàn)，正確理解分離定律的實(shí)質(zhì)，并驗(yàn)證與加深理解三個(gè)的遺傳規(guī)律。2、認(rèn)識(shí)伴性遺傳的正、反交差別，掌握伴性遺傳的特點(diǎn)。3、掌握繪制遺傳學(xué)圖的原理和方法，加深對(duì)重組值、遺傳學(xué)圖、雙交換、并發(fā)率和干涉等概念的理解。4、掌握果蠅的雜交技術(shù)，并學(xué)會(huì)記錄交配結(jié)果和掌握統(tǒng)計(jì)處理的方法。5、嘗試設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證缺刻翅的遺傳型三、實(shí)驗(yàn)原理 本次設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)就是利用果蠅進(jìn)行一系列的遺傳學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和染色體基因相對(duì)順序和距離的測(cè)定，下面簡(jiǎn)要介紹關(guān)于雙因子雜交、伴性遺傳和三點(diǎn)測(cè)交的基本原理。1、雙因子雜交（dual factors hybridize）：果蠅的灰體基因（E）與黑檀體基因（e）為一對(duì)相對(duì)性狀，位于R70.7位置，而長(zhǎng)翅（Vg）與殘翅（vg）為另一對(duì)相對(duì)性狀，位于R67.0位置。這兩對(duì)基因是沒(méi)有連鎖關(guān)系的，位于不同染色體上的非等位基因。 因此非同源染色體的這兩對(duì)非等位基因可以很好的驗(yàn)證自由組合定律。自由組合規(guī)律：位于非同源染色體上的兩對(duì)非等位基因，其雜合體在形成配子時(shí)，等位基因彼此分離，非等位基因可自由組合進(jìn)入同一配子，結(jié)果產(chǎn)生4種比例相等的配子。若顯性完全，F(xiàn)1自交產(chǎn)生F2代表現(xiàn)出4種表型，比例為9：3：3：1。雙因子雜交的遺傳規(guī)律： 雙因子雜交正交 雙因子雜交反交 18 14 14 18灰長(zhǎng) 黑殘灰長(zhǎng) 黑殘F(tuán)1 灰長(zhǎng) F2: 灰長(zhǎng)：灰殘：黑長(zhǎng)：黑殘=9：3：3：1F1 灰長(zhǎng) F2: 灰長(zhǎng)：灰殘：黑長(zhǎng)：黑殘=9：3：3：1 2、伴性遺傳（sex-linked inheritance）：位于性染色體上的基因叫作伴性基因，其遺傳方式與位于常染色體上的基因有一定差別，它在親代與子代之間的傳遞方式與雌雄性別有關(guān)，伴性基因的這種遺傳方式稱(chēng)為伴性遺傳。果蠅的紅眼與白眼是一對(duì)相對(duì)性狀，由單基因控制，位于X染色體上，基因之間的關(guān)系為紅眼對(duì)白眼完全顯性。當(dāng)紅眼果蠅（）和白眼果蠅（）雜交，F(xiàn)1代中的果蠅均為紅眼，F(xiàn)2代中紅眼果蠅白眼果蠅=31，但在雌果蠅中全為紅眼，在雄果蠅中紅眼果蠅白眼果蠅=11。當(dāng)反交時(shí)，F(xiàn)1代中的雌果蠅為紅眼，雄果蠅卻為白眼。F2代中紅眼果蠅白眼果蠅=11，在雌果蠅或雄果蠅中紅眼果蠅與白眼果蠅的比例均為11。 伴性遺傳的遺傳規(guī)律： 伴性遺傳正交 伴性遺傳反交 XwXw 白眼 紅眼 X+YX+X+ 紅眼 白眼 XwY 18 w w 18 F1: X+ Xw Xw Y 紅眼 白眼F1: X+ Xw X+ Y 紅眼 紅眼 F2: X+Xw Xw Xw X+ Y Xw Y 紅眼 白眼 紅眼 白眼 1 ： 1 ： 1 ： 1F2: X+ X+ X+Xw X+ Y Xw Y 紅眼 紅眼 紅眼 白眼 1 ： 1 ： 1 ： 13、三點(diǎn)測(cè)交位于同一條染色體上的基因是連鎖的，而同源染色體上的基因之間會(huì)發(fā)生一定頻率的交換，使子代中出現(xiàn)一定數(shù)量的重組型。重組型出現(xiàn)的多少反映出基因間發(fā)生交換的頻率的高低。而根據(jù)基因在染色體上直線排列的原理，基因交換頻率的高低與基因間的距離有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系?；驁D距就是通過(guò)基因間重組值的測(cè)定而得到的。如果基因座位相距很近，重組率與交換率的值相等，直接將重組值作為基因圖距；如果基因間相距較遠(yuǎn)，兩個(gè)基因間往往發(fā)生兩次以上的交換，必須進(jìn)行校正，來(lái)求出基因圖距。