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分子生物學實驗基礎知識分子生物學是在生物化學基礎上發(fā)展起來的，以研究核酸和蛋白質結構、功能等生命本質的學科，在核酸、蛋白質分子水平研究發(fā)病、診斷、治療和預后的機制。其中基因工程（基因技術，基因重組）是目前分子生物學研究熱點，這些技術可以改造或擴增基因和基因產物，使微量的研究對象達到分析水平，是研究基因調控和表達的方法，也是分子水平研究疾病發(fā)生機制、基因診斷和基因治療的方法。轉化（transformation）、轉染、轉導、轉位等是自然界基因重組存在的方式，也是人工基因重組常采用的手段?；蛑亟M的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解為以一分子基因為模板擴增得到的與模板分子結構完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混雜的目的基因易于純化，得以增量，便于分析。 外來基因引起細胞生物性狀改變的過程叫轉化（transformation），以噬菌體把外源基因導入細菌的過程叫轉染（transfection）。利用載體（噬菌體或病毒）把遺傳物質從一種宿主傳給另一種宿主的過程叫轉導（transduction）。一個或一組基因從一處轉移到基因組另一處的過程叫轉位（transposition），這些游動的基因叫轉位子。一、基因工程的常用工具（一）載體載體（Vector）是把外源DNA（目的基因）導入宿主細胞，使之傳代、擴增、表達的工具。載體有質粒（plasmid）、噬菌體、單鏈絲狀噬菌體和粘性末端質粒（粘粒）、病毒等。載體具有能自我復制；有可選擇的，便于篩選、鑒定的遺傳標記；有供外源DNA插入的位點；本身體積小等特征。質粒存在于多種細菌，是染色體（核）以外的獨立遺傳因子，由雙鏈環(huán)狀DNA組成，幾乎完全裸露，很少有蛋白質結合。質粒有嚴緊型和松弛型之分。嚴緊型由DNA多聚酶復制，一個細胞可復制1-5個質粒。而松弛型由DNA多聚酶復制，一個細胞可復制30-50個質粒，如果用氯霉素可阻止蛋白質合成，使質粒有效利用原料，復制更多的質粒。質粒經(jīng)過改造品種繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。這些質粒都含有多個基本基因，如復制起動區(qū)（復制原點Ori），便于復制擴增；抗抗生素標記（抗氨芐青霉素Apr、抗四環(huán)素Tcr等）或大腸埃希菌部分乳糖操縱子（E.coli LacZ）等，便于基因重組體的篩選；基因發(fā)動子（乳糖操縱子Lac、色氨酸操縱子Trp等）和轉錄終止序列，便于插入的外源基因轉錄、翻譯表達。質粒上還有許多限制性內切酶的切點，即基因插入位點，又叫基因重組位點，基因克隆位點。常用噬菌體載體有單鏈噬菌體M13系統(tǒng)；雙鏈噬菌體系統(tǒng)。噬菌體應和相應的宿主細胞配合使用。以上載體各有特點，便于選擇，靈活應用。（二）工具酶工具酶是基因重組技術不可缺少的工具。主要有限制性內切酶、連接酶、核酸聚合酶、逆轉錄酶、核酸酶等。限制性內切酶有型和型限制性DNA內切酶之分，型能嚴格識別核酸序列，并在識別區(qū)內特定的核苷酸處切開DNA雙鏈。故通常所指都是型限制性DNA內切酶。識別分四核苷酸和六核苷酸，其序列旋轉對稱。切口分開端和粘端，產生3OH和5P末端。內切酶品種多，使用時應注意溫度、緩沖液用量（一般1g DNA/2-5單位酶）等反應條件。酶識別序列切口Alu AGCTAG CT四核苷酸TCGATC GA平端切口Eco R1GAATTCG AATTC六核苷酸CTTAAGCTTAA G粘端切口連接酶有T4噬菌體DNA連接酶、T4噬菌體RNA連接酶、大腸埃希菌DNA連接酶等。DNA連接酶可連接平端，也連接粘端。反應需有Mg2+和ATP存在，pH7.5-7.6。最適溫度37，30以下活性明顯下降，但考慮到被連接DNa 的穩(wěn)定性和粘性末端的退火溫度，一般平端連接用20-25，粘端連接用12左右。