微絲染色及形態(tài)觀察.ppt

目的要求 1 掌握微絲的染色方法 2 了解光鏡下微絲的基本形態(tài)結(jié)構(gòu) 3 了解細(xì)胞松弛素B對(duì)微絲的作用及原理 微絲染色及形態(tài)觀察 實(shí)驗(yàn)原理 真核細(xì)胞質(zhì)中縱橫交錯(cuò)的纖維網(wǎng)稱為細(xì)胞骨架 在維持細(xì)胞形狀和運(yùn)動(dòng)方面具有重要作用 根據(jù)組成成分和組裝結(jié)構(gòu)的不同 可將細(xì)胞骨架分為微管 微絲和中間纖維 微絲普遍存在于多種細(xì)胞 對(duì)細(xì)胞的形狀和運(yùn)動(dòng)有一定作用 微絲由蛋白單體聚合形成 細(xì)胞松馳素B可與微絲的亞單位肌動(dòng)蛋白結(jié)合 從而破壞微絲 改變細(xì)胞的形狀 細(xì)胞松弛素B對(duì)微絲的作用具有可逆性 當(dāng)細(xì)胞用TritonX 100溶液處理 能夠溶解質(zhì)膜結(jié)構(gòu)中及細(xì)胞內(nèi)許多蛋白質(zhì) 而細(xì)胞骨架中的蛋白質(zhì)卻不被破壞 經(jīng)固定和考馬斯亮藍(lán) 非特異性蛋白質(zhì)染料 染色后 胞質(zhì)背景著色弱 微管等蛋白結(jié)構(gòu)在光鏡下無法分辨 在光鏡下觀察到主要是由微絲組成的應(yīng)力纖維 應(yīng)力纖維由平行排列的微絲組成 體外培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞應(yīng)力纖維尤為發(fā)達(dá) 形態(tài)長(zhǎng)而直 常與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行并貫穿細(xì)胞全長(zhǎng) 微絲在細(xì)胞內(nèi)的分布特征 實(shí)驗(yàn)用品 器具 CO2恒溫培養(yǎng)箱 倒置顯微鏡 超凈工作臺(tái) 低速離心機(jī) 普通光學(xué)顯微鏡 移液器 恒溫箱 鑷子 培養(yǎng)皿 載玻片 蓋玻片 吸水紙 材料 蓋玻片培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞試劑 6mmol LPBS pH6 5 1 TritonX 100溶液 M 緩沖液 3 戊二醛固定液 0 2 考馬斯亮藍(lán)染液 100 g ml的細(xì)胞松弛素B DMEM培養(yǎng)液 實(shí)驗(yàn)步驟 1 培養(yǎng)在成纖維細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí) 將已消毒的蓋玻片涂上多聚賴氨酸 放入培養(yǎng)皿中 于37 5 CO2的溫箱中生長(zhǎng)24h 48h 設(shè)正常生長(zhǎng)組和細(xì)胞松弛素B處理組 2 染色處理 1 取材取出鋪有細(xì)胞的蓋玻片 放入小培養(yǎng)皿中 正面向上 用PBS洗3次 從蓋玻片一角輕輕滴加3 4滴 洗去表面的培養(yǎng)液 2 抽提吸棄PBS 加入1 TritonX 100液4 5滴 剛好覆蓋蓋玻片表面 室溫處理25 30min 或置37 18min 3 穩(wěn)定吸棄TritonX 100 立即用M 緩沖液輕輕地洗滌3次 每次3min 4 固定略晾干 在3 戊二醛液中固定10min 再以PBS液洗3次 洗去固定液 5 染色滴加3 5滴0 2 考馬斯亮蘭染液染色20 30min 然后小心的用自來水漂洗 6 觀察留取少量水分封片于載玻片 吸水紙吸去多余的水 光鏡下觀察臨時(shí)裝片 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 光鏡觀察 微絲聚集成的應(yīng)力纖維束被染成藍(lán)色 在沒用藥的標(biāo)本上 成纖維細(xì)胞多數(shù)有突起 微絲沿突起規(guī)則排列 用細(xì)胞松弛素B處理的標(biāo)本 由于微絲被破壞 突起縮回 多數(shù)細(xì)胞形狀變圓 用藥處理后又洗去藥的標(biāo)本 由于解除了藥的作用 肌動(dòng)蛋白重新聚合成微絲 細(xì)胞形狀恢復(fù)正常 1 光鏡下觀察被染成藍(lán)色的微絲聚集成的應(yīng)力纖維束 注意成纖維細(xì)胞中微絲分布的特點(diǎn) 2 注意觀察正常對(duì)照片與用藥處理后的標(biāo)本成纖維細(xì)胞形狀的區(qū)別 3 觀察用藥處理后又洗去藥的標(biāo)本中細(xì)胞形態(tài)是否恢復(fù)正常 光學(xué)顯微鏡下微絲分布圖 注意事項(xiàng) 1 洗片時(shí)要輕柔 以免把細(xì)胞從載玻片上洗去 2 恢復(fù)時(shí)間要足夠 否則細(xì)胞不會(huì)恢復(fù)到未處理前的狀態(tài) 3 操作中應(yīng)注意區(qū)分細(xì)胞蓋玻片的正反面 4 染色后應(yīng)沖洗蓋玻片背面 避免損傷細(xì)胞 5 TritonX 100抽提蛋白時(shí) 注意避免抽提時(shí)間過長(zhǎng)而導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞 作業(yè)與思考題 1 比較三種不