基因功能研究方法.ppt

基因功能研究方法 隨著生物學(xué)研究在分子水平上的不斷深入和推進(jìn) 越來(lái)越多的新基因得以成功克隆 對(duì)新基因功能的研究顯得日益重要 這也是后基因組時(shí)代功能基因組學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容 1 微陣列分析 微陣列 microarray 是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的可用于大規(guī)模快速檢測(cè)基因差異表達(dá) 基因組表達(dá)譜 DNA序列多態(tài)性 致病基因或疾病相關(guān)基因的一項(xiàng)研究基因功能的新技術(shù) 它包括cDNA微陣列 cDNAmicroarray 和DNA芯片 原理 將成千上萬(wàn)條DNA片段 cDNA 表達(dá)序列標(biāo)簽 expressedsequencetag EST 或特異的寡核苷酸片段 按橫行縱列方式有序點(diǎn)樣在固相支持物上 固相支持物為硝基纖維膜或尼龍膜時(shí)稱(chēng)為微陣列 固相支持物改為指甲蓋大小的玻片或硅片時(shí)所形成的微陣列就稱(chēng)為DNA芯片 微陣列法分析過(guò)程 首先用來(lái)自不同生理狀態(tài)和發(fā)育階段的mRNA作為模板 以放射性同位素或熒光標(biāo)記的dNTP為底物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 其次將所得cDNA與微陣列或DNA芯片進(jìn)行雜交 最后通過(guò)計(jì)算機(jī)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀和處理 這樣就可以知道芯片中哪些基因在細(xì)胞里表達(dá) 哪些基因不表達(dá) 同樣也可以測(cè)知哪些基因的表達(dá)水平高 哪些基因的表達(dá)水平低 芯片的制作 目前常用的基因芯片制作方法 接觸點(diǎn)樣法噴黑法原位合成法 接觸點(diǎn)樣法 是將樣品直接點(diǎn)在基體上 優(yōu)點(diǎn)是儀器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單 容易研制 是一種快速 經(jīng)濟(jì) 多功能的儀器 可以在3 6cm2面積內(nèi)點(diǎn)上10000個(gè)cDNA 不足是每個(gè)樣品都必須合成好 經(jīng)過(guò)純化 事先保存的 噴黑法 是以定量供給的方式 通過(guò)壓電晶體或其他推進(jìn)形式從很小的噴嘴內(nèi)把生物樣品噴射到玻璃載體上 同樣需要合成好的純樣品 包括cDNA 染色體DNA片段和抗體 在1cm2面積上可噴射10000個(gè)點(diǎn) 原位合成法 主要是美國(guó)Affymetrix公司開(kāi)發(fā)的寡聚核苷酸原位光刻DNA合成技術(shù) 原理 在合成堿基單體的5 羥基末端連上一個(gè)光敏保護(hù)基 利用光照射使羥基端脫保護(hù) 然后逐個(gè)將5 端保護(hù)的核苷酸單體連接上去 這個(gè)過(guò)程反復(fù)進(jìn)行直至合成完畢 原位合成法的優(yōu)點(diǎn) 合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長(zhǎng) 在1 6cm2面積上合成40萬(wàn)組寡核苷酸 2 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù) 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)是將目的基因轉(zhuǎn)入某一細(xì)胞中 然后觀察該細(xì)胞生物學(xué)行為的變化 從而了解該基因的功能 這是目前應(yīng)用最多 技術(shù)最成熟的研究基因功能的方法之一 但因基因的表達(dá)受轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和是否持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)兩方面因素的影響 主要方法有物理的 化學(xué)的和生物的方法 2 1物理方法1 DNA直接注射法 是目的基因?qū)氲淖詈?jiǎn)單方法 但注入量有限 能夠接觸到的細(xì)胞有限 故獲得的細(xì)胞轉(zhuǎn)化率很低 多通過(guò)腫瘤局部多點(diǎn)注射給藥 2 顆粒轟擊技術(shù) 將目的基因包被金屬以后 利用高壓發(fā)射裝置 加速包裹目的基因的金屬顆粒進(jìn)入細(xì)胞 從而提高腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率 2 2化學(xué)方法1 脂質(zhì)體載體 