血紅蛋白的提取和分離４.doc

課題3血紅蛋白的提取和分離一、課題目標本課題通過嘗試對血液中血紅蛋白的提取和分離，使學生能夠體驗從復雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理，為今后學習運用這些技術打下基礎。二、課題重點與難點課題重點：凝膠色譜法的原理和方法。課題難點：樣品的預處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。三、課題背景分析課題背景通過當今生物科學在蛋白質(zhì)研究領域的進展，說明提取、分離高純度的蛋白質(zhì)的重要性和必要性，進而明確地提出課題目的：以血紅蛋白為實驗材料，學習蛋白質(zhì)提取和分離的一些基本技術?？梢园l(fā)揮學生的主動性，讓學生介紹當前有關蛋白質(zhì)研究的新進展，激發(fā)學生的學習興趣，然后指出本課題的學習意義，讓學生初步體會分離純化蛋白質(zhì)的過程和方法。四、基礎知識分析與教學（一）凝膠色譜法知識要點：1.凝膠色譜法的用途；2.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理。教學：在介紹凝膠色譜法的基本原理時，可以結(jié)合教科書提供的插圖，讓學生對凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程有一個直觀的認識。可以通過發(fā)動學生查閱資料，讓學生了解有關凝膠色譜法的知識，如凝膠的種類、理化性質(zhì)及凝膠的選擇和保存，并結(jié)合實驗操作，讓學生分析實驗中的注意事項。還可以向?qū)W生介紹凝膠色譜法的其他用途，如測定生物大分子的分子量、蛋白質(zhì)的脫鹽等。（二）緩沖溶液知識要點：1.緩沖溶液的組成和作用機理；2.熟悉一般緩沖溶液的配制方法；3緩沖溶液廣泛應用于生化實驗、微生物的培養(yǎng)、組織切片和細菌染色以及酶的研究等方面。教學：首先可以結(jié)合生活中的一些緩沖現(xiàn)象，讓學生充分理解緩沖溶液的重要性。在進行本課題的實驗操作之前，可以讓學生查閱相關資料，練習一些常用緩沖液的配制。（三）電泳知識要點：1.電泳的基本原理；2.不同類型的電泳。教學：電泳技術廣泛應用于生化實驗，在分離分析酶、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子方面具有較高的分辨率?？梢酝ㄟ^一個簡單的實驗使學生理解電泳現(xiàn)象，比如在盛有紅褐色Fe(OH)3膠體的U形管的兩個管口，各插入一個電極。通直流電后，發(fā)現(xiàn)陰極附近的顏色逐漸變深，陽極附近的顏色逐漸變淺。這表明Fe(OH)3膠體粒子帶正電荷，在電場作用下向陰極移動。這種在外加電場作用下，帶電粒子發(fā)生遷移的現(xiàn)象就叫做電泳。教科書中用楷體字簡單地介紹了聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理，可以結(jié)合資料，開拓學生的知識面，圍繞聚丙烯酰胺凝膠電泳，介紹其他類型的電泳原理及應用。本實驗的選做部分是通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳對血紅蛋白進行純度的鑒定，同時也可以測定血紅蛋白亞基的分子量。此外，還可以通過聚丙烯酰胺凝膠梯度電泳來測定天然蛋白的分子量；通過聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳來測定蛋白的等電點；等等。相關原理可以查閱生物化學技術的有關書籍。使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量時，可選用一組已知分子量的標準蛋白同時進行電泳，根據(jù)已知分子量的標準蛋白的電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和分子量的對數(shù)作標準曲線，可以測出未知蛋白的分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標準蛋白試劑出售。五、實驗安排及注意事項（一）第1課時完成基礎知識的教學。需要用簡單直觀、通俗易懂的方式講解凝膠色譜法和電泳的基本原理?？梢愿鶕?jù)學生的接受情況，適當增加一些相關知識的教學，加深對本課題的理解。第1課時還要學習緩沖溶液的配制。本課題所用的緩沖液是20 mmol/L的pH7.0的磷酸緩沖液。在pH5.88.0的緩沖范圍內(nèi)，磷酸緩沖液的配制方法見下表。配制前需要準備0.2 mol/L的Na2HPO4溶液和0.2 mol/L的NaH2PO4溶液。Na2HPO4溶液的配制方法：將71.64 g的Na2HPO412H2O溶解在1 000 mL的蒸餾水中。NaH2PO4溶液的配制方法：將31.21 g的NaH2PO42H2O溶解在1 000 mL的蒸餾水中。pH0.2 mol/LNaH2PO4/mL0.2 mol/LNaH2PO4/mLpH0.2 mol/LNaH2PO4/mL0.2 mol/LNaH2PO4/mL5.86.06.26.46.66.88.012.318.526.537.549.092.087.781.573.562.551.07.07.27.47.67.88.061.072.081.087.091.594.739.028.019.013.08.55.3（二）第2課時進行凝膠色譜柱的制備。教材中已經(jīng)詳細地介紹了凝膠色譜柱的制作，可根據(jù)學生小組的數(shù)目，課前準備好所需的材料。值得一提的是，凝膠色譜柱直徑的大小不影響分離的效果，但是直徑過大會造成洗脫液體積增大，樣品的稀釋度過大，因此應選擇直徑不超過2 cm的色譜柱。凝膠色譜柱的高度與分離度有關，一般不超過1 m。在裝填凝膠前，一定要按教材描述的方法將凝膠充分溶脹，溶脹時可以用蒸餾水，也可以用洗脫緩沖液。如果發(fā)現(xiàn)凝膠的表面不平，可以用玻璃棒將表面的凝膠輕輕攪起，讓其自然沉淀至表面平整。凝膠裝填完畢一定要充分洗滌平衡，可以平衡過夜，但切記不得發(fā)生洗脫液流干、露出凝膠顆粒的現(xiàn)象，否則凝膠色譜柱需要重新裝填。（三）第3課時進行樣品的處理?？梢栽谡n前從學校附近的屠宰場索取新鮮的豬血，切記要在采血容器中預先加入抗凝血劑檸檬酸鈉。取血回來后，馬上進行離心。血紅蛋白溶液在透析袋中可以透析過夜。第2課時和第3課時在同一天進行，這樣可使凝膠色譜柱的平衡和血紅蛋白溶液的透析同時進行。（四）第4課時進行血紅蛋白的提取。此步驟是本課題的關鍵，每一步操作都要按照教科書的要求進行。加樣前可以在樣品中加入質(zhì)量分數(shù)為1%的葡萄糖或蔗糖（糖不會干擾分離效果），以調(diào)節(jié)樣品的比重，使之稍大于洗脫液，從而縮短加樣時間。如果樣品出現(xiàn)渾濁、有沉淀，可以離心或過濾后再加樣。在實驗過程中，洗脫液的流速也是影響分離效果的重要因素之一，因此，洗脫時應維持流速的恒定，即維持洗脫液加在色譜柱上的壓力恒定。有條件的學校，可以在洗脫液瓶與凝膠色譜柱之間加一個蠕動泵來控制洗脫液的流速，以保持恒定。（五）由于血紅蛋白呈現(xiàn)紅色，因此分離過程中能夠觀察到一條紅色的帶向下移動的現(xiàn)象，實驗結(jié)果也一目了然。收集到紅色的流出液就可以確定提取到了血紅蛋白。有條件的學校，可以用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法鑒定血紅蛋白的純度。具體操作參見本課題參考資料。（六）實驗結(jié)果如果不理想,需要重做時，必須進行凝膠色譜柱的再生。一般情況下，凝膠不會與其他溶質(zhì)發(fā)生任何作用，因此，在一次分離以后，稍加平衡就可以進行下一次的操作。平衡時，需用3倍柱體積的洗脫液過柱。如果實驗操作中有一些雜質(zhì)污染了色譜柱，可以用物質(zhì)的量濃度為0.2 mol/L的氫氧化鈉和物質(zhì)的量濃度為0.5 mol/L的氯化鈉混合液處理交聯(lián)葡聚糖凝膠。如果凝膠長期不用，可以加入濃度為0.02%的疊氮鈉、0.01% 的三氯丁醇和物質(zhì)的量濃度為0.1 mol/L的氫氧化鈉等抑菌劑低溫保存，使用時再進行充分的平衡。六、課題成果評價（一）是否完成對血液樣品的處理觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。（二）凝膠色譜柱的裝填是否成功。由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍色葡聚糖2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、