成人淋球菌性眼炎致失明一例.docx

斑點(diǎn)印跡雜交法檢測(cè)四環(huán)素抗性基因斑點(diǎn)印跡雜交法檢測(cè)四環(huán)素抗性基因中華皮膚科雜志 1999年第3期第32卷 短篇論著作者：駱丹聶劉旺魯曉萱黃澍杰謝禮豪徐文嚴(yán)朱文元單位：駱丹朱文元210029南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科；聶劉旺魯曉萱南京鐵道醫(yī)學(xué)院生物教研室；徐文嚴(yán)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所；黃澍杰謝禮豪廣東省江門市皮膚病防治所解脲支原體(Uu)是一種缺乏細(xì)胞壁、因而對(duì)內(nèi)酰胺類抗生素治療無(wú)效的微生物，故對(duì)Uu感染引起的臨床癥狀常用四環(huán)素、紅霉素類等藥物治療。因上述藥物的廣泛使用，四環(huán)素抗性基因(tetM)在各種微生物間的轉(zhuǎn)座或轉(zhuǎn)化作用等，使Uu耐藥株不斷增加。通過(guò)微生物藥物敏感性試驗(yàn)(MIC)及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)可檢測(cè)耐藥程度、耐藥種類及四環(huán)素耐藥決定子(tetM)。本研究擬對(duì)tetM標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行地高辛標(biāo)記制備成核酸探針，再行斑點(diǎn)印跡雜交試驗(yàn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。一、材料與方法(一)藥品、試劑與實(shí)驗(yàn)菌株：標(biāo)準(zhǔn)品鹽酸四環(huán)素由中國(guó)生物制品檢定所提供；PCR相關(guān)試劑均購(gòu)自華美及復(fù)華生物工程公司；HybondN尼龍膜為英國(guó)Amersham公司產(chǎn)品；地高辛(Dig)標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)試劑盒為德國(guó)寶靈曼公司產(chǎn)品。42Uu株為臨床非淋菌性尿道炎(宮頸炎)患者泌尿生殖道分泌物培養(yǎng)鑒定后陽(yáng)性株標(biāo)本，傳代3次后收集備用于MIC測(cè)定、PCR擴(kuò)增模板及基因組DNA提取后的分子雜交。(二)TRNGtetMPCR產(chǎn)物的回收、純化與標(biāo)記：將200LTRNGtetMPCR產(chǎn)物經(jīng)1.5瓊脂糖凝膠電泳后，取出DNA熒光帶置Eppendorf管中搗碎，加等體積平衡酚振蕩搖勻及70冰凍各10min，12000r/min離心10min后再按酚氯仿抽提法制備純化DNA，20保存以備標(biāo)記用。標(biāo)記前首先變性模板DNA，按試劑盒說(shuō)明在冰上依次加入相應(yīng)試劑，37保溫過(guò)夜后，終止標(biāo)記反應(yīng)，再行乙醇沉淀漂洗所標(biāo)記的DNA探針，并以TE溶解保存。(三)Dot?Blot印跡雜交：分別將UutetMPCR產(chǎn)物3L及Uu分離株DNA提取物模板10L加熱變性冷卻后直接點(diǎn)膜于HybondN尼龍膜上，80烘烤2h固定膜上DNA。以預(yù)雜交液(50去離子甲酰胺，5Denhart液，0.1g/mL變性鮭魚(yú)精子DNA等)68預(yù)雜交2h。變性DNA探針后加入正式雜交體系，68雜交過(guò)夜。次日經(jīng)高濃度到低濃度SSC洗滌后，封閉非特異性雜交，依照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行免疫檢測(cè)顯示雜交結(jié)果。二、結(jié)果(一)Uu株四環(huán)素MIC分布與tetM基因擴(kuò)增檢測(cè)：42株Uu對(duì)四環(huán)素敏感性的檢測(cè)表明，MIC達(dá)8g/mL以上有12株；30例tetM決定子陽(yáng)性的Uu株其MIC水平分布于0.0632g/mL。(二)tetMPCR產(chǎn)物的斑點(diǎn)印跡雜交：以載tetM的TRNG作為對(duì)照，經(jīng)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳回收純化及標(biāo)記后，對(duì)上述30例PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行斑點(diǎn)印跡雜交分析。結(jié)果出現(xiàn)陽(yáng)性雜交信號(hào)28例，陰性2例。