方法具有安全 簡(jiǎn)單 低毒 無(wú)免疫原性等優(yōu)點(diǎn) 適用于注射方法進(jìn)行器官靶向性轉(zhuǎn)移并有一定的轉(zhuǎn)移效率 是除病毒載體轉(zhuǎn)移方法之外的另一種有價(jià)值的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移方法 2 受體介導(dǎo)法 利用肝細(xì)胞上富含轉(zhuǎn)移因子和糖蛋白受體的特點(diǎn) 人工合成多聚陽(yáng)離子氨基酸 進(jìn)而連接轉(zhuǎn)移因子 或糖蛋白 和目的基因構(gòu)成復(fù)合物 通過(guò)與肝細(xì)胞表面的受體結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)移 優(yōu)點(diǎn) 靶向性好 但受體介導(dǎo)的內(nèi)吞小泡會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體 易被溶酶體降解而造成目的基因表達(dá)時(shí)間短暫 表達(dá)效率低下 利用腺病毒與內(nèi)吞小泡相融合而將其破壞釋放出外源DNA 可提高轉(zhuǎn)化效率 2 3生物學(xué)方法 主要通過(guò)構(gòu)建病毒載體來(lái)完成 病毒表達(dá)載體 以病毒為載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 因其轉(zhuǎn)染效率高 目的基因可穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用 1 逆轉(zhuǎn)錄病毒 retrovirus Rv 構(gòu)建簡(jiǎn)單 裝載外源基因容量最大達(dá)8kb 整合入宿主細(xì)胞基因組而無(wú)病毒蛋白表達(dá) 但僅能感染分裂期細(xì)胞 體外制備滴度較低 且其隨機(jī)整合有引起 插入性突變 的可能 2 腺病毒 adenovirus Adv 為近年肝細(xì)胞肝癌基因治療中報(bào)告最多的一種病毒載體 裝載外源基因容量最大達(dá)35kb 不整合入宿主細(xì)胞基因組因而避免插入突變的危險(xiǎn) 能感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞 但易引起宿主免疫反應(yīng)而使轉(zhuǎn)染效率下降 3 反義技術(shù) 反義技術(shù)是根據(jù)堿基互補(bǔ)原理 利用人工或生物合成的特異互補(bǔ)的DNA或RNA片段 或其修飾產(chǎn)物 來(lái)抑制或封閉目的基因的表達(dá) 包括 反義寡核苷酸技術(shù) Antisenseoligonuclerotides ASON 反義RNA技術(shù)核酶 Ribozyme 技術(shù) 3 1反義寡核苷酸技術(shù)反義核苷酸 是一類(lèi)經(jīng)人工合成或構(gòu)建的反義表達(dá)載體表達(dá)的寡核苷酸片段 長(zhǎng)度多為15 30個(gè)核苷酸 通過(guò)堿基互補(bǔ)原理 干擾基因的解旋 復(fù)制 轉(zhuǎn)錄 mRNA的剪接加工乃至輸出和翻譯等各個(gè)環(huán)節(jié) 從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng) 分化等 根據(jù)結(jié)合部位的不同分為 反義DNA asDNA 反義RNA asRNA 自催化性核酶 ribozyme 最常用的為反義寡脫氧核苷酸 反義寡核苷酸 其優(yōu)點(diǎn)在于其理論上的高度靶特異性 堿基互補(bǔ) 設(shè)計(jì)容易 多樣且合成簡(jiǎn)單及高度的局部性和針對(duì)性 3 2反義RNA技術(shù)反義RNA技術(shù) 是利用基因重組技術(shù) 構(gòu)建人工表達(dá)載體 使其離體或體內(nèi)表達(dá)反義RNA 反義RNA能與靶mRNA形成較穩(wěn)定的二聚體 從而抑制靶基因的表達(dá) 其作用機(jī)理可能在DNA復(fù)制 轉(zhuǎn)錄及翻譯多水平上抑制靶基因的表達(dá) 3 3核酶技術(shù)核酶 Ribozyme 技術(shù) 是一類(lèi)具催化活性的特殊RNA分子 通過(guò)堿基配對(duì)原則特異性滅活靶RNA分子 可裂解與其互補(bǔ)的mRNA及在DNA內(nèi)插入DNA片段構(gòu)成三鏈結(jié)構(gòu) 單個(gè)核酶分子可以結(jié)合多個(gè)mRNA分子并使之在特定部位斷裂 而其本身具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu) 不易受RNase攻擊 因而催化效率比反義RNA高 常見(jiàn)的核酶有錘頭狀 發(fā)夾狀和斧頭狀三種 應(yīng)用最多的是錘頭狀核酶 