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PCR實用技巧 BIOX.CN 2005-5-13 9:37:19來源：互聯(lián)網(wǎng) 增加PCR的特異性：1.primersdesign這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些條件a.足夠長,18-24bp,以保證特異性.當然不是說越長越好,太長的引物同樣會降低特異性,并且降低產(chǎn)量b.GC%40%60%c.5端和中間序列要多GC,以增加穩(wěn)定性d.避免3端GCrich,最后3個BASE不要有GC,或者最后5個有3個不要是GCe.避免3端的互補,否則容易造成DIMERf.避免3端的錯配g.避免內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)h.附加序列(RTsite,Promotersequence)加到5端,在算Tm值時不算,但在檢測互補和二級結(jié)構(gòu)是要加上它們i.使用兼并引物時,要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3端使用兼并引物,并使用較高的引物濃度(1uM-3uM)j.最好學會使用一種designsoftware.PP5,Oligo6,DNAstar,VectorNTI,Onlinedesginetal.*引物的另一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當50的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55到70。退火溫度一般設定比引物的Tm低5。設定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點?？梢酝ㄟ^分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5，以2為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結(jié)果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5，就會引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比最低的Tm低5或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。2.stabilityofprimers定制引物的標準純度對于大多數(shù)PCR應用是足夠的。引物產(chǎn)量受合成化學的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100M。TE比去離子水好，因為水的pH經(jīng)常偏酸，會引起寡核苷的水解。引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的引物儲存在-20。以大于10M濃度溶于TE的引物在-20可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15到30）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20保存至少1年，在室溫（15到30）最多可以保存2個月。3.optimizereactantsconcentrationa.magnesiomionsMg離子的作用主要是dNTP-Mg與核酸骨架相互作用并能影響Polymerase的活性，一般的情況下Mg的濃度在0.5-5mM之間調(diào)整，同樣要記住的是在調(diào)整了dNTPs的濃度后要相應的調(diào)整Mg離子的濃度，對實時定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液b.其他的離子NH4+K+都會影響PCR，增加K+的濃度后,會因為中和了核酸骨架上磷酸基團的負電荷而影響退火的溫度,從而降低了PCR的嚴謹性(stringency)，NH4+也有相同的作用.MBI公司的TAQ酶就提供了兩種BUFFER,一種是加Mg的一種是已經(jīng)混合了(NH4)2SO4的，當然,過高的陽離子濃度(KCL0.2M)時,DNA在94度根本不會發(fā)生變性,當然也就無從談起PCR了.c.polymerase不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握適合的酶的濃度，一些高保真沒的效率要遠遠低于Taqpolymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些.另外,一般的情況下,變性的溫度可以使用9092度,變性的時間也可以縮短,從而保證polymerase的活性d.template50ulPCRSYSTEM=humangDNA0.1ug-1ugE.Coli10ng-100ngLamadaDNA0.5ng-5ngPlasmidDNA0.1ng-10ng=4.termperaturea.denaturation常規(guī)是94度5分鐘,GCRich的摸板是95度5分鐘除了GCRich外,常規(guī)的APPLICATIONS可以將這部分時間縮短到1到2分鐘,或者在CYCLE1時給予較長的時間,而取消開始的denaturationb.annealing重點到了：一般情況下,是從55度開始.根據(jù)情況配合以Mg離子濃度進行調(diào)整.有條件的可以做gradientpcr.