龍牙百合在組織培養(yǎng)過(guò)程中的酶譜分析(doc 18頁(yè)).doc

本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)中文題目龍牙百合在組織培養(yǎng)過(guò)程中的酶譜分析 外文題目 The zymography for Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker in the process of the tissue culture 學(xué)號(hào) 0507040099 姓名 彭 靜 學(xué)院生 命 科 學(xué) 學(xué) 院 專(zhuān)業(yè)生 物 科 學(xué) 指導(dǎo)教師 完成時(shí)間2009-4-30 江西師范大學(xué)教務(wù)處制目錄摘 要1Abstract21 文獻(xiàn)綜述31.1龍牙百合的生物學(xué)特征及價(jià)值31.1.1龍牙百合的生物學(xué)特征31.1.2龍牙百合的價(jià)值31.2龍牙百合在組織培養(yǎng)過(guò)程中過(guò)氧化物酶活性變化的研究現(xiàn)狀31.3國(guó)內(nèi)外同工酶研究現(xiàn)狀及應(yīng)用41.4 研究的目的和意義42 實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器與試劑42.1實(shí)驗(yàn)材料52.2實(shí)驗(yàn)主要儀器52.3實(shí)驗(yàn)試劑53 實(shí)驗(yàn)方法53.1技術(shù)路線(xiàn)53.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件53.3確定上樣量63.4電泳64試驗(yàn)結(jié)果及分析84.1組織培養(yǎng)過(guò)程中龍牙百合生長(zhǎng)與分化情況84.2過(guò)氧化物酶同工酶與龍牙百合生長(zhǎng)分化的關(guān)系95討論96對(duì)下一步工作的建議10參考文獻(xiàn)11附圖12致 謝15摘 要在組織培養(yǎng)過(guò)程中，為研究龍牙百合生長(zhǎng)分化與過(guò)氧化物酶同工酶的關(guān)系，對(duì)龍牙百合進(jìn)行組織培養(yǎng)并采用聚丙烯酰胺不連續(xù)體系盤(pán)狀電泳(垂直管電泳)分離不同階段過(guò)氧化物同工酶。結(jié)果：在龍牙百合生長(zhǎng)分化過(guò)程及不同組織過(guò)氧化物酶同工酶酶譜有很大差異，過(guò)氧化物酶同工酶酶譜可作為判別龍牙百合生長(zhǎng)分化進(jìn)程的依據(jù)。關(guān)鍵詞：龍牙百合,非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,過(guò)氧化物酶同工酶 The zymography for Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker in the process of the tissue culture PENG JingAbstractIn the process of the tissue culture, a study on the relationship between the growth and differentiation and Peroxidase isozyme of Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker was carried out . Tissue Culture for Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker was taken , To separate Peroxidase isozyme under different stages , the discontinuous system of discoid spolyacrylamide gel electrophoresis (vertical tube gel electrophoresis) was used. And the result showed that there was a great difference of map of peroxidase isoenzyme in the process of the growth and differentiation and among different tissues. The map may be as a basis for determination of the course of differentiation.Key words：LilumbrowniiF.E Browh Var virdum baker, polyacrylamide gel electrophoresis, Peroxidase isozyme1 文獻(xiàn)綜述1.1龍牙百合的生物學(xué)特征及價(jià)值1.1.1龍牙百合的生物學(xué)特征龍牙百合(Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker)為百合科百合屬中能形成鱗莖的栽培品種, 多年生宿根草本植物。