聚合酶有DNA聚合酶（以DNA為模板合成DNA大腸埃希菌DNA聚合酶，大腸埃希菌DNA聚合酶大片段（Klenow大片段），T4或T7噬菌體DNA聚合酶等）；RNA聚合酶（以DNA為模板合成RNA，T7或T3噬菌體RNA聚合酶）；逆轉錄酶（以RNA為模板合成DNA，除RNA病毒中發(fā)現(xiàn)外，發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶都有逆轉錄活性）。大腸埃希菌DNA聚合酶具有53聚合酶活性和53，35外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶被枯草桿菌酶作用產生的一個大片段，有53聚合酶和53外切酶活性，無35外切酶活性。可用于缺口翻譯（Nick translation）法標記核酸，也可用于DNA序列測定，修補DNA鏈等。核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相應的DNA和RNA，核酸酶S1可降解單鏈DNA和RNA，用量增大也可降解雙鏈核酸。它可用于切去ds-cDNA合成中產生的發(fā)夾環(huán)。末端轉移酶在Mg2+存在下，選擇3OH端單鏈DNA為引物加成核苷酸，在Co2+存在下，選擇3OH端雙鏈DNA為引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。常用于核酸末端標記和核酸連接的互補多聚尾（連接器）。堿性磷酸酶去除5P，可防止二分子DNA片段5端P基團自身空間障礙，影響DNA分子之間的連接，一般用堿性磷酸酶處理載體DNA除去5端P基團，在連接酶作用下目的基因的5端P先與載體3端OH連接，再通過復制修復另一條鏈，使二條鏈完全連接。該方法大大提高了連接效率（圖18-1）。圖18-1經(jīng)堿性磷酸酶處理后載體DNA與目的基因DNA的連接二、目的基因常把需研究的基因稱為目的基因，需分析的基因稱靶基因，在基因克隆過程中有時兩者均稱為插入基因，有時三者含義相近。簡單的原核生物目的基因可從細胞核中直接分離得到，但人類的基因分布在23對染色體上，較難從直接法得到。簡短的目的基因可在了解一級結構或通過了解多肽鏈一級結構氨基酸編碼的核苷酸序列基礎上人工合成。但多數(shù)的目的基因由mRNA合成cDNA（complementary DNA，反轉錄DNA）得到。CDNA通過各種方式與載體連接，克隆可得到全長cDNA或片段，用于探針制備、序列分析、基因表達等研究。因此以cDNA為研究材料反映了mRNA的轉錄及對以后翻譯的影響情況，即反映某一基因（DNA）外顯子的情況。（圖18-2）圖18-2目的基因cDNA的合成三、基因庫的建立建立基因庫的目的是為了便于目的基因的保存、擴增和純化?；驇焓抢霉ぞ呙?，通過基因重組技術和轉化、篩選而建立，也是基因克隆的過程。實際上是利用低等生物如細菌、病毒、噬菌體等生長快，繁殖力強的特點，而作為一種核酸擴增篩選的載體，把人類等高等生物的基因或其片段用工具酶插入，重組于其中，經(jīng)篩選，克隆得到目的基因與載體重組的重組基因，成為便于保存，取用方便的基因庫。基因庫交流是研究室之間交流目的基因的常用方式。（一）基因重組基因重組方案很多，簡單的可用同一種限制性內切酶分別在載體和目的基因切出相對應的切口，便于連接。也可用末端連接酶合成連接器（圖18-3）。近年，Okayama方案為實驗室普遍采用，該方法可得到全長的cDNA。（二）轉化轉化目的是把有復制能力，但在細胞外無復制活性的目的基因-載體重組體裝入細胞（大腸埃希菌），使目的基因隨載體在細胞內復制、擴增。實驗步驟介紹如下：圖18-3基因重組方案之一大腸埃希菌的處理（增加細胞膜通透性，便于基因進入細胞）大腸埃希菌（E.Coli cells）接種于Lb agar培養(yǎng)基，37培養(yǎng)一晚。挑選35個大菌落，接種于50ml LB培養(yǎng)基，37，振搖培養(yǎng)一晚后，在A550測定，要求細菌繁殖一定量（一般為細菌對數(shù)生長期），野生型（rec，5x107cells/ml）為0.2-0.3，缺陷型（rec-，5x107cells/ml）為0.5-0.6。離心棄去上清液，用20ml，50mmol/L，CaCl2懸浮菌體。冰浴20分鐘，低溫離心。棄上清液，用2.5ml冰50mmol/l CaCl2懸浮。4可保存48小時，用于轉化，稱competent cells。質粒（如經(jīng)基因重組建立的重組質粒，基因庫等）的轉化將competent cells（以美國BRL公司DH10B菌株為例）置冰水浴。