培養(yǎng)基的滅菌.doc

一、 常用培養(yǎng)基配置及滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解培養(yǎng)基的配制原理；掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟；2了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應(yīng)用范圍。 3學(xué)習(xí)高壓蒸汽滅菌的操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生長(zhǎng)繁殖和合成代謝產(chǎn)物所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的原材料可分為碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因素和水。根據(jù)微生物的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，培養(yǎng)基也有不同的種類和配制方法。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有時(shí)又稱為普通培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需要的最基本的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以可供微生物生長(zhǎng)繁殖之用。1、熱力滅菌：利用高溫使菌體蛋白質(zhì)變性或凝固，代謝發(fā)生障礙， 導(dǎo)致細(xì)菌死亡。包括：（1）焚燒法：用火焚燒，是很徹底的滅菌方法，適用于廢棄的污染物品和有傳染性的動(dòng)物尸體等。（2）燒灼法：直接再火焰上燒灼，用于接種環(huán)(針)和試管口或瓶口的滅菌。（3）干烤法：在干烤箱通電后利用高熱空氣進(jìn)行滅菌。一般加熱160-170， 維持2小時(shí)即可殺滅包括芽胞在內(nèi)的一切微生物。主要用于玻璃器皿、 磁器或需干燥的注射器等。（4）煮沸法：煮沸1005分鐘可殺死細(xì)菌的繁殖體，一般消毒以煮沸10分鐘為宜。如需要?dú)⑺姥堪麆t要煮沸1-3小時(shí)。主要用于一般外科器械、注射器、膠管和食具等的消毒。（5）間歇滅菌法：是利用反復(fù)多次的流通蒸汽， 殺死細(xì)菌所有繁殖體和芽胞的一種滅菌法。本法適用于耐熱物品，也適用于不耐熱(100)的一些物質(zhì)如某些培養(yǎng)基的滅菌。具體做法是將待滅菌的物品置于阿諾氏流通蒸汽滅菌器內(nèi)，100加熱15-30分鐘殺死其中的細(xì)菌繁殖體，然后將物品置37溫箱中過夜，使芽胞發(fā)育成繁殖體，次日再通過流通蒸汽加熱，如此連續(xù)三次，可將所有繁殖體和芽胞全部殺死。若有某些物品不耐100，則可將溫度降至75-80， 每次加熱的時(shí)間延長(zhǎng)至30-60分鐘， 次數(shù)增至3次以上，也可達(dá)到滅菌目的，如用血清凝固器對(duì)血清培養(yǎng)基或卵黃培養(yǎng)基的滅菌。（6）巴氏消毒法：由巴斯德創(chuàng)建，常用于牛奶和酒類的消毒。一般加熱61.1-62.8半小時(shí)， 或71.7經(jīng)15-30秒鐘， 便可達(dá)到殺死病原菌或一般雜菌， 而不嚴(yán)重破壞物品的質(zhì)量的目的。（7）高壓蒸汽滅菌法：是滅菌效果最好、目前應(yīng)用最廣的滅菌方法。利用高壓蒸汽滅菌器鍋進(jìn)行滅菌，由于密閉容器加溫所產(chǎn)生的高壓飽和水蒸汽能獲得較高的溫度，通常在1.05kg/cm2的壓力下， 溫度達(dá)121.3， 維持15-30分鐘， 可殺死包括細(xì)菌芽胞在內(nèi)的所有微生物。此法適用于高溫和不怕潮濕物品的滅菌，如普通培養(yǎng)基、生理鹽水、手術(shù)器械、注射器、手術(shù)衣、敷料和橡皮手套等。在同樣溫度下， 濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好， 原因是：A、濕熱中菌體吸收水份， 蛋白質(zhì)較易凝固。B、濕熱比干熱的穿透力好， 這主要是由于水或飽和水蒸汽傳導(dǎo)熱能的效率明顯高于空氣。蒸汽容易穿透到物體的深部， 使滅菌的物體內(nèi)部溫度迅速上升。C、蒸汽有潛熱存在。每一克水在100時(shí)， 由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)可放出529卡的熱量。當(dāng)蒸汽與被滅菌的物體接觸時(shí)凝結(jié)成水， 放出潛熱， 能迅速提高滅菌物體的溫度。2、紫外線滅菌：紫外線殺菌原理是通過干擾細(xì)菌DNA的合成， 波長(zhǎng)2650-2660A殺菌力最強(qiáng)。無(wú)菌室緩沖間和接種箱常用紫外線燈作空氣滅菌。無(wú)菌室和緩沖間的照射時(shí)間為2050分鐘（視房間大小而定），接種箱照射1015分鐘即可。為了加強(qiáng)紫外線滅菌的效果，在照射前，可在無(wú)菌室、緩沖間或接種箱內(nèi)噴灑5%石炭酸，以使空氣中附著有微生物的塵埃降落，同時(shí)也可以殺死一部分微生物。無(wú)菌室的工作臺(tái)的臺(tái)面和椅子，可用23%的來(lái)蘇兒擦洗。然后再照射紫外線。由于紫外線對(duì)人體有傷害作用，所以人不要直視正在照射的紫外線燈，也不要在照射情況下進(jìn)行工作。滅菌后，為了檢驗(yàn)紫外線的滅菌效果，可以在無(wú)菌室、緩沖間或接種箱內(nèi)放一套盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，將皿蓋打開510分鐘，蓋好后，放入溫箱中培養(yǎng)。如果只有一、二個(gè)菌落，可認(rèn)為滅菌效果良好。如雜菌叢生。則需延長(zhǎng)照射時(shí)間或同時(shí)加強(qiáng)其它滅菌措施。紫外線作用的特點(diǎn)是(1)穿透力弱，只能用于房間空氣、物體表面消毒；(2)殺菌效果與照射時(shí)間，距離和強(qiáng)度有關(guān)；(3)對(duì)眼睛角膜和皮膚有損傷作用，工作人員切勿在紫外線燈照射下進(jìn)行操作。三、實(shí)驗(yàn)器材1器材 試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養(yǎng)基、分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH度紙、棉花、牛皮紙、記號(hào)筆、麻繩、紗布、吸管、培養(yǎng)皿、電烘箱、注射器、微孔濾膜過濾器、鑷子等。