反義技術(shù)的兩種技術(shù)路線(xiàn) 將表達(dá)與體內(nèi)基因或mRNA互補(bǔ)序列的基因轉(zhuǎn)入體內(nèi) 使細(xì)胞表達(dá)與目標(biāo)基因互補(bǔ)的mRNA失活 從而阻斷目標(biāo)基因的表達(dá) 體外合成mRNA互補(bǔ)的核苷酸類(lèi)似物 通過(guò)靜脈注射等途徑進(jìn)入細(xì)胞 特異性的與目標(biāo)mRNA作用 反義寡聚核苷酸與mRNA特異性結(jié)合 阻斷翻譯過(guò)程 4 基因敲除和敲入 4 1基因敲除 Geneknockout 又稱(chēng)基因打靶 genetargeting 是同源重組技術(shù)的形象說(shuō)法 通過(guò)一定的途徑使特定的基因失活或缺失的技術(shù) 它是指用外源DNA與受體細(xì)胞基因組中順序相同或者非常相近的基因發(fā)生同源重組 整合到受體細(xì)胞基因組中并得到表達(dá)的一種外源DNA導(dǎo)入技術(shù) 優(yōu)點(diǎn) 此技術(shù)整合位點(diǎn)確定 精確 轉(zhuǎn)移基因頻率較高 既可以用正?；蚯贸蛔兊幕?以進(jìn)行性狀的改良和遺傳病的治療 又可以用突變的基因敲除正常的基因 以研究此基因在發(fā)育和調(diào)控方面的作用 目前利用基因敲除得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的程序可簡(jiǎn)述如下 1 克隆基因組中某一基因的全部或部分DNA序列 用插入 刪除 置換 修飾等手段重建DNA序列 使之成為靶載體 2 將靶載體導(dǎo)入小鼠的胚胎干細(xì)胞中 使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組相應(yīng)部分發(fā)生同源重組 將靶載體的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中 3 將胚胎干細(xì)胞受體細(xì)胞注入小鼠的囊胚 將這些囊胚導(dǎo)入假孕母鼠子宮中 產(chǎn)生的雄性嵌合鼠子代與正常的雌鼠交配即可獲得生殖系統(tǒng)攜帶該基因的純合鼠 進(jìn)而分析被剔除基因的功能 4 2基因敲入基因敲除技術(shù)已經(jīng)成為研究基因功能的強(qiáng)有力手段 但對(duì)于許多基因來(lái)說(shuō) 簡(jiǎn)單的失活常導(dǎo)致令人費(fèi)解的無(wú)改變的表型 最常見(jiàn)的解釋是某些其它基因取代了靶基因的功能 但要在普通基因敲除小鼠中證明這一點(diǎn)十分困難 基因敲入即通過(guò)基因打靶用一種基因替換另一種基因以確定它們是否具有相同功能 基因敲入的設(shè)計(jì) 是一個(gè)類(lèi)似于普通基因敲除法的一步同源重組過(guò)程 不同之處在于 設(shè)計(jì)打靶載體時(shí)需將靶基因第一個(gè)外顯子的N 端序列缺失 并將新的替換基因置于靶基因的調(diào)控序列之下 使其能精確地按照靶基因的調(diào)控模式表達(dá) 此方法不僅能用一種基因置換另一種基因 且可以系統(tǒng)地改變基因的結(jié)構(gòu) 分析其蛋白產(chǎn)物各功能區(qū)的作用 5 人工染色體的轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)是進(jìn)行蛋白功能分析和基因表達(dá)調(diào)控的有力手段 但使用小的質(zhì)粒重組體存在表達(dá)水平低 缺乏組織特異性等缺點(diǎn) 若將大的DNA片段克隆入酵母人工染色體 YACs 或細(xì)菌染色體 可產(chǎn)生較好的表達(dá)水平和組織特異性 并可精確地調(diào)節(jié)同源重組 酵母人工染色體 yeastartificialchromosome YAC 是一類(lèi)酵母穿梭載體 具有自主復(fù)制序列 克隆位點(diǎn)以及可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因 還具有酵母菌染色體的一些特點(diǎn) 可以接受100 1000kb的外源DNA片段 原理 酵母人工染色體就是把酵母染色體上與基因復(fù)制和表達(dá)有關(guān)的主要組件都組裝在質(zhì)粒上 令質(zhì)粒行使酵母的轉(zhuǎn)錄功能和復(fù)制功能 酵母人工染色體DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法 主要有核注射 脂質(zhì)體介導(dǎo)和酵母原生質(zhì)體融合等 優(yōu)點(diǎn) 可使導(dǎo)入基因的水平與內(nèi)源基因相當(dāng) 并且具有類(lèi)似于天然的剪接機(jī)理 適用于復(fù)雜的基因功能分析 YAC要具備的主要功能成份 1 著絲粒 mitosis姊妹染色單體和減I同源染色體分離之必需 