同時將Falcon2059（傳熱系數(shù)穩(wěn)定）塑料試管置冰水浴。取100l菌液（DH10B）于2059試管中，加10倍稀釋的巰基乙醇1l，冰浴輕搖2分鐘，放置10分鐘。取0.1-50ng質粒加入試管，輕輕搖勻，冰浴30分鐘。此間備好42水浴。并將SOC培養(yǎng)基置42備用。將試管置于42，輕搖45秒鐘，馬上置冰浴2分鐘。使competent cells熱脹冷縮，把質粒導入菌體。加42SOC培養(yǎng)基0.9ml于試管，37培養(yǎng)1小時。1000rpm離心10分鐘，棄上清液，用200lSOC培養(yǎng)基懸浮菌體。接種于LB-氨芐青霉素（100U/ml）培養(yǎng)皿，37培養(yǎng)一晚。已轉化的菌體可形成菌落（因質粒上有抗氨芐青霉素基因）。在了解目的基因或其產物的基礎上對菌落進行鑒定。并在LB培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)?；驇斓慕?、轉化、篩選、擴增、純化的過程就是基因克隆的過程。LB培養(yǎng)基（1L）：10g蛋白胨，5g酵母膏，10g NaCl，高壓滅菌，pH7.5。SOB培養(yǎng)基（1L）：20g蛋白胨，5g酵母膏，0.5g NaCl，高壓滅菌。另外準備2mol/L鎂溶液（1mol/L氯化鎂與1mol/L硫酸鎂等量混勻，過濾滅菌），臨用前加1ml于100ml培養(yǎng)基。SOC培養(yǎng)基（100ml）：臨用前加入1ml過濾滅菌的2mol/L葡萄糖。四、核酸的分離與純化核酸存在于多種細胞，如病毒、細菌、寄生蟲、動植物細胞；多種標本中，如血液、組織、唾液、尿液等其它來源的標本。因此分離方法復雜而多樣。又因各種DNA、RNA的豐度差異，各種分析方法對核酸的純度與量的要求有差異，因此在實驗前應對采用的方法有所了解和選擇?？偟恼f來核酸的分離與純化是在溶解細胞的基礎上，利用苯酚等有機溶劑抽提（核酸溶于緩沖液，即水相），分離，純化；乙醇、丙酮等有機溶劑沉淀，收獲。溶解細胞的方法因標本不同而不同，有用SDS加NaOH，有用蛋白酶，有的用超聲波破碎等方法，苯酚提取主要使蛋白質變性沉淀于有機相，而核酸保留在水相，達到分離核酸的目的。實驗上生物標本中含量最多的就是蛋白質。為了除去分離過程中殘留的有機溶劑，常用的方法是加冷乙醇和鹽沉淀核酸，通過離心回收核酸，然后用70-80乙醇洗滌沉淀，除去多余的鹽，以免影響核酸溶解和抑制后續(xù)步驟的酶促反應。為了得到純的核酸可用蛋白酶除去蛋白，用RNA酶除去RNA，得到純的DNA，用DNA酶除去DNA而獲得RNA。目前開發(fā)了許多商品化的核酸分離柱，可簡單、快速地分離得到純度很高的DNA或RNA。其分離原理有的利用核酸的分子量差異，有的利用需分離核酸的特點與其特異性結合達到分離、回收的目的。（一）質粒的分離與純化含質粒的E. Coli cells經(jīng)LB培養(yǎng)液250ml擴大培養(yǎng)，倒入50ml離心管，4，3000rpm，離心15分鐘。棄去上清液。（棄去液丟棄前應作消毒處理，以免污染環(huán)境）。加lysis buffer(50mmol/L Glucose，10mmol/l EDTA，25mmol/l Tris-HCl，pH8.0)1-2ml使之懸浮。放置室溫5分鐘，加3.5-7ml新配制SDS/NaOH溶液（1mol/l NaOH 8ml，20SDs 2ml，蒸餾水30ml）上下?lián)u勻，置冰水浴5分鐘。禁用混勻器，以免DNA分子斷裂），加2.5mol/L醋酸鉀緩沖液（pH4.8）2.6-5.2ml，上下?lián)u勻，冰浴5分鐘。4，3000rpm，離心15分鐘。沉淀蛋白質。取上清液，加無水乙醇12-24ml（上清液的二倍）放室溫15分鐘后，10000rpm離心，棄上清液。加約為沉淀物體積的0.4倍TE（10mmol/l Tris-Hcl pH8.0，10mmol/l EDTA）溶解沉淀后，加0.2倍的7.5mol/L醋酸銨?？捎没靹蚱骰靹颍帽?0分鐘。4，10000rpm離心5min，棄上清液。加沉淀物0.4倍的10mmol/l Tris-HCl pH7.5，10mmol/l EDTA緩沖液，1/10體積的5mg/ml RNase，37，30分鐘保溫。加等量的phenol（酚）/CIAA(480ml氯仿，20ml異戊醇)，混勻。