退火的時間在30-60S,時間短一些可以得到更好的效果.因為,polymerase在annealingtemp.時也會有一些活性.所以在A.T.的時間過長,會極大的增加非特異性擴增的風險，另外,在對于一些困難戶,比如從gDNA里擴增大片段,還可使用twostepPCR.5.touchdownPCR原理很簡單,但的確是一個很有用的方法。舉個例子，ANNEALINGTEMP.55度945min9430s6030s721min2cycles9430s5930s721min2cycles9430s5830s721min2cycles9430s5130s721min2cycles9430s5030s721min20cycles725min6.hotstartPCR熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管TaqDNA聚合酶的最佳延伸溫度在72，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進行PCR反應配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如site-directed突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動PCR尤為有效。限制TaqDNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應液，并將其置于預熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴增。熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達到變性溫度。包括延緩加入TaqDNA聚合酶，在反應體系達到90度時，PAUSE，將溫度保持在70度以上，手工加入polymerase，但這個方法過于煩瑣，尤其是對高通量應用，并容易造成污染。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分，入鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。有很多公司提供這樣的酶。=ampliwaxPCRGems(PerkinElmer)TaqBeadHotStartPolymerase(Promega)Magnesiumwaxbeads(Stratagene).=象手動熱啟動方法一樣，蠟防護層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應用。還有一種方法是使用inactiveDNAPolymerase.polymerase被抗體抑制失活，當變性溫度超過70度時，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。7.BoosterPCR我們知道1ughumangenomicDNA大約在3X105冪個模板分子,這樣的模板分子數(shù)目可以是引物與模板很好的結(jié)合.當模板的濃度過低,比如低于100個分子時,引物和模板之間就很難發(fā)生反應.引物容易自身進行反應形成二聚體.這樣就有來了個boosterPCR我一直找不到合適的詞來翻譯這個booster.具體是這樣的.開始幾個cycles保持primer的低濃度,保證primer:template的molarratio在107108.以確保開始擴增的準確性.然后boostePrimer的濃度到正常的水平8.循環(huán)數(shù)和長度確定循環(huán)數(shù)的基本原理是:產(chǎn)物能夠保證你進一步分析操作的最小循環(huán)數(shù).因為過多的循環(huán)數(shù)容易造成ERRORS和非特異性產(chǎn)物的積累產(chǎn)物的量不夠,優(yōu)化的方法有:1.增加TEMPLATE2.增加循環(huán)數(shù)如何確定循環(huán)數(shù),有一個方法.做一個PCR體系,40循環(huán),50ul,分別在20,25,30,35循環(huán)時從體系中取5ul,一起跑電泳分析.從而確定最佳的循環(huán)數(shù)另一個會影響PCR特異性的是PCRcycling時在兩個溫度間變化的速率(rampingrate).當然是越高越好.不過咱們大部分條件有限,就那么幾臺PCR儀,也沒有多少挑選的余地9.thermalcyclerPCR儀的因素我們經(jīng)常容易忽視.長時間的使用后需要調(diào)整PCR儀,以保證其能夠到達正確的溫度.現(xiàn)在的PCR儀基本上都有自檢功能(self-diagnosis).10.PCRadditives附加物或者說enhancer實在是多種多樣.基本上包括幾類,能夠增加反應退火效率的化學因子,DNA結(jié)合蛋白和一些商業(yè)試劑.基本的原理不外是增加引物退火特異性,減少錯配,增加產(chǎn)物的長度和產(chǎn)量.在GCRich情況中,additive可以造成配對堿基間的的不穩(wěn)定,從而提高擴增的效率.而在另一種情況下,additive由于造成錯配的primer-template復合物的極大的不穩(wěn)定,而提高了擴增的忠實性.要注意的是,沒有萬能的enhancer全部通用,需要你根據(jù)自己的情況,最好結(jié)合gradientpcr選擇最優(yōu)條件.