酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)基本原理與結(jié)果解釋.doc

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）基本原理與結(jié)果解釋基本原理：一、包被1、固相載體的要求（1）、結(jié)合抗體或抗原的容量大 （2）、抗體或抗原牢固地固定在其表面 （3）、不影響免疫反應(yīng)性 （4）、利于反應(yīng)充分進(jìn)行 （5）、固相方法簡(jiǎn)便易行，快速經(jīng)濟(jì)2、固相載體的材料：聚笨乙烯3、包被coating將抗原或抗體結(jié)合于固相載體。4、封閉blocking用1%5%的牛血清白蛋白或5%20%小牛血清消除固相載體表面未結(jié)合的位點(diǎn)，消除非特異性吸附。二、反應(yīng)加入待測(cè)抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體。標(biāo)記酶的要求：(1)、活性高(2)、性質(zhì)穩(wěn)定(3)、專一性強(qiáng)(4)、酶催化底物的顯色信號(hào)易于判斷和測(cè)量(5)、方法敏感，重復(fù)性好，簡(jiǎn)單易行(6)、酶的底物易于配制保存，酶及底物價(jià)廉 常用酶辣根過氧化物酶HRP（ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記用酶）三、洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離。四、底物顯色 HRPDH2+H2O2 D+2H2O H2O2為受氫體，HRP對(duì)受氫體的專一性很高。供氫體DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種。常用底物：四甲基聯(lián)苯胺TMB四甲基聯(lián)苯胺TMB是ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。TMB反應(yīng)后顯藍(lán)色 ，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測(cè)定波長(zhǎng)450nm ，穩(wěn)定，無致癌性。常用方法與原理一、雙抗體夾心法方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色應(yīng)用： 二價(jià)或二價(jià)以上的較大分子抗原測(cè)定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等二、雙抗原夾心法原理：類似雙抗體夾心法操作步驟：類似雙抗體夾心法應(yīng)用：乙型肝炎表面抗體三、競(jìng)爭(zhēng)法（測(cè)抗原）方法：用已知抗體包被，加入待測(cè)血清，再加酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與待檢物競(jìng)爭(zhēng)與包被物結(jié)合。加底物顯色。應(yīng)用：用于只有一個(gè)抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）四、競(jìng)爭(zhēng)法（測(cè)抗體）原理：類似檢測(cè)抗原的競(jìng)爭(zhēng)法應(yīng)用：乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)的檢測(cè) 五、間接法方法： 用已知抗原包被，加入待測(cè)血清，再加酶標(biāo)的抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點(diǎn)： 一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體。應(yīng)用： 常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測(cè)定。六、捕獲法方法：抗人IgM鏈抗體包被捕獲待測(cè)標(biāo)本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標(biāo)記特異性抗原的抗體底物顯色應(yīng)用：病原體急性感染診斷中的IgM型抗體、甲型肝炎HAV-IgM抗體 、乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體常見乙肝兩對(duì)半結(jié)果解釋結(jié)果模式HBsAg抗HBsHBeAg抗HBe抗HBc-Igm結(jié)果解釋1陽(yáng)性+陰性-陽(yáng)性+陰性-陽(yáng)性+俗稱三大陽(yáng)說明患者是慢性肝炎，有傳染性。處于活動(dòng)期2陽(yáng)性+陰性-陰性-陰性-陽(yáng)性+急性乙肝感染階段或是慢性乙肝表面抗原攜帶者，傳染性弱些3陽(yáng)性+陰性-陰性-陽(yáng)性+陽(yáng)性+乙肝已趨向恢復(fù)，屬于慢性攜帶者，傳染性弱，長(zhǎng)期持續(xù)此狀態(tài)可轉(zhuǎn)變?yōu)楦伟?陰性-陽(yáng)性+陰性-陰性-陽(yáng)性+既往感染過乙肝，現(xiàn)仍有免疫力，屬于不典型恢復(fù)期。也可能為急性乙肝感染期5陰性-陰性-陰性-陽(yáng)性+陽(yáng)性+既往有乙肝感染，屬于急性感染恢復(fù)期，少數(shù)人仍有傳染性6陰性-陰性-陰性-陰性-陽(yáng)性+過去有乙肝感染或現(xiàn)在正處于急性感染7陰性-陽(yáng)性+陰性-陰性-陰性-以前打過乙肝疫苗或以前感染過乙肝8陰性-陽(yáng)性+陰性-陽(yáng)性+陽(yáng)性+急性乙肝恢復(fù)期，以前惑染過乙肝9陽(yáng)性+陰性-陰性-陰性-陰性-急性感染早期或者慢性乙肝表面抗原攜帶都傳染性弱。10陽(yáng)性+陰性-陰性-陽(yáng)性+陰性-慢性乙肝表面抗原攜帶者易轉(zhuǎn)陰或者是急性