生物大分子的分離純化和鑒定.pptVIP

生物大分子分離純化和鑒定 生物大分子通常是指在生物體內存在的或生物體代謝產生的具有特殊生物學功能的高分子化和物 主要包括蛋白質 酶 核酸 多糖和脂類 生物材料的選擇與處理一 選擇生物材料原則 有效成分含量高 穩(wěn)定 來源豐富 保持新鮮 提取工藝簡單 成本低 如 用酵母提RNA 用牛奶提酪蛋白 用大蒜提SOD 超氧化物歧化酶 二 生物材料處理 1 動物臟器 冰凍 10 冰庫 短期保存 70 低溫冰箱 數(shù)月 干燥 可長期保存 2 植物組織 10小時內置 4 30 冰箱儲藏備用3 微生物 胞外產物 如發(fā)酵液 低溫短時儲藏 胞內產物 則應收集菌體或細胞 制成凍干粉于4 保存 數(shù)月不變質 除了體液和微生物胞外的某些蛋白質和多肽以外 大多數(shù)生物大分子都存在于細胞之內 細胞破碎1 酶學破碎法 外加酶制劑 自溶法 2 機械破碎法 高速搗碎法 高速均漿法 高速磨珠法3 物理破碎法 溫差法 壓差法 超聲波4 化學破碎法 有機溶劑法 表面活性劑 SDS等 金屬螯合劑 Mg2 Ca2 EDTA 化學變性劑 蛋白質的分離純化 依據(jù)蛋白質在溶液中的性質不同 溶解度 電荷 相對分子質量的大小 特異親和力等 確立的蛋白質和酶的分離方法 其性質包括 1 利用溶解度差別的分離方法1 等電點沉淀 蛋白質在等電點時溶解度最小 當?shù)鞍踪|混合液的PH值被調到其中某一種成分的PI時 該種成分蛋白質將會沉淀下來 這種沉淀出來的蛋白質保持著天然構象 活性 能再溶解 高于或低于該PI的蛋白質留在溶液 如 Glu的生產也是利用此性質進行的 GluPI3 22 2 鹽析高濃度的鹽 常用硫酸銨 可以降低蛋白質的溶解度 因為高濃度鹽爭奪了蛋白質分子的水膜層 降低了環(huán)境中水的相對濃度 還中和了蛋白質表面的電荷 不同蛋白質因所帶電荷和水化程度不同而在不同的鹽濃度下分別沉淀出來 鹽的飽和度由低到高逐次增加 如血清中加入50 飽和度的 NH4 2SO4可使球蛋白析出 加入100 飽和度 NH4 2SO4可使清蛋白析出 達到分級分離的目的 鹽析后必須脫鹽 脫鹽最常見的方法是透析法 也可以用凝膠層析 葡聚糖凝膠SephadexG25脫鹽 超過濾技術脫鹽 鹽析通常與等電點沉淀法相結合使用 脫鹽是否徹底 要經常進行檢查 如除去 NH4 2SO4可用10 BaCl2檢查 除去NaCl可用10 AgNO3檢查 直到透析液中檢測不出BaSO4或AgCl為止 透析完成 3 有機溶劑分級法有機溶劑引起蛋白質沉淀的主要原因之一是改變介質的介電常數(shù) 水是高介電常數(shù) 20 時 80 有機溶劑是低介電常數(shù)物質 20 時 甲醇33 乙醇24 丙酮21 4 因此有機溶劑的加入使水溶液的介電常數(shù)降低 這樣 蛋白質分子表面的可解離基團的離子化程度減弱 水化程度降低 因此促進了蛋白質分子的聚集和沉淀 有機溶劑引起蛋白質沉淀的另一重要方式可能與鹽析相似 與蛋白質爭奪水化 膜 水 致使蛋白質聚集體的形成并沉淀 有機溶劑沉淀法一般與等電點沉淀法聯(lián)合使用 即操作時溶液的pH值應控制在欲分離蛋白質的等電點附近 二 根據(jù)分子大小不同的分離方法 1 透析和超過濾 即利用蛋白質分子不能通過半透膜的性質 使蛋白質和其他小分子物質 如無機鹽 單糖 水 等分開 2 密度梯度 區(qū)帶 離心 蛋白質顆粒在具有密度梯度介質中離心時 每種蛋白質顆粒降到與自身密度相近的密度梯度時停止不前 各種蛋白質被分離成各自獨立的區(qū)帶 3 凝膠過濾 分子篩層析 根據(jù)分子大小來分離蛋白質混合物的最有效的方法之一 當分子大小不同的混和樣品通過裝填有高度水化的惰性多聚體 葡聚糖凝膠Sephadex和瓊脂糖凝膠Sepharose 的層析柱時 比凝膠 網眼 大的蛋白質分子不能進入 網眼 而被排阻在凝膠顆粒之外 比 網眼 小的分子則進入凝膠顆粒的內部 這樣 由于不同大小的分子所經歷的路程不同而得以分離 大分子先洗下來 小分子后洗下來 三 根據(jù)電荷不同的分離方法 1 電泳2 離子交換層析 四 根據(jù)特異親和力不同的分離方法 親和層析 層析技術 層析又稱色譜法 利用混合物中各組分的物理化學性質 分子的形狀和大小 分子的極性 吸附力 分子的親和力 分子的分配系數(shù)等 的不同 使各組分以不同程度分布在兩相中 其中一相是固定的 稱固定相 另一相是流動的 稱流動相 當流動相流過固定相時 各組分以不同的速度移動 而達到分離 1 吸附層析 利用吸附劑 固定相 表面對不同組分物理吸附性能的差異而達到分離的目的 如硅膠G薄層層析 2 分配層析 利用各組分在給定的兩相中不同的分配系數(shù)而得到分離 如紙層析 3 離子交換層析 利用離子交換劑與試樣中不同離子結合吸引力的差異大小不同而得到分離 常用的交換劑有CM 纖維素 弱酸型陽離子交換劑 弱堿型的有陰離子交換劑DEAE 纖維素 改進型的CM Sephadex和DEAE Sephadex 4 凝膠層析 利用固定相的孔徑對試劑樣各分子 分子量大小或體積大小 的排阻特性差異進行分離 5 親和層析 利用固定相特定配體與試樣各分子特異性結合力 親和力 大小不同進行分離 電泳技術電泳是指帶電質點在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象 原理 在一定PH條件下 不同的物質具有不同的等電點就帶不同性質的電荷 因而在電場中它們的移動方向和移動速度也不同 可使它們分離 顆粒在電場中移動的速度主要決定于顆粒帶電荷的量 同時受顆粒形狀和顆粒相對分子質量的大小的影響 目前 電泳 electrophoresis 方法大致可分為三類 顯微電泳 自由界面電泳 沒有支持物 及區(qū)帶電泳 以區(qū)帶電泳應用比較廣泛 顯微電泳是用顯微鏡直接觀察細胞等大顆粒物質電泳行為的過程 目前已用于研究膜結構及癌細胞和正常細胞的差異性等方面 自由界面電泳是被分離的溶質顆粒經電泳后與緩沖溶液之間形成界面的電泳過程 利用適當?shù)墓鈱W系統(tǒng)可觀察到界面的移動 在電泳過程中 每個移動界面 峰 相當于某一特定的蛋白質 如 用于血漿蛋白成分的電泳 蛋白質分離純化及鑒定 分級沉淀法與等電點沉淀法聯(lián)合使用得到初步分離 脫鹽 透析和凝膠過濾