4，10000rpm，離心5分鐘。取上層液加酚/CIAA重復一次。取上層液加1/10體積5mol/l NaCl和2倍無水乙醇，20過夜或702小時以上。4，10000rpm，離心10分鐘，棄上清液。加80乙醇不搖動，直接10000rpm離心，棄上清液，真空干燥。加適量（約200l）TE溶解。測定含量后備用。（二）重組質粒中目的基因的分離與純化先取少量純化的重組質粒，用限制性內切酶切出目的基因，經(jīng)電泳分離，確認。以200l含2mg DNA（重組質粒）為例：取10l含100g DNA，加90l TE。按1g DNA加2-5U限制性內切酶，1/10體積緩沖液，1-2小時保溫。緩沖液種類和酶反應溫度因內切酶種類而異。1/10體積3mol/l NaAc，2倍無水乙醇，70，2小時（20過夜），10000rpm，10分鐘離心，棄上清液（乙醇沉淀）。適量TE溶解沉淀（切斷的DNA質粒與目的基因混合物），電泳分離（用相應分子量DNA標準同時電泳），在紫外光下觀察結果，與標準DNA分子量比較，確認目的基因和內切酶的切割效果。電泳條件：凝膠制備：1瓊脂糖凝膠agarose(mg)X50TAE(ml)EB(溴化乙錠l)(agarose)10002.04.0總體積（ml）100膠濃度（）：0.30.60.70.91.21.52.0DNA長度（kb）：60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1電泳緩沖液：X50TAE(ml)EB(l)總體積(ml)20301000X50TAE：Trisma base 54g；乙酸57.1ml；0.5m EDTA pH8.0 20ml；蒸餾水至1000ml。EB：10mg/ml ethidium bromide。(EB有致癌性，操作應小心)。經(jīng)電泳確認后，取適量DNA（重組質粒）同上條件切開，用1.5低熔點（65熔解）瓊脂糖凝膠，電泳分離。在紫外光下，切出含目的基因區(qū)帶（凝膠），放入離心管中，提取純化。從低熔點凝膠提取，純化DNA片段加與凝膠體積相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65水浴5分鐘保溫，使凝膠完全溶解。待放至室溫，加等量酚（TE飽和，TE封在上層，取下層酚），輕輕混勻（不用混勻），12000rpm，3分鐘離心。反復1-2次。取上層液，加0.1體積3mol/L醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積無水乙醇，進行乙醇沉淀。將純化的DNA加適量TE溶解，測定含量，備用（可用于目的基因結構分析，探針制備等）。除低熔點凝膠回收法外，如用一般凝膠可用透析帶短暫電泳，離心管低部加玻璃棉，高速離心等方法回收DNA片段。（三）標本DNA的分離與純化用5-10ml 1xNTE(NaCl 100mmol/L ,Tris-HCl 10mmol/l pH7.4，EDTa 1mmol/L pH8.0)調整細胞為2107個（組織應切碎置液氮冰凍，高速攪切成粉末后，加入緩沖液）。加1/10-1/20體積（V）10mg/ml蛋白酶（Sigma 型），1/20v 10SDS，372小時。加等量酚/3xNTE(3xNTE上封)混勻（至少7分鐘）。4，3000rpm，10分鐘。取上清液，加2ml TE(Tris-HCl 10mmol/L pH7.5，EDTa 1mmol/L pH8.0)，充分混勻。乙醇沉淀。2mlTE溶解沉淀。加1/30xNTE，蛋白酶K(10mg/ml)代替蛋白酶重復2-4步驟。測定含量。（四）樣品RNA的分離，純化含106個細胞液加等量純化溶液4mol/L胍基硫氰酸鹽，25mmol/L檸檬酸pH7.0，0.5肌氨酸（sarcosyl），0.1mol/l 2-巰基乙醇。總體積為細胞沉淀4-5倍，混勻。加0.1體積2ml/L乙酸鈉（pH4.1），1體積酚（重蒸水上封），0.2體積CIAA，混勻器劇烈混合10秒鐘。冰水浴15分鐘。10000xg4，20分鐘。離心（不用剎車）。小心取出上清液。加等量丙酮（或2倍乙醇），20，60分鐘以上。10000xg，4，20分鐘離心。棄上清液。用1.5ml離心管約加0.3ml純化溶液，重復3)步驟，離心10分鐘，棄上清液。加75乙醇，10000xg，4，10分