鱗莖近球形, 橫莖24.5cm，鱗片披針形, 白色, 無(wú)節(jié), 味淡不苦。根系由肉質(zhì)根和纖維狀根組成, 肉質(zhì)根又叫“ 下盤(pán)根” , 著生于鱗莖下部；纖維狀根又叫“上盤(pán)根” , 著生在鱗莖上部。葉散生, 倒披針形。花乳白色有香氣, 一般稱(chēng)白花百合。龍牙百合喜涼爽, 耐蔭蔽, 喜濕潤(rùn), 怕水澇, 10以上可以萌發(fā)生苗, 生長(zhǎng)適溫為1624, 土層深厚、PH值5.76.3。排水良好的砂質(zhì)壤土最適宜生長(zhǎng)1。龍牙百合以其干品瓣形肥大微彎，色澤潔白至寶黃，形似龍牙而著稱(chēng)。1.1.2龍牙百合的價(jià)值 龍牙百合是一類(lèi)藥食同源、有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的特產(chǎn)蔬菜和藥用植物。龍牙百合以鱗莖入藥 ,為常用中藥 ,也可供提取淀粉或食用。龍牙百合含多種氨基酸、蛋白質(zhì)、淀粉、磷脂、百合苷 A、B等抗癌性植物堿及維生素 B1、B2等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) ,具有潤(rùn)肺止咳、寧心安神、清熱解毒等作用 ,性微寒、味甘 ,是目前市場(chǎng)走俏的藥用保健食品2。具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺止咳，清心安神功用；主治陰虛燥咳，勞嗽咯血、肺瘺、虛熱、煩噪驚悸、失眠、多夢(mèng)等；有鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰、抗疲勞、鎮(zhèn)靜、催眠、提高免疫力，升高外周白細(xì)胞等藥理作用。龍牙百合是最名貴的一種百合，它內(nèi)含豐富的生物堿，蛋白質(zhì)，礦質(zhì)元素等，是食品中的珍品，由開(kāi)其價(jià)格昂貴，被奉為貴族食品。近幾年,我國(guó)百合產(chǎn)量增加較快,經(jīng)濟(jì)效益顯著3。1.2龍牙百合在組織培養(yǎng)過(guò)程中過(guò)氧化物酶活性變化的研究現(xiàn)狀在龍牙百合的組織培養(yǎng)過(guò)程中，植物過(guò)氧化物酶以其廣泛存在和特殊的生物學(xué)意義而引起日益深入的研究4。龍牙百合組培過(guò)程中對(duì)過(guò)氧化物酶活性變化的研究和其他百合屬植物一樣，一般都是通過(guò)測(cè)定植物發(fā)育不同時(shí)期內(nèi)的過(guò)氧化物酶活性變化規(guī)律,來(lái)研究植物的組織分化狀況5。過(guò)氧化物酶與呼吸作用、光合作用及生長(zhǎng)素的氧化等都有關(guān)系6。在植物的代謝過(guò)程中它可以除去過(guò)多的H2O2，從而維持正常生理過(guò)程，避免了H2O2的毒害7。因此，研究過(guò)氧化物酶活性變化是非常必要。有許多公司、研究中心在過(guò)氧化物酶活性方面作了大量工作，并取得了較好的成就。1.3國(guó)內(nèi)外同工酶研究現(xiàn)狀及應(yīng)用同工酶的研究得到了很大發(fā)展，同工酶在植物體內(nèi)調(diào)節(jié)一定的代謝過(guò)程，因此，常被用于細(xì)胞分化、器官發(fā)生及個(gè)體發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)的研究，從同工酶的器官組織特異性也反映了基因表達(dá)的時(shí)空特異性。過(guò)氧化物同工酶在各種動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在9，而且在某些動(dòng)物的不同器官組織內(nèi)酶譜存在一定的差異。研究分化進(jìn)程及其與過(guò)氧化物酶同工酶的關(guān)系，可以進(jìn)一步深入探索龍牙百合生長(zhǎng)分化的基因表達(dá)差異，為龍牙百合生長(zhǎng)分化調(diào)控提供理論指導(dǎo)。酶譜的變化已作為鑒定物種、研究分類(lèi)與進(jìn)化、遺傳與變異的重要指標(biāo)10。而且由于同工酶是基因的產(chǎn)物，能直接反映基因的異同，易于觀察研究，目前已作為一種分化遺傳分化標(biāo)志廣泛地應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、群體依次學(xué)、醫(yī)學(xué)、分類(lèi)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定同工酶，方法簡(jiǎn)便，靈敏度高，重現(xiàn)性強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果便于觀察、記錄和保存11 12。