(三)不同MIC株DNA提取物的斑點(diǎn)印跡雜交：采用前述核酸探針與各濃度的Uu株DNA提取物直接點(diǎn)膜雜交，結(jié)果只有MIC16g/mL以上的Uu株DNA才可出現(xiàn)陽(yáng)性雜交信號(hào)，此探針不能與MIC8g/mL以下的Uu分離株DNA提取物反應(yīng)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的雜交信號(hào)，12例PCR擴(kuò)增檢測(cè)陰性者亦未出現(xiàn)陽(yáng)性雜交信號(hào)。三、討論采用96孔板微量肉湯稀釋法篩選藥物敏感株是經(jīng)典的微生物敏感性試驗(yàn)，此法可同時(shí)檢測(cè)某種微生物對(duì)多種抗菌藥物在不同濃度下的敏感性如何，但存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，判斷易有主觀性等問(wèn)題。分子生物學(xué)技術(shù)如核酸探針、PCR擴(kuò)增等均可通過(guò)檢測(cè)微生物自身的藥物抗性基因存在與否來(lái)檢測(cè)耐藥菌株。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)tetM抗性基因的PCR陽(yáng)性檢測(cè)率并非完全與MIC濃度有明確相關(guān)性，即tetM抗性基因陽(yáng)性與否與MIC濃度大小無(wú)明顯相關(guān)，但tetM陽(yáng)性提示有可能從敏感株發(fā)展成中度敏感株(MIC=8g/mL)或耐藥株(MIC16g/mL)，因此在性病臨床防治及流行病學(xué)研究方面應(yīng)予重視及監(jiān)測(cè)隨訪。為進(jìn)一步闡明耐藥基因與MIC檢測(cè)的關(guān)系，本研究采用核酸探針技術(shù)分別對(duì)藥物抗性基因的PCR產(chǎn)物及基因組DNA進(jìn)行斑點(diǎn)印跡雜交分析。結(jié)果表明地高辛標(biāo)記的TRNG?tetMPCR產(chǎn)物核酸探針可與Uu株28/30份PCR產(chǎn)物產(chǎn)生陽(yáng)性雜交信號(hào)，其陽(yáng)性率為93.3，將此探針直接與分離株DNA提取物點(diǎn)膜雜交后發(fā)現(xiàn)，只有MIC16g/mL和MIC=32g/mL者可出現(xiàn)陽(yáng)性雜交信號(hào)，低于此濃度者未獲陽(yáng)性雜交結(jié)果。此說(shuō)明耐藥基因經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，tetM決定子的拷貝數(shù)可能增多，可通過(guò)核酸探針這一敏感性相對(duì)較低的方法檢測(cè)之；MIC達(dá)16g/mL以上的培養(yǎng)物DNA提取物模板能被標(biāo)記的tetM核酸探針檢測(cè)出來(lái)是否與拷貝多少相關(guān)尚不清楚。值得提出的是若以MIC16g/mL判為Uu耐四環(huán)素藥物的水平標(biāo)準(zhǔn)，則核酸探針檢測(cè)的結(jié)果與之吻合，此亦便于為臨床治療提供參考。而PCR檢測(cè)法頗為靈敏，在MIC=0.06g/mL時(shí)即可出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。因此可將PCR擴(kuò)增作為篩查耐藥基因攜帶株的檢測(cè)手段，并以核酸探針雜交分析對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)一步肯定證實(shí)，同時(shí)亦可對(duì)MIC測(cè)定的耐藥程度或耐藥性加以佐證。參考文獻(xiàn)1朱慧蘭，徐廣坤，賴維，等.解脲支原體中tetM基因的檢測(cè)及臨床應(yīng)用評(píng)價(jià).中華皮膚科雜志,1998,31:185186.2駱丹，黃澍杰，謝禮豪，等.解脲支原體對(duì)七種抗菌藥物的敏感性測(cè)定及其與相關(guān)耐藥基因檢測(cè)的比較.中華皮膚科雜志,1998,31:152155.3盧圣棟主編.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù).北京：高等教育出版社.1993.4 Kenny GE, Cartwright FD, Susceptibilities of Mycoplasma hominis, Mycoplasma pneumoniae, and Ureaplasma urealyticum to new glycyclines in comparison wit