三點(diǎn)測(cè)交：用野生型純合體與三隱性個(gè)體雜交，獲得三因子雜種（F1），再使F1與三隱性基因純合體測(cè)交，通過(guò)對(duì)測(cè)交后（Ft）代表現(xiàn)型及其數(shù)目的分析，分別計(jì)算三個(gè)連鎖基因之間的交換值，從而確定這三個(gè)基因在同一染色體上的順序和距離。通過(guò)一次三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)可以同時(shí)確定三個(gè)連鎖基因的位置，即相當(dāng)于進(jìn)行三次兩點(diǎn)測(cè)驗(yàn)，而且能在試驗(yàn)中檢測(cè)到所發(fā)生的雙交換。如果兩個(gè)基因間的單交換并不影響鄰近兩個(gè)基因的單交換，那么預(yù)期的雙交換頻率應(yīng)當(dāng)?shù)扔趦蓚€(gè)單交換頻率的乘積，但實(shí)際上觀察到的雙交換值往往低于預(yù)期值，因?yàn)槊恳淮伟l(fā)生單交換，它鄰近也發(fā)生一次交換的機(jī)會(huì)就減少，這叫干涉。一般用并發(fā)率表示干涉的大小。 三點(diǎn)測(cè)交（一次雜交，一次測(cè)交） 6號(hào)（wsnm/wsnm） 18號(hào)(+/Y) 白卷小 紅直長(zhǎng) F1: (+/wsnm) (wsnm/Y) 紅直長(zhǎng) 白卷小 統(tǒng)計(jì)F2代各類(lèi)型及數(shù)目填入統(tǒng)計(jì)表4、 缺刻翅驗(yàn)證 書(shū)上所說(shuō)，缺刻翅具有雄性致死的特征但是作為實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存的缺刻翅品種而言，在缺刻翅培養(yǎng)基內(nèi)不存在野生型，那么雄性也應(yīng)為缺刻翅。與書(shū)上的結(jié)論矛盾，因此缺刻翅的遺傳需進(jìn)一步驗(yàn)證采用缺刻雌與18號(hào)雄雜交，統(tǒng)計(jì)其F1代表型特征四、實(shí)驗(yàn)器材1、材料： 18號(hào)果蠅（野生型）及三種突變體果蠅即14號(hào)果蠅（黒身殘翅）、w號(hào)果蠅（白眼）和6號(hào)果蠅（白眼卷剛毛小翅）、缺刻翅果蠅2、試劑：乙醇、乙醚、果蠅培養(yǎng)基等3、器具：麻醉瓶、酒精燈、白瓷板、毛筆、鑷子、培養(yǎng)管、棉球等五、實(shí)驗(yàn)步驟第一周（4月1日 周一）：雙因子正交18 14姓名:日期: 1.準(zhǔn)備工作： 將麻醉瓶和器具（白瓷板、毛筆等）進(jìn)行消毒滅菌，放涼。領(lǐng)取培養(yǎng)管6支，填寫(xiě)標(biāo)簽并貼在培養(yǎng)管上。 標(biāo)簽寫(xiě)法舉例如右：選處女蠅: 共有4種果蠅品系，安排6個(gè)大桌分別負(fù)責(zé) 18號(hào)、14號(hào)、W號(hào)、6號(hào)果蠅的麻醉和雌雄分選2.雜交組合設(shè)計(jì):雙因子正交：18 14雙因子反交: 14 18 伴性正交: 18 W伴性反交: W 186個(gè)雜交三點(diǎn)測(cè)交：6 18三點(diǎn)測(cè)交：6 183、培養(yǎng)：按照設(shè)計(jì)的組合將處女蠅和雄蠅分裝在各個(gè)培養(yǎng)管中，每管中35對(duì)即可。用毛筆輕掃進(jìn)培養(yǎng)管的管壁上，塞上棉塞后平放桌上。待管中果蠅都蘇醒并活動(dòng)自如以后，再將培養(yǎng)管豎著放進(jìn)培養(yǎng)盒里。放25培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。第二周（4月7日 周日）：4、倒掉親本果蠅并處死第三周（4月15日 周五）：5、觀察F1代是否符合應(yīng)該的表型，選擇生活狀態(tài)良好的F1互交，35對(duì)即可，放入新的培養(yǎng)管中置25培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。第四周（4月22日 周五）6、清除培養(yǎng)瓶中所有的F1親本第五周（4月29日 周五 以及4月31日 周日）：7、觀察F2，統(tǒng)計(jì)F2，處理數(shù)據(jù)。