但至今尚未見(jiàn)到有關(guān)龍牙百合生長(zhǎng)分化狀況與過(guò)氧化物同工酶關(guān)系的研究。1.4 研究的目的和意義1.4.1研究目的在組織培養(yǎng)過(guò)程中，過(guò)氧化物酶同工酶不斷發(fā)生變化13。通過(guò)比較不同階段過(guò)氧化物同工酶譜的差異，來(lái)研究龍牙百合生長(zhǎng)分化與過(guò)氧化物酶同工酶的關(guān)系。1.4.2研究意義作為基因表達(dá)的產(chǎn)物，測(cè)定同工酶譜是認(rèn)識(shí)基因存在和表達(dá)的一種工具，在植物的生長(zhǎng)分化研究中有重要的意義。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中它的活性不斷發(fā)生變化，測(cè)定這種酶的同工酶14，可以反映某一時(shí)期植物體內(nèi)代謝的變化，研究分化進(jìn)程及其與過(guò)氧化物酶同工酶的關(guān)系，可以進(jìn)一步深入探索龍牙百合生長(zhǎng)分化的基因表達(dá)差異，為龍牙百合生長(zhǎng)分化調(diào)控提供理論指導(dǎo)15 16。2 實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器與試劑2.1實(shí)驗(yàn)材料涂藝聲教授細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的龍牙百合(Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker)無(wú)菌苗。每隔10天對(duì)龍牙百合的莖段取一次樣。2.2實(shí)驗(yàn)主要儀器垂直板電泳槽及附件（玻璃板、硅膠條、梳子、導(dǎo)線(xiàn)等）、穩(wěn)壓穩(wěn)流直流電泳儀、高速冷凍離心機(jī)、電子分析天平2.3實(shí)驗(yàn)試劑見(jiàn)附表4 聚丙烯胺凝膠電泳貯液配制方法，但染色使用醋酸聯(lián)苯胺染色。醋酸聯(lián)苯胺染色：0.1g聯(lián)苯胺+5ml無(wú)水乙醇+10ml 1.5mol/L乙酸鈉+10mol 1.5mol/L乙酸+75ml的雙蒸水。溶解并過(guò)濾待用。膠片用雙蒸水沖洗3次后，在染液中加入0.14ml 30% H2O2。待酶帶完全出現(xiàn)后（約20min），用自來(lái)水沖洗2-3次，再隔一天換一次水，總共換2-3次。3 實(shí)驗(yàn)方法3.1技術(shù)路線(xiàn)本實(shí)驗(yàn)擬采取如下技術(shù)路線(xiàn)：無(wú)菌苗外植體接種培養(yǎng)不連續(xù)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離過(guò)氧化物酶同工酶酶譜分析(定期觀察龍牙百合的培養(yǎng)情況,看其生長(zhǎng)勢(shì)態(tài)，同時(shí)測(cè)定過(guò)氧化物和硝酸還原酶活性,做紀(jì)錄)3.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件本試驗(yàn)采用的基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，其配方查閱有關(guān)的資料，另外附加6一BA、NAA植物激素。蔗糖分別為每升培養(yǎng)基30g，瓊脂每升培養(yǎng)基 5.8 g，pH 為5.8 ，在容量為200ml的三角瓶中裝入50ml，并以高壓蒸汽滅菌鍋 在118下滅菌25分鐘，培養(yǎng)溫度為(25+2),光照度為1500lx,光照12 h/d。 表1 2種培養(yǎng)基成分Table 3 culture medium ingredient培養(yǎng)基編號(hào)培養(yǎng)基成分1號(hào)1/2MS基本培養(yǎng)基+BA 1.5 mg/ml + NAA 0.05 mg/ml +20g/l 蔗糖2號(hào)1/2MS基本培養(yǎng)基+ BA1.5 mg/ml + NAA 0.05 mg/ml +30 g/l 蔗糖3.3確定上樣量 設(shè)置一系列量（ul）（5、7.5、10、12.5、15、17.5、20），點(diǎn)樣在一塊電泳板上，然后進(jìn)行電泳，發(fā)現(xiàn)點(diǎn)樣量為12.5ul和15ul的圖譜最清晰，所以上樣量確定為12.515ul.3.4電泳17參照參考文獻(xiàn)13中聚丙烯酰胺凝膠電泳分離過(guò)氧化物同工酶。用10倍pH8.3的Tris甘氨酸緩沖液，分離膠采用過(guò)硫酸銨TEMED催化系統(tǒng)，pH8.9，凝膠總濃度T7.1%，濃縮膠采用核黃素TEMED催化系統(tǒng)，pH6.7、T3.1%，電極緩沖液為pH8.3Tris甘氨酸系統(tǒng)。加樣量15ul，電泳在4度條件下進(jìn)行，開(kāi)始穩(wěn)壓為100v，指示劑溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后恒壓200v，電泳時(shí)間約一個(gè)半小時(shí)。3.4.1貯液配制按表2配制貯液。3.4.2電泳槽的安裝垂直板電泳槽的式樣很多，目前流行的是用有機(jī)玻璃做的兩個(gè)“半槽”組成的方形電泳槽，中間夾著凝膠模子，是由成套的兩塊玻璃板裝入一個(gè)用硅酮橡膠做成的模套而構(gòu)成，由硅酮橡膠套決定兩玻璃板之間距離約為1.5mm，形成一個(gè)“膠室”，膠就在這兩板之間的膠室內(nèi)聚合成平板膠。當(dāng)凝膠模子與兩半槽固定在一起后，凝膠槽子兩側(cè)形成前后兩個(gè)槽，供裝電極緩沖液和冷凝管用。將兩塊玻璃板用去污劑洗凈，再用蒸餾水沖洗，直立干燥（勿用手指接觸玻璃板面，可用手夾住玻璃板的兩旁操作），然后正確放入硅膠條中。3.4.3凝膠的制備將貯液由冰箱取出，待與室溫平衡后再配制工作液。按表3比例配制分離膠將分離膠沿長(zhǎng)玻璃板加入膠室內(nèi)，小心不要產(chǎn)生氣泡，加至距短玻璃板頂端3cm處，立即覆蓋23mm的水層（或水飽和正丁醇），靜置待聚合（約40min），當(dāng)膠與水層的界面重新出現(xiàn)時(shí)表明膠已聚合。按表4比例配制濃縮膠注：TEMED在灌膠前加。先倒掉分離膠上的水層，立即加入濃縮膠，插入梳子（即樣品槽模板），待膠凝后，小心取出梳子。將稀釋10倍的電極緩沖液倒入兩槽中，前槽（短板側(cè)）緩沖液要求沒(méi)過(guò)樣品槽，后槽（長(zhǎng)板側(cè)）緩沖液要求沒(méi)過(guò)電極，備用。（放在有燈光處聚合）3.4.4樣品的制備稱(chēng)取龍牙百合莖部0.5 g，放入研缽內(nèi)，加pH 8.0提取液1 mL，于冰水浴中研成勻漿，然后以2 mL提取液分幾次洗入離心管，在高速離心機(jī)上以6000r/min離心15min，倒出上清液，以等量40蔗糖及1/5體積溴酚藍(lán)指示劑混和，留作點(diǎn)樣用。3.4.5點(diǎn)樣去掉膠套。用微量注射器（50L）吸取少量樣液，在濃縮膠上層點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)樣槽1550L。點(diǎn)樣時(shí)須小心，防止樣品液的擴(kuò)散。3.4.6電泳將電泳槽放入冰箱，接好電源線(xiàn)（前槽為負(fù)極）。打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電流到100V(約50min)左右，樣品進(jìn)入到分離膠后加大到200V，維持恒壓。待指示染料下行到距膠板末端1cm處，即可停止電泳。把調(diào)節(jié)旋扭調(diào)至零，關(guān)閉電源，電泳約一個(gè)半小時(shí)。3.4.7剝膠取出電泳膠板，掀開(kāi)玻璃，去掉濃縮膠。3.4.8染色、記錄結(jié)果醋酸聯(lián)苯胺染色：0.1g聯(lián)苯胺+5ml無(wú)水乙醇+10ml 1.5mol/L乙酸鈉+10mol 1.5mol/L乙酸+75ml的雙蒸水。溶解并過(guò)濾待用。膠片用雙蒸水沖洗3次后，在染液中加入0.14ml 30% H2O2。待酶帶完全出現(xiàn)后（約20min），用自來(lái)水沖洗2-3次，再隔一天換一次水，總共換2-3次。倒掉染色液，重新加入7的乙酸溶液，于日光燈下觀察記錄酶譜，繪圖或照相。4試驗(yàn)結(jié)果及分析4.1組織培養(yǎng)過(guò)程中龍牙百合生長(zhǎng)與分化情況 4.1.接種20天后生長(zhǎng)分化情況接種20天后，小塊近軸面基部稍有膨大、生長(zhǎng)。4.1.2接種30天后生長(zhǎng)分化情況接種30天后，無(wú)菌小鱗莖的獲得。小塊近軸面基部經(jīng)過(guò)膨大、生長(zhǎng),成為小鱗莖,同時(shí)有生根現(xiàn)象,一般每一小塊可產(chǎn)生23個(gè)小鱗莖。(附圖1)4.1.3接種40天后生長(zhǎng)分化情況接種40天后，在小鱗片基部出現(xiàn)小突起,以后長(zhǎng)大。多數(shù)生長(zhǎng)出細(xì)長(zhǎng)葉片,造成小鱗莖不飽滿(mǎn);不抽生葉片的小鱗莖相對(duì)要肥厚。(附圖2)4.1.4接種50天后生長(zhǎng)分化情況接種50天后，小鱗片基部出現(xiàn)白色愈傷組織,表面出現(xiàn)許多圓形突起,這些突起中有一部分隨愈傷組織發(fā)育為次生小鱗莖。在鱗莖盤(pán)基部產(chǎn)生大量根系,形成一顆完整植株。(附圖3)4.2過(guò)氧化物酶同工酶與龍牙百合生長(zhǎng)分化的關(guān)系遷移率（Rf）= 酶帶移動(dòng)距離/指示劑移動(dòng)距離。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離過(guò)氧化物酶同工酶實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)龍牙百合組織培養(yǎng)過(guò)程不同生長(zhǎng)分化階段出現(xiàn)不同的過(guò)氧化物酶酶譜。發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)分化期龍牙百合莖段的POD同工酶（染色最深）且表達(dá)的酶譜條帶最多。而生長(zhǎng)分化前期龍牙百合莖段的POD同工酶的活性很低（染色最淺），且條帶最少。在各酶帶中，相對(duì)遷移率為0.188的酶帶2為生長(zhǎng)分化階段的共有酶帶。但隨著分化進(jìn)程的加深，會(huì)逐漸出現(xiàn)3條酶帶，其相對(duì)遷移率分別為0.245、0.126、0.061，可作為判定生長(zhǎng)分化進(jìn)程的特征帶。在龍牙百合生長(zhǎng)分化的未分化期酶帶較弱或缺失，但隨著花芽分化進(jìn)程的加深而出現(xiàn)，酶活性也有所加強(qiáng)。說(shuō)明組織培養(yǎng)過(guò)程中過(guò)氧化物酶同工酶的表達(dá)和活性與不同生長(zhǎng)分化階段有關(guān)。如圖所示（附圖4）。5討論盡管目前對(duì)過(guò)氧化物酶的生理功能還認(rèn)識(shí)不夠，但根據(jù)其與植物生長(zhǎng)發(fā)育及組織分化之間所表現(xiàn)的比較穩(wěn)定的關(guān)系，可以用它作一般組織分化的指標(biāo)之一。過(guò)氧化物酶普遍存在于高等植物并在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用。過(guò)氧化物酶是遺傳信息表達(dá)的較好標(biāo)志，它的合成受一系列基因所調(diào)控?；虮磉_(dá)的時(shí)空差異決定了同工酶在細(xì)胞分化、組織器官的形成及個(gè)體發(fā)育中酶譜的某種變化和同工酶譜的器官和組織的特異性，也即同工酶的可變性。本實(shí)驗(yàn)以龍牙百合的莖段為材料進(jìn)行過(guò)氧化物酶同工酶分析發(fā)現(xiàn)，龍牙百合生長(zhǎng)分化階段過(guò)氧化物酶同工酶譜有明顯差別，龍牙百合莖段生長(zhǎng)分化期的過(guò)氧化物酶同工酶酶譜比生長(zhǎng)分化期多3條酶帶，表明利用過(guò)氧化物酶同工酶分析鑒別作一般組織分化的指標(biāo)是可行的。因此，可以通過(guò)酶譜的變化判斷龍牙百合生長(zhǎng)分化的進(jìn)程。經(jīng)過(guò)對(duì)組織培養(yǎng)過(guò)程不同生長(zhǎng)分化階段的反復(fù)實(shí)驗(yàn)，得出不同的酶譜，可以初步認(rèn)定生長(zhǎng)分化的不同階段，酶的種類(lèi)與含量是時(shí)刻發(fā)生改變的。實(shí)驗(yàn)受如下因子的限制，所得出的結(jié)論仍需要進(jìn)一步研究：僅試植物材料莖段，沒(méi)有對(duì)其它不同部位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如葉子等。因?qū)嶒?yàn)時(shí)間所限，僅對(duì)過(guò)氧化物酶同工酶進(jìn)行了分析，而未對(duì)其它同工酶如超氧化物進(jìn)行分析 。6對(duì)下一步工作的建議本試驗(yàn)只對(duì)過(guò)氧化物酶同工酶（POD）酶譜進(jìn)行了分析，還應(yīng)多對(duì)幾種酶，如過(guò)氧化氫酶同工酶（CAT）、酯酶、超氧化物歧化酶（SOD）等的酶譜進(jìn)行生理指標(biāo)分析,以便能更好地說(shuō)明問(wèn)題。參考文獻(xiàn)1 夏鎮(zhèn)澳.植物組織培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)J.植物生理學(xué)通訊,1995,31 (1):62-642 Zhuping Gu,Arditti J.et al.The effects of BA,2,4-Dand IAA on sboot-tip cultures of CymbidiumJ.Lindleyana,1987,2(2):88-903 Thomas J.Shcchen,Orchide.In introduction for flori-cultureJ.Roy A.Laraen,1980:133-1634 蔣小滿(mǎn),趙建萍,畢可華.“艾西絲”南瓜誘導(dǎo)生根過(guò)程中過(guò)氧化物酶活性及同工酶的研究J. 1998,18(3):397-4005 Anderson W.C Propagation of Rhododendrons by Tissue Culture:Part I.Development of a CultureMedium for Multiplication of ShootsJ.Proc.Intl.Plant Prop. 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