2試劑 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂四、實(shí)驗(yàn)流程 稱藥品溶解調(diào)pH值融化瓊脂過濾分裝包扎標(biāo)記滅菌擺斜面或倒平板五、實(shí)驗(yàn)步驟1培養(yǎng)基的制備 1）稱量藥品 根據(jù)培養(yǎng)基配方依次準(zhǔn)確稱取各種藥品，放入適當(dāng)大小的燒杯中，瓊脂不要加入。蛋白胨極易吸潮，故稱量時(shí)要迅速。 2）溶解 用量筒取一定量(約占總量的1/2)蒸餾水倒入燒杯中，在放有石棉網(wǎng)的電爐上小火加熱，并用玻棒攪拌，以防液體溢出。待各種藥品完全溶解后，停止加熱，補(bǔ)足水分。如果配方中有淀粉，則先將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀，并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，補(bǔ)足水分。 3）調(diào)節(jié)pH 根據(jù)培養(yǎng)基對(duì)pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液調(diào)至所需pH。測(cè)定pH可用pH試紙或酸度計(jì)等。 4）溶化瓊脂 固體或半固體培養(yǎng)基須加入一定量瓊脂。瓊脂加入后，置電爐上一面攪拌一面加熱，直至瓊脂完全融化后才能停止攪拌，并補(bǔ)足水分(水需預(yù)熱)。注意控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。 5）過濾分裝 先將過濾裝置安裝好。如果是液體培養(yǎng)基，玻璃漏斗中放一層濾紙，如果是固體或半固體培養(yǎng)基，則需在漏斗中放多層紗布，或兩層紗布夾一層薄薄的脫脂棉趁熱進(jìn)行過濾。過濾后立即進(jìn)行分裝。分裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾染在管口或瓶口，以免浸濕棉塞，引起污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。固體分裝裝量為管高的1/5，半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜；分裝三角瓶，其裝量以不超過三角瓶容積的一半為宜。 6）包扎標(biāo)記 培養(yǎng)基分裝后加好棉塞或試管帽，再包上一層防潮紙，用棉繩系好。在包裝紙上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱，制備組別和姓名、日期等。 7）滅菌 上述培養(yǎng)基應(yīng)按培養(yǎng)基配方中規(guī)定的條件及時(shí)進(jìn)行滅菌。普通培養(yǎng)基為121 20min，以保證滅菌效果和不損傷培養(yǎng)基的有效成份。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，如需要作斜面固體培養(yǎng)基，則滅菌后立即擺放成斜面，斜面長(zhǎng)度一般以不超過試管長(zhǎng)度的1/2為宜；半固體培養(yǎng)基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。 8）倒平板 將需倒平板的培養(yǎng)基，于水浴鍋中冷卻到4550,立刻倒平板1、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)細(xì)菌用）牛肉膏3g蛋白胨5g氯化鈉10g瓊脂1520gpH7.07.2水1000mL 121滅菌20min。2、馬鈴薯培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱PDA）（培養(yǎng)真菌用）馬鈴薯200g蔗糖（或葡萄糖）20g瓊脂1520gpH自然 培養(yǎng)基的配制：馬鈴薯去皮，切成塊煮沸30min，然后用紗布過濾，再加糖及瓊脂，熔化后補(bǔ)足水至1000mL。121滅菌30min。2高壓滅菌操作步驟1）首先將內(nèi)層滅菌桶取出,再向外層鍋內(nèi)加入適量的水,使水面與三角擱架相平為宜。2）放回滅菌桶,并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠,以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸,以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。3）加蓋,并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對(duì)稱的方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓,使螺栓松緊一致,勿使漏氣。4）用電爐或煤氣加熱,并同時(shí)打開排氣閥,使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后,關(guān)上排氣閥,讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí),控制熱源,維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用 105kg/cm2,1213,20分鐘滅菌。5）滅菌所需時(shí)間到后,切斷電源或關(guān)閉煤氣,讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降,當(dāng)壓力表的壓力降至0時(shí),打開排氣閥,旋松螺栓,打開蓋子,取出滅菌物品。如果壓力未降到0時(shí),打開排氣閥,就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降,使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口,造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。6）將取出的滅菌培養(yǎng)基放入 37溫箱培養(yǎng)24小時(shí),經(jīng)檢查若無(wú)雜菌生長(zhǎng),即可待用。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底。七、思考