免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟.doc

免疫組化實(shí)驗(yàn)方法器材:微波爐 格蘭仕家用微波爐光學(xué)顯微鏡 OLYMPUS顯微鏡染色缸21個(gè)，1000ml燒杯1個(gè)，保鮮膜，濕盒 試劑：封閉用血清，DAB染液，SABC試劑盒，中性塑膠 武漢博士德生物工程公司無(wú)水乙醇，甲醇，二甲苯，檸檬酸，檸檬酸鈉，鹽酸，氨水，氯化鈉，氯化鉀，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，吐溫-20，30%雙氧水，蘇木素染液試劑配制：1. 5PBS（1000ml）：NaCL：40g； KCL：1.2g；Na2HPO4：18.15g；KH2PO4：1.2g溶于ddH2O中定容至1000ml，調(diào)PH至 7.4-7.6。使用時(shí)稀釋5倍至1使用。2. 5PBST（1000ml）：NaCL：40g； KCL：1.2g；Na2HPO4：18.15g；KH2PO4：1.2g，tween-20:2.5ml溶于ddH2O中定容至1000ml，調(diào)PH至 7.4-7.6。使用時(shí)稀釋5倍至1使用。3. 檸檬酸鹽緩沖液：（10mM，PH6.0）： 10儲(chǔ)備液配制: 檸檬酸溶液：21.01g檸檬酸溶于1000ml H2O中得0.1mol/L檸檬酸溶液 檸檬酸鈉溶液：29.41g檸檬酸鈉溶于1000ml H2O中得0.1mol/L檸檬酸鈉溶液 取190ml檸檬酸溶液加810ml檸檬酸鈉溶液混合調(diào)PH至6.0得10檸檬酸鹽緩沖液，使用時(shí)稀釋10倍至1使用。4. 梯度酒精： 無(wú)水乙醇：取500ml無(wú)水乙醇至染色缸中，脫水和復(fù)水各3份共需6份 95%乙醇：取475ml無(wú)水乙醇加25ml水至染色缸中，脫水和復(fù)水各3份共需6份 70%乙醇：取350ml無(wú)水乙醇加150ml水至染色缸中，脫水和復(fù)水各1份共需2份5. