牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)中的作用.doc

一、 牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的主要功能牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細(xì)胞生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。1.提供對(duì)維持細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)的激素，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒(méi)有或量很少的營(yíng)養(yǎng)物，以及主要的低分子營(yíng)養(yǎng)物。2. 提供結(jié)合蛋白，能識(shí)別維生素、脂類(lèi)、金屬和其他激素等，能結(jié)合或調(diào)變它們所結(jié)合的物質(zhì)活力。3.有些情況下結(jié)合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱原質(zhì)結(jié)合，起到解毒作用。4.是細(xì)胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子來(lái)源。5.起酸堿度緩沖液作用。6.提供蛋白酶抑制劑，使在細(xì)胞傳代時(shí)使剩余胰蛋白酶失活，保護(hù)細(xì)胞不受傷害。二、 牛血清的主要成份血清是一種很復(fù)雜的混合物，其組成成份雖大部分已為人所知，但還有一部分尚不清楚，而且血清組成及含量常隨供血?jiǎng)游锏男詣e、年齡、生理?xiàng)l件和營(yíng)養(yǎng)條件不同而異。1.蛋白質(zhì)是牛血清中主要成份。除包括可攜帶金屬離子、脂肪酸和自身是激素類(lèi)蛋白外主要還有白蛋白，球蛋白。纖維粘連素 細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞附著；2 巨球蛋白 抑制胰蛋白酶的作用；胎牛血清中含胎球蛋白 促細(xì)胞附著；轉(zhuǎn)鐵蛋白 能結(jié)合鐵離子，減少其毒性和被細(xì)胞利用。2.多肽：血小板促生長(zhǎng)因子能促細(xì)胞分裂，是多肽家庭的主要成員之一，是主要的促細(xì)胞增殖因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，血清中含量雖很少，但對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)也有一定作用。3.激素：激素對(duì)細(xì)胞的作用是多方面的。胰島素：促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖和氨基酸，與促細(xì)胞分裂有關(guān)。類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子：能與細(xì)胞表達(dá)的胰島素受體結(jié)合，從而有胰島素同樣的作用。促生長(zhǎng)激素：促細(xì)胞增殖效應(yīng)。氫化可的松：血清中含有定量的該成分，它可能兼有促細(xì)胞貼附和增殖作用，但有人證明，血清中的氫化可的松，如細(xì)胞密度高時(shí)可能有抑制細(xì)胞的作用和誘導(dǎo)其發(fā)生分化。4其他成份氨基酸、葡萄糖、酮酸等對(duì)多種營(yíng)養(yǎng)成分的合成培養(yǎng)基意義不大。與蛋白相結(jié)合狀態(tài)的微量元素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有意義。三、 牛血清的質(zhì)量要求隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和生活水平的不斷提高對(duì)生物醫(yī)藥產(chǎn)品的質(zhì)量要求也越來(lái)越高，所以對(duì)制備工藝中所涉及到的各種原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求也越來(lái)越高，特別是對(duì)用于細(xì)胞培養(yǎng)基中的主要天然成份牛血清的質(zhì)量要求也不斷提高。牛血清包括胎牛血清、新生牛血清和成牛血清。（一）、WHO公布的用動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程中的要求：1. 牛血清必須來(lái)自有文件證明無(wú)牛海綿狀腦病的牛群或國(guó)家。并應(yīng)具備適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測(cè)系統(tǒng)。2.有些國(guó)家還要求牛血清來(lái)自未用過(guò)反芻動(dòng)物蛋白飼料的牛群。3.證明所用牛血清中不含對(duì)所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物。4.血清要通過(guò)濾膜過(guò)濾除菌，保證無(wú)菌。5.無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國(guó)家要求無(wú)細(xì)菌噬菌體污染。6.對(duì)細(xì)胞有良好的支持繁殖作用。（二）、我國(guó)在對(duì)牛血清的質(zhì)量2000年版中國(guó)生物制品主要原輔料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)中提出比較嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)要求。包括蛋白質(zhì)含量，細(xì)菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細(xì)菌內(nèi)毒素，支持細(xì)胞增殖檢查。（三）、美國(guó)對(duì)牛血清的質(zhì)量要求：Gibco 和Sigma二家主要的美國(guó)牛血清供應(yīng)商的牛血清都已進(jìn)入到我國(guó)市場(chǎng)，他們對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求都極為嚴(yán)格，從血清來(lái)源到產(chǎn)品質(zhì)量都有明確規(guī)定。1） 血清來(lái)源：可從世界各國(guó)收集胎牛血清，但是必須符合他的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和美國(guó)農(nóng)業(yè)部進(jìn)口要求。地方當(dāng)局還不清楚本地是否有牛海綿狀病毒流行的血清不收集，有說(shuō)明血清質(zhì)量的證明資料：包括收集過(guò)程的全部資料、檢驗(yàn)結(jié)果和交付情況。2）血清的收集：胎牛血清是心臟穿刺取血，新生牛（1014天）和小牛（10個(gè)月內(nèi)）血清靜脈取血。血清采集條件必須符合工業(yè)生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)：低溫下采集、一次分離、分離后立即混合凍存。符合要求的血清56水浴30分鐘滅活。3）血清的制備：a. 超低IgG胎牛血清：通過(guò)親和層析工藝去除胎牛血清中的球蛋白，使FBS 球蛋白含量減到最低，一般IgG5ug/ml，生物學(xué)活性不變。b. 血清透析：用1200014000分子量的透析膜在0.15M NaCl中透析直到使葡萄糖含量0.5mg/ml（用葡萄糖氧化酶過(guò)氧化酶方法測(cè)定）。c. 射線(xiàn)照射：已經(jīng)證明射線(xiàn)照射可以有效滅活血清中可能污染的病毒、支原體。照射劑量為3045KG。而且這個(gè)劑量的射線(xiàn)照射不會(huì)改變血清的理化性質(zhì)和對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響。4）除菌過(guò)濾:經(jīng)過(guò)上述處理的粗制血清再經(jīng)過(guò)一系列除菌濾膜過(guò)濾包括0.2微米（micron）和0.1微米濾膜。FBS要通過(guò)三層0.1微米濾膜，其他血清可通過(guò)0.2微米濾膜。4.終產(chǎn)品血清質(zhì)量1）化學(xué)檢定：滲透壓pH蛋白含量電泳法白蛋白 球蛋白 血紅蛋白隨著牛年齡增加血清中總蛋白含量相應(yīng)增加，總的血清蛋白含量可以確定產(chǎn)品規(guī)格和年齡。2） 微生物學(xué)檢查：細(xì)菌、真菌符合USP標(biāo)準(zhǔn)。支原體：在支原體專(zhuān)業(yè)培養(yǎng)基上培養(yǎng)了34周，培養(yǎng)溫度362分別在需氧和厭氧條件下進(jìn)行，有的還需要在支原體瓊脂培養(yǎng)皿上傳4次，Hoechst熒光素DNA染色檢查那些培養(yǎng)法無(wú)法檢出的支原體如豬鼻支原體等。病毒檢查：牛蘭舌病毒 Bovin blue tongue牛腺病毒 Bovine Adenovirus牛細(xì)小病毒 Bovine Parvovirus牛病毒性腹泄病毒 Bovine Viral Diarhea Virus狂犬病病毒 Rabies呼腸弧病毒 Reovirus牛呼吸道合胞病毒 BRSV副流感病毒型 Parainfluenza檢查方法：已證明無(wú)外源因子污染的牛細(xì)胞培養(yǎng)物，在細(xì)胞生長(zhǎng)液中加15待測(cè)血清，連傳3代共21天。