（統(tǒng)計(jì)過(guò)的果蠅放入酒精瓶中，殺死）六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表1 雙因子雜交的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)雙因子正交（1814）雙因子反交（1418）組別灰 長(zhǎng)灰 殘黑 長(zhǎng)黑 殘灰 長(zhǎng)灰 殘黑 長(zhǎng)黑 殘本組4261215031第一組186934060第二組1052122440第四組3215104225123第五組168343000第六組31101123213123第七組17722無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)全體1665749178822377表2 伴性遺傳的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)伴性遺傳正交（18W）伴性遺傳反交（W18）組別白 紅 白 紅 白 紅 白 紅 本組360138745第一組81203612121414第二組1312018無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)第四組252205121131318第五組02002114252321第六組3120197787第七組59085625全體5793016667706470表3 三點(diǎn)測(cè)交的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)三點(diǎn)測(cè)交（618）組別紅直長(zhǎng)+白卷小wsnm紅直小+m白卷長(zhǎng)wsn+紅卷小+snm白直長(zhǎng)w+白直小w+m紅卷長(zhǎng)+sn+本組188201210第一組185300300第二組174901230第四組222121310第五組1321133500第六組3112132710第七組2113540101全體14046321282361表4 缺刻翅驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)本組缺刻翅18缺刻18缺刻18F14402對(duì)F1自交F28142118二組缺刻翅18，F(xiàn)1代四種表型都有F1中缺刻18F281066F1中1818F2無(wú)19無(wú)17注：本組為第三組：柏捷銘&吳曉璇 第一組：自振濤&劉雅真 第二組：李鈺茜&徐霖 第四組：吳顯偉&劉馨德 第五組：吳宏宇&石文昊 第六組：張振宇&楊金才 第七組：殷軍&翟貞文由于某些小組未長(zhǎng)出F2代，因而數(shù)據(jù)為無(wú)。7、 數(shù)據(jù)分析由于單個(gè)小組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有限（我們組為第三組），在統(tǒng)計(jì)上需要大量的數(shù)據(jù)作為基礎(chǔ)，因此實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析過(guò)程中的觀察值和預(yù)期值都是基于全班實(shí)驗(yàn)結(jié)果的總計(jì)數(shù)據(jù)。對(duì)單個(gè)小組進(jìn)行數(shù)據(jù)分析意義不大。1、雙因子雜交的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析（1）預(yù)期F2的表型與比例： 灰長(zhǎng)：灰殘：黑長(zhǎng)：黑殘=9：3：3：1（2）正交的子二代的數(shù)量明顯比反交的子二代的數(shù)量多這與求偶行為有一定的關(guān)系。（3）將F2中相同表型的個(gè)體疊加起來(lái)，作為這種表型的觀察值，進(jìn)行2測(cè)驗(yàn)。表4 雙因子雜交的2測(cè)驗(yàn)灰長(zhǎng)灰殘黑長(zhǎng)黑殘總計(jì)觀察值（O）254798624443預(yù)期值（E）249838328443偏差O-E5-43-4（O-E）2/E0.100.190.110.572=0.97df=4-1=3；=0.05；2=7.81結(jié)論：22；實(shí)驗(yàn)值與預(yù)期值有顯著性差異，不符合紅：白=3:1的分離比（2）伴性遺傳反交：df=4-1=3；=0.05；2=7.81因而反22；觀察值和預(yù)期值之間的差異不顯著，實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合反交1：1：1：1的分離比3、三點(diǎn)測(cè)交的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析：表6 三點(diǎn)實(shí)驗(yàn)F2果蠅的性狀查看與統(tǒng)計(jì)表型實(shí)得數(shù)比例重組發(fā)生在wsnsnmwm+ + +14069.4%w sn m46+ + m3216.4%w sn +12+ sn m811.6%w + +23w + m62.6%+ sn +1合計(jì)268100%14.2%19.0%28.0%兩端的基因間距離進(jìn)行校正：28.0%+22.6%=33.2%據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果算出的三個(gè)基因的相對(duì)順序和距離19.014.2 w sn m33.2 圖1 w-sn-m三個(gè)基因的遺傳學(xué)圖單交換率分別為14.2%和19.0%；雙交換率為2.6%并發(fā)率=2.6%(14.2%19.0%)=0.96，干擾=1-0.96=-0.04；說(shuō)明一次交換后會(huì)干擾它的臨近再發(fā)生一次交換。