2 端粒 保護(hù)染色體末端免受核酸酶的侵襲 3 自主復(fù)制序列 ARS 元件 是染色體自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn) 構(gòu)建YAC需要4個(gè)短序列 2個(gè)端粒 著絲粒 ARS元件與外源DNA連接成線(xiàn)性DNA分子 導(dǎo)入酵母細(xì)胞克隆 6 基因誘捕技術(shù) 基因誘捕是通過(guò)物理 化學(xué) 生物等方法將一個(gè)帶有外源基因如抗藥基因或報(bào)告基因的DNA載體導(dǎo)入到ES細(xì)胞中 外源基因通過(guò)捕獲到的內(nèi)源基因表達(dá)調(diào)控元件獲得表達(dá)的同時(shí) 使內(nèi)源的基因功能喪失 通過(guò)顯微注射或ES細(xì)胞融合技術(shù)可以獲得特定基因缺失的動(dòng)物 用于功能研究 7 基因編碼產(chǎn)物相互作用蛋白的研究 細(xì)胞各種基本功能的完成離不開(kāi)蛋白質(zhì)之間的相互作用以及通過(guò)相互作用而形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物 因此 確定能夠與新基因編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)終產(chǎn)物相互作用的上下游蛋白質(zhì)分子 也是研究新基因功能的一個(gè)十分重要的方面 目前常用的研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)包括傳統(tǒng)的基于親和分析而建立的免疫共沉淀技術(shù)和近年來(lái)建立和廣泛應(yīng)用的酵母雙雜交系統(tǒng)等 免疫共沉淀技術(shù) 免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專(zhuān)一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法 原理 利用標(biāo)簽抗體與融合蛋白攜帶的標(biāo)簽之間的高親和力特性純化和檢出溶液中的靶分子 該方法的優(yōu)點(diǎn)是 相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾 所處環(huán)境條件接近天然狀態(tài)的 能夠反映體內(nèi)相互作用情況 也可分離到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物 但應(yīng)注意 有時(shí)免疫共沉淀的蛋白質(zhì)并非是直接相互作用 而是間接的相互作用 其靈敏度也相對(duì)較低 酵母雙雜交系統(tǒng) 酵母雙雜交系統(tǒng)是一種基于轉(zhuǎn)錄重建而建立的研究生物大分子相互作用的簡(jiǎn)便而有效的研究方法 雙雜交技術(shù)的基礎(chǔ)是在一些轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)與和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域 一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域聯(lián)合一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域有可能在TATA框位置啟動(dòng)RNA聚合酶 復(fù)合體的裝配 引發(fā)轉(zhuǎn)錄過(guò)程 結(jié)構(gòu)域 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)中存在的一些在結(jié)構(gòu)和功能上相對(duì)獨(dú)立的部位 如球形或纖維狀結(jié)構(gòu) 他們介于二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間 激活結(jié)構(gòu)域 指轉(zhuǎn)錄因子中與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體接觸與互作的結(jié)構(gòu)部位 優(yōu)勢(shì) 它可用已經(jīng)克隆的基因從特定細(xì)胞的cDNA表達(dá)文庫(kù)中 釣取 與其編碼產(chǎn)物相互作用的蛋白質(zhì)及相應(yīng)基因序列 它檢測(cè)的相互作用在體內(nèi)發(fā)生 無(wú)需額外的純化步驟 酵母雙雜交系統(tǒng)的局限性 雙雜交體系是在細(xì)胞核內(nèi)分析蛋白質(zhì)之間相互作用的一種方法 而許多蛋白質(zhì)之間的相互作用依賴(lài)于翻譯后的修飾和加工過(guò)程 如糖基化和二硫鍵形成等 這些反應(yīng)