陰性對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)液中加15已知無(wú)病毒污染的牛血清，與試驗(yàn)組同條件下進(jìn)行。在觀察期內(nèi)注意細(xì)胞形態(tài)變化或細(xì)胞病變。在觀察期內(nèi)第14天待檢樣品和對(duì)照樣品用標(biāo)準(zhǔn)病毒檢測(cè)方法檢查。如待檢細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)胰酶消化后分種到6個(gè)含蓋玻片的容器內(nèi)。陰性對(duì)照樣品按同樣方法。再將牛腹泄病毒、牛細(xì)小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼腸弧病毒分別加入待檢培養(yǎng)物蓋玻片容器內(nèi)作為陽(yáng)性對(duì)照，再培養(yǎng)7天，用熒光抗體技術(shù)進(jìn)行檢查。細(xì)胞病變或病毒引起的其他改變通過(guò)蘇木精或伊紅染色進(jìn)行觀察。取另外一個(gè)待檢細(xì)胞培養(yǎng)瓶用人“O”紅細(xì)胞、豚鼠紅細(xì)胞和新鮮雞紅細(xì)胞作血球吸附病毒檢查。試驗(yàn)在28和2024進(jìn)行。陰性對(duì)照細(xì)胞預(yù)先感染副流感型病毒作為陽(yáng)性對(duì)照。未感染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。3）內(nèi)毒素檢測(cè)用鱟試劑檢查。4）細(xì)菌噬菌體檢查主要檢查E.Coli(C300 or K-12)噬菌體。5）激素含量測(cè)定每批FBS對(duì)某些激素含量都要進(jìn)行測(cè)定，包括：雌二醇、胰島素、孕硐、睪丸素、甲狀腺素等。6）血紅蛋白檢測(cè)血紅蛋白與氧合血紅蛋白的比70，血紅蛋白含量mg15/dl。7）細(xì)胞生長(zhǎng)效果測(cè)定a.細(xì)胞克隆效果測(cè)定細(xì)胞選擇：Sp20/Ag-14 或P3X63-Ag8.653血清濃度與細(xì)胞數(shù):10血清1個(gè)細(xì)胞孔4血清5個(gè)細(xì)胞孔細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI1640， 96孔培養(yǎng)盤(pán)362，5二氧化碳培養(yǎng)1015天。試驗(yàn)中選擇一個(gè)已知參考牛血清作對(duì)照。克隆效率計(jì)算：克隆效率(陽(yáng)性孔平均數(shù)/ 培養(yǎng)孔總數(shù)) X100 相對(duì)克隆效率待測(cè)血清克隆效率/參考血清克隆效率b.貼壁效率試驗(yàn)：用人的傳代細(xì)胞作每批血清的貼壁效率試驗(yàn)，A549（人肺癌細(xì)胞）該細(xì)胞可以反應(yīng)出低濃度血清的貼壁變化。采用6孔培養(yǎng)盤(pán)每批血清用兩種濃度和兩種不同的細(xì)胞接種數(shù)即10血清100細(xì)胞孔，4血清200介細(xì)胞孔。放362，濕潤(rùn)5二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)1014天，計(jì)算著色細(xì)胞克隆，確定貼壁效率。從這兩種不同血清濃度來(lái)確立實(shí)驗(yàn)血清支持細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的水平，分析兩種試驗(yàn)條件下平均貼壁效率。貼壁效率（）(每孔克隆平均數(shù)/ 每孔活存的培養(yǎng)細(xì)胞平均數(shù)) X100相對(duì)貼壁效率被測(cè)血清貼壁效率/參考血清貼壁效率c. 二倍體纖維細(xì)胞促生長(zhǎng)試驗(yàn)人二倍體細(xì)胞株 WI28 MRc525cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，5血清，每瓶接種1.5X105細(xì)胞連傳3代，每代血清濃度和接種細(xì)胞數(shù)相同，每代培養(yǎng)7天，每代接種二個(gè)細(xì)胞瓶，362培養(yǎng)。以同樣條件用已知參考血清進(jìn)行平行培養(yǎng)。每代收獲細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算每批待檢血清與參考血清的相對(duì)生長(zhǎng)率（RGR）。RGR(試驗(yàn)血清每瓶細(xì)胞平均數(shù)/ 參考血清每瓶細(xì)胞平均數(shù)) X100牛血清主要