實驗項目二住骨髓間充質干細胞的倍增時間與生長曲線的測定.doc

精品文檔 PMSCs生長曲線和倍增時間的測定【1】 來自豬脂肪間充質干細胞的分離培養(yǎng)及其成脂分化：取生長狀況良好的P1、P3、P5、P9代細胞，用0.25%胰酶消化液，在37消化1-3min，制成單細胞懸液，然后以5x104個/ml密度接種到30個直徑為35mm培養(yǎng)皿中，隨機分成10組，每組3皿，每天檢測一組中每皿的細胞總數，取3個皿的均值，如此至第10組結束，細胞技術如下(2004,司徒鎮(zhèn)強)即一天消化3個組，共消化10天。P1，P3,P5，P9均如此，每代30個皿，共計120個皿。細胞群體倍增時間（PDT）=(t-t0)lg2/(lgNt-lgN0) t0培養(yǎng)起始時間， t,培養(yǎng)終止時間；N0培養(yǎng)初始細胞數，Nt培養(yǎng)終止細胞數?！?】 增強型綠色熒光蛋白轉染豬骨髓間充質干細胞特性觀察 用0.25%胰酶將轉染后的細胞克隆消化為單個細胞，用PBS洗2遍，1x105個細胞加入75l破膜劑，振蕩10s,加入PI染料700l,室溫避光30min,上機檢測；選同期培養(yǎng)的為轉染細胞為對照組，比較EGFP轉染對細胞增殖的影響，分別計算出靜止期G0/G1 ,增殖期S%,和G2/M【3】 兩種方法分離小型豬骨髓間充質干細胞的比較分別取兩組0,1,3代細胞，制成1x103的細胞懸液，接種到96孔板，每孔細胞懸液200微升，置37、5%CO2飽和濕度孵箱內孵育，各組每24小時分別取出4孔，每孔加入MTT（2mg/ml）20微升 37孵育，4h后吸棄孔內培養(yǎng)液，每孔加入150微升分析純的二甲基亞砜，移至酶聯免疫檢測儀上振蕩10min,用分光光度計在492nm波長處測定每孔的吸光度值（OD492），以OD(492)值為縱坐標，時間為橫坐標繪制生長曲線。【4】 人骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)及其生物學特性研究取不同代數細胞，調整細胞濃度為2x104/ml后，接種于96孔培養(yǎng)板，置37，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，用胰酶-EDTA進行消化，用臺盼藍拒染法計數活細胞，每天取12復孔，共7天；根據計數結果繪制細胞生長曲線。記錄測得的結果，即培養(yǎng)潛伏期持續(xù)多長時間（12-24h）,多長時間進入對數生長期（3天后），對數增殖期持續(xù)時間（3-5天）,鋪滿皿底所需時間（5-7天），細胞進入平臺期多長時間及持續(xù)多長時間，停止生長時間?！?】 來自;山羊骨髓間充質干細胞體外分離與培養(yǎng)，選擇P1，P5，P9（即早、中、晚三代）作生長曲線，進行觀察，記錄各自的潛伏期，對數生長期，平臺期山羊BMSC原代培養(yǎng)生長曲線繪制。山羊BMSC P1、P5、P9代生長曲線。【6】 來自：胎豬骨髓間充質干細胞核移植及核移植胚胎干細胞的分離 將傳至第4代生長旺盛pFMSCs(porcine fetal mesenchymal stem cells)細胞用0.25%胰酶+0.04%EDTA(稱取胰蛋白酶0.5g和EDTA0.08g,溶入200mlPBS中，常溫磁力攪拌器攪拌直至徹底溶解，用0.22m孔徑的濾膜過濾，無菌條件分裝成小瓶（4ml/瓶），-20凍存)消化3-5min,培養(yǎng)液中和，吹打成單個細胞，調整細胞濃度為2x104個/ml,接種在兩個12孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種1ml,再補加培養(yǎng)液1ml,混勻。38.5，5%CO2,飽和濕度的條件下培養(yǎng)。常規(guī)換液。每24h用0.25%胰酶+0.04%EDTA消化液消化3孔細胞，細胞計數板計算每孔細胞總數，每孔記2次，取平均值。細胞接種當天記為第0天，連續(xù)測定8天。以時間（d）為橫坐標，每天測定3孔細胞數的平均值為縱坐標，繪制生長曲線。 胎豬骨髓間充質干細胞周期化處理：血清饑餓處理（當細胞生長到80%匯合時，將血清濃度由10%降成0.5%，繼續(xù)培養(yǎng)2-4天；或者是利用接觸抑制處理（當細胞生長至80%匯合時，繼續(xù)使用含10%NBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)2-3天。將上述處理的細胞常規(guī)消化離心，PBS重懸細胞，按每管106細胞分裝于10ml離心管，離心，0.5mlPBS重懸細胞，邊振蕩邊緩慢加入3ml預冷的75%乙醇，4過夜固定12h以上，離心去除乙醇，用含1%NBS的PBS重懸細胞，離心洗滌2遍，200lPBS重懸細胞，加入0.8mg/mlRNase 1ml,37，30min.離心，200微升PBS重懸細胞。加入含有100g/mlPI0.1%X-100的PBS 1ml,室溫下作用10-15min，100目濾沙過濾，上機檢測。進行流式細胞儀檢測?！?】 來自：豬骨髓間充質干細胞分離培養(yǎng)及其核移植胚胎發(fā)育潛能研究生長曲線測定：取第3代MSCs細胞，以每孔5.0x104個/ml接種到24孔培養(yǎng)板內。