=dimethylsulfoxide(DMSO)upto10%formamideat5%trimethylammoniumchloride10-100uMdetergentssuchasTween200.1-2.5%polyethyleneglycol(PEG)60005-15%glycerol10-15%singlestrandedDNAbindingproteinsGene32protein1nME.colisingle-strandedDNAbindingprotein5uM7deaza-dGTP(forGCrich)150uMwith50uMdGTPTaqExtender(stratagene)PerfectMatchPCREnhancer(stratagene)Q-solution(Qiagen)=要注意的是,DMSO,GLYCEROL等會抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最適的濃度11.TemplateDNApreparation提取DNA時的試劑會抑制PCR反應的順利進行.因此需要對TEMPLATEDNA進行純化.特別是SDS(0.01%)的情況下就能強烈抑制PCR的進行.可以加入一些nonionic試劑,如Tween,Nonid,Trition之類的反過來抑制SDS.還有proteinaseK也要除干凈,不然會降解polymerase.12.NestedPCR簡單點說設計兩對引物,一對是長的,一對是包含在長引物內(nèi)的,用長引物擴增的產(chǎn)物作為第二次擴增的模板,這樣可以增加產(chǎn)物的量.而且可以減少非特異性帶和錯配的情況.增加PCR的保真性高保真酶高溫DNAPOLYMERASE是以單鏈DNA或RNA為模板，在dNTP和一些陽離子的存在情況下，在特定的引物指導下按3-5方向合成DNA.包括3種類型a.5-3方向的DNA合成能力,沒有3-5方向的外切酶特性.如Taq及其突變體.這類酶的合成能力強,因為他不糾正合成中出現(xiàn)的突變b.與a類似,有合成活性,沒有3-5的外切活性.但他們能以RNA為模板,合成DNA.如TthDNAPolymerasec.有DNA聚合活性,沒有逆轉(zhuǎn)錄活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfuDNAPolymerase.可以提高忠實性。但是這些聚合酶的產(chǎn)量比TaqDNA聚合酶低。酶的混合物將TaqDNA聚合酶同帶有3到5外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨TaqDNA聚合酶高的忠實性，并可以得到高產(chǎn)量及擴增長模板。其他因素除了酶，高濃度的dNTP或鎂離子會降低忠實性。將dNTP的濃度從200M降低到25-50M可以增加精確度如果四種核苷的濃度不同，忠實性會受影響。進行較少的PCR循環(huán)也會有助于增加忠實性，因為增加循環(huán)數(shù)目和產(chǎn)物長度就會增加突變可能性。1簡介寡聚核苷酸引物的選擇，通常是整個擴增反應成功的關(guān)鍵。所選的引物序列將決定PCR產(chǎn)物的大小、位置、以及擴增區(qū)域的Tm值這個和擴增物產(chǎn)量有關(guān)的重要物理參數(shù)。好的引物設計可以避免背景和非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，甚至在RNA-PCR中也能識別cDNA或基因組模板。引物設計也極大的影響擴增產(chǎn)量：若使用設計粗糙的引物，產(chǎn)物將很少甚至沒有；而使用正確設計的引物得到的產(chǎn)物量可接近于反應指數(shù)期的產(chǎn)量理論值。當然，即使有了好的引物，依然需要進行反應條件的優(yōu)化，比如調(diào)整Mg2+濃度，使用特殊的共溶劑如二甲基亞砜、甲酰胺和甘油。計算機輔助引物設計比人工設計或隨機選取更有效。一些影響PCR反應中引物作用的因素諸如溶解溫度、引物間可能的同源性等，易于在計算機軟件中被編碼和限定。計算機的高速度可完成對引物位置、長度以及適應用戶特殊條件的其他有關(guān)引物的變換可能性的大量計算。通過對成千種組合的檢測，調(diào)整各項參數(shù)，可提出適合用戶特殊實驗的引物。因此通過計算機軟件選擇的引物的總體“質(zhì)量”（由用戶在程序參數(shù)中設定）保證優(yōu)于通過人工導出的引物。需要指出的是，引物不必與模板完全同源，因此可包含啟動子序列、限制酶識別位點或5端的各種修飾，這種對引物的修飾不會妨礙PCR反應，而會在以后使用擴增子時發(fā)揮作用。2基本PCR引物設計參數(shù)引物設計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。特異性是指發(fā)生錯誤引發(fā)的頻率。特異性不好或劣等的引物會產(chǎn)生額外無關(guān)和不想要的PCR擴增子，在EB染色的瓊脂糖凝膠上可見到；引物效率是指在每一PCR循環(huán)中一對引物擴增的產(chǎn)物與理論上成倍增長量的接近程度。引物長度；特異性一般通過引物長度和退火溫度控制。如果PCR的退火溫度設置在近于引物Tm值（引物/模板雙鏈體的解鏈溫度）幾度的范圍內(nèi)，18到24個堿基的寡核苷酸鏈是有很好的序列特異性的。引物越長，擴增退火時被引發(fā)的模板越少。為優(yōu)化PCR反應，使用確保溶解溫度不低于54的最短的引物，可獲得最好的效率和特異性?？偟膩碚f，最好在特異性允許的范圍內(nèi)尋求安全性。每增加一個核苷酸，引物特異性提高4倍；這樣，大多數(shù)應用的最短引物長度為18個核苷酸。引物設計時使合成的寡核苷酸鏈（1824聚物）適用于多種實驗條件仍不失為明智之舉。引物的二級結(jié)構(gòu)包括引物自身二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物間二聚體等。