因此w-sn-m三個(gè)基因之間存在著正干擾。與理論基本相符。4、缺刻翅驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析本組缺刻翅18缺刻18缺刻18F14402對(duì)F1自交F28142118二組缺刻翅18，F(xiàn)1代除缺刻雄都有F1中缺刻（雜合）18F281066F1中1818F2無(wú)19無(wú)17綜合兩組實(shí)驗(yàn)的F1代分析，都未見(jiàn)到缺刻雄性，貌似如同書(shū)上猜測(cè)具有雄性致死的特點(diǎn)從本組的F2代進(jìn)行分析又見(jiàn)到了缺刻雄，因而書(shū)上的說(shuō)法存在疑問(wèn)。從F1代數(shù)據(jù)分析，否定了常染色體顯隱性，X染色體顯隱性的可能。而從二組的F1中1818自交而言更加印證缺刻基因非隱性基因。綜上所述：判斷缺刻翅不是普通的遺傳類(lèi)型。顯然缺刻雄確有一定的雄性缺失性，但是在嘗試通過(guò)多種致死模型來(lái)驗(yàn)證時(shí)，發(fā)現(xiàn)都不符合規(guī)律。且缺刻翅雄蠅消失的情況僅出現(xiàn)在F1代，甚至有可能是缺刻雄蠅生存率低，且出的慢造成的，可能在篩選F1時(shí)，缺刻雄仍然為幼蟲(chóng)。另一種可能為果蠅具有某些選擇性（如同人類(lèi)的計(jì)劃生育），在基數(shù)小的情況下，選擇性表達(dá)出具有快速繁殖能力的18野生雄果蠅（后代數(shù)量由雌性保證，因而繁衍后代的質(zhì)量由雄性來(lái)表現(xiàn)，因?yàn)樾坌越慌?，成本極低），當(dāng)培養(yǎng)基中果蠅數(shù)量較多密度較大，選擇占空間小，所需營(yíng)養(yǎng)少，且繁衍周期長(zhǎng)（猜測(cè)）的缺刻翅型。因而后代才出現(xiàn)缺刻雄性八、思考與討論1、在雙因子雜交實(shí)驗(yàn)中，觀察到反交的F2代數(shù)量明顯比正交的F2代少，而且在F2代計(jì)數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)反交的后代出來(lái)的慢，因而猜測(cè)反交的后代出生率低并且生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，還有可能是14的生殖過(guò)程較長(zhǎng)，或者由于求偶行為造成的2、對(duì)于紅白眼伴性遺傳正交的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在的顯著性差異，差異主要存在于白眼數(shù)量較少導(dǎo)致的顯著性差異。班中有一組同學(xué)做了白眼紅眼存活率的實(shí)驗(yàn)（其他組因?yàn)榉N種原因無(wú)幼蟲(chóng)出現(xiàn)），將紅眼白眼自交，同樣的雌雄個(gè)數(shù)，同樣的天數(shù)進(jìn)行培養(yǎng)，其結(jié)果為紅眼F1代38只，白眼F1代27只，樣本量不多，但具有一定傾向表明：白眼存活率比紅眼存活率低。從生物進(jìn)化上客觀上講，野生型紅眼果蠅本應(yīng)具有較高的存活率，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。另一種可能為白眼從蛹中孵化較慢，每個(gè)組都減少了一些于是導(dǎo)致整體白眼數(shù)量偏低。3、若在伴性遺傳的正交的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中出現(xiàn)一只白眼雌果蠅，這個(gè)例外個(gè)體產(chǎn)生，是由于在減數(shù)分裂的過(guò)程中兩條姐妹染色單體不分離造成的，F(xiàn)2中出現(xiàn)了不應(yīng)該出現(xiàn)的性白眼，但這種情況極為罕見(jiàn)，約幾千個(gè)體中有一個(gè)。不分離現(xiàn)象解釋如下圖所示：F1 X+Xw X+YX+配子 X+ X+ Xw Xw 0 X+ Y F2