在37.5，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天取2孔，連續(xù)7天，采用血球計數板計數法計算每孔的細胞數，取平均值，即細胞數/毫升原液=（5個大方格細胞數之和/5）x104.繪制生長曲線，重復實驗3次。貼壁率曲線的測定：取pMSCs第3代細胞，以每瓶5x104個/cm2密度接種到12個25ml培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)，每2h取2瓶，倒掉培養(yǎng)液（未含貼壁細胞），0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞并計數，計數貼壁率，繪制貼壁率曲線。計算公式：貼壁率（%）=貼壁存活細胞數/接種細胞數x100%分裂指數測定：用0.25%胰蛋白酶消化第3代細胞，以1x104個/cm2密度接種鋪有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24h取出觀察一次，PBS清洗三遍后，95%乙醇固定10min,PBS清洗三遍，置于5g/ml DAPI內染色10min,PBS清洗后，滴加甘油油滴，封片后在熒光顯微鏡下觀察，同倍鏡下取5個不同視野，計數分裂相細胞，取平均值。連續(xù)7天，以時間（天）為橫坐標，細胞分裂相的千分率（%）為縱坐標，繪制分裂指數曲線圖。【8】 來自：兩種培養(yǎng)方法在豬自體骨髓間充質干細胞培養(yǎng)的比較研究直接貼壁培養(yǎng)法原代培養(yǎng)時受紅細胞影響容易失敗，且培養(yǎng)時潛伏期較長，一般為11-13天，15-17天進入對數增長期，20天左右進入生長平臺期。密度梯度離心結合直接貼壁法培養(yǎng)原代細胞較單純直接貼壁法培養(yǎng)潛伏期較短，一般為7-9天，11-15天進入對數生長期，17天左右進入生長平臺期?！?】 來自：豬骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)及核移植后重構胚胎發(fā)育能力的研究生長曲線：取pMSCs和PF第3代細胞，分別以每孔密度5x104和6.5x104接種到24孔培養(yǎng)板內，上述條件培養(yǎng)，每天取3孔，連續(xù)7天，采用血球計數板計數法計數每孔的細胞數，計算公式：細胞數/毫升原液=(5大格細胞數之和/5)x104,繪制生長曲線。pMSCs貼壁率曲線的測定:取pMSCs第3代細胞，以每瓶5x104密度接種到12個25ml培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)，每2h取2瓶，倒掉培養(yǎng)液（含有未貼壁細胞），0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞并計數，計算貼壁率。計算公式：貼壁率（%）=貼壁存活細胞數/接種細胞數x100%.繪制貼壁率曲線。PMSCs分裂指數測定：用0.25%胰蛋白酶消化第3代細胞，以1x104密度接種鋪有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中37，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24h取出觀察一次，PBS三遍后，95%乙醇固定10min,PBS清洗三遍，置于5g/mlDAPI內染色10min,PBS清洗后，蓋在滴有甘油的載玻片上，封片后在熒光顯微鏡下觀察，同倍鏡下取5個不同視野，計數分裂相細胞，取平均值。連續(xù)7天，以時間（天）為橫坐標，細胞分裂相的千分率（）為縱坐標，繪制分裂指數曲線圖?！?0】，來自：豬骨髓間充質干細胞培養(yǎng)參考【10】 來自：SD大鼠骨髓間充質干細胞體外分離培養(yǎng)的實驗研究大鼠MSCs生長曲線測定：為了定量測定大鼠BMSCs的生長狀況，對來源于同一動物的原代細胞進行連續(xù)培養(yǎng)。分別選取生長良好的P1、P3、P5代BMSCs消化后制備成細胞懸液，調整細胞密度為5x104/ml。接種到96孔板，每孔接種200l細胞懸液進行培養(yǎng)（每孔1x104細胞）。次日起每天選擇6個培養(yǎng)孔各自加入MTT溶液（5mg/ml）20l，37繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)，吸出孔內上清，每孔加入150lDMSO,室溫振蕩10min，使結晶充分溶解，于試驗孔平行設不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照1孔。在酶標儀上選擇570nm波長，以空白孔調零，測定各孔吸光度（A）值，連續(xù)測7天，以時間為橫軸，A值為縱軸繪制細胞生長曲線。【11】 來自：多耐藥基因MOR1逆轉錄病毒載體的構建及其轉染人胎盤源間充質干細胞的研究生長曲線的繪制及對數生長期倍增時間的測定取對數生長期細胞，消化計數，用MSC培養(yǎng)基制成細胞懸液（2x104/ml）,0.5ml/孔在24孔板中培養(yǎng)。每天取3復孔，臺盼