這些因素會影響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率。對于引物的3末端形成的二聚體，應控制其G大于-5.0kcal/mol或少于三個連續(xù)的堿基互補，因為此種情形的引物二聚體有進一步形成更穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的可能性，引物中間或5端的要求可適當放寬。引物自身形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，也以3端或近3端對引物-模板結(jié)合影響更大；影響發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補配對的鍵能之外，與莖環(huán)結(jié)構(gòu)形式亦有很大的關(guān)系。應盡量避免3末端有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物。引物GC含量和Tm值PCR引物應該保持合理的GC含量。含有50的G+C的20個堿基的寡核苷酸鏈的Tm值大概在5662范圍內(nèi)，這可為有效退火提供足夠熱度。一對引物的GC含量和Tm值應該協(xié)調(diào)。協(xié)調(diào)性差的引物對的效率和特異性都較差，因為降低了Tm值導致特異性的喪失。這種情況下引物Tm值越高，其錯誤引發(fā)的機率也越大。若采用太高的退火溫度，Tm值低的引物對可能完全不發(fā)揮作用。在從一批在特定序列范圍內(nèi)已合成好的寡核苷酸中選擇一對新的引物時，這種GC含量和Tm值的協(xié)調(diào)非常關(guān)鍵。一般來說，一對引物的Tm值相差盡量不超過23攝氏度，同時引物和產(chǎn)物的Tm值也不要相差太大，20攝氏度范圍內(nèi)較好。引物的額外序列與退火溫度若有額外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶結(jié)合位點、限制酶切位點或者GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以使用加長的引物。一般說來，引物5端添加無關(guān)序列不會影響引物特異序列的退火。有時候，引物中添加了大量與模板不配對的堿基，可以在較低退火溫度的條件下進行4到5個擴增循環(huán)；然后在假定引物5端序列已經(jīng)加入到模板中，計算得出的退火溫度下進行其余的循環(huán)。在引物上添加限制酶位點時一個重要的考慮是大多數(shù)限制酶的有效切割要求在它們的識別序列的5端有2至3個非特異的額外堿基，這樣就會增加引物的非模板特異序列的長度。長引物序列的另一個缺點是影響溶解溫度的精確計算，而這對于確定PCR反應時的退火溫度又是必須的。對于低于20個堿基的引物，Tm值可以根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)計算。而對于較長的引物，Tm值需要考慮動力學參數(shù)、從“最近鄰位”的計算方式得到，現(xiàn)有的PCR引物設計軟件大多數(shù)都采用這種方式。引物的3末端核苷酸組成引物3末端和模板的堿基完全配對對于獲得好的結(jié)果是非常重要的，而引物3末端最后5到6個核苷酸的錯配應盡可能的少。如果3末端的錯配過多，通過降低反應的退火溫度來補償這種錯配不會有什么效果，反應幾乎注定要失敗。引物3末端的另一個問題是防止一對引物內(nèi)的同源性。應特別注意引物不能互補，尤其是在3末端。引物間的互補將導致不想要的引物雙鏈體的出現(xiàn)，這樣獲得的PCR產(chǎn)物其實是引物自身的擴增。這將會在引物雙鏈體產(chǎn)物和天然模板之間產(chǎn)生競爭PCR狀態(tài)，從而影響擴增成功。引物3末端的穩(wěn)定性由引物3末端的堿基組成決定，一般考慮末端5個堿基的G。此值的大小對擴增有較大的影響，負值大，則3末端穩(wěn)定性高，擴增效率更高，同時也更易于異位引發(fā)。需要注意的是，引物3末端應盡量避免T。實驗證明，以T結(jié)尾的引物即使與T,G或C錯配仍可有效延伸。PCR產(chǎn)物的長度及在耙序列內(nèi)的位置所有的計算機程序都提供對PCR產(chǎn)物長度范圍的選擇。一般說來，PCR產(chǎn)物長度對擴增效率有影響。特定的應用情況下，PCR產(chǎn)物長度部分取決于模板材料。預期產(chǎn)物的特定長度經(jīng)常取決于應用的需要。若目的是建立測定特異DNA片段的臨床檢驗方法，120300bp的小DNA擴增產(chǎn)物可能是最好的。產(chǎn)物應具有好的特異性和高的產(chǎn)生效率，并含有能用于探針捕捉雜交實驗的足夠信息。這一長度范圍的產(chǎn)物可以通過采用兩步擴增循環(huán)方法得到，從而減少擴增時間。其他PCR方法有不同的最佳產(chǎn)物長度。例如，通過定量的RNA-PCR檢測基因表達時，產(chǎn)物應該足夠大以便構(gòu)成競爭性模板，這樣，產(chǎn)物和競爭物都能夠在凝膠上很容易的分辨出來。這些產(chǎn)物一般在250750bp范圍內(nèi)。補充說明若在cDNA序列內(nèi)找尋PCR引物，需特別注意兩點：首先，盡力將引物和產(chǎn)物保持在mRNA的編碼區(qū)域內(nèi)，因為這是生成蛋白質(zhì)的獨特序列，不像3末端非編碼區(qū)域與許多其他mRNA有同源性；第二，盡力把引物放在不同的外顯子上，以便使RNA特異的PCR產(chǎn)物與從污染DNA中產(chǎn)生的產(chǎn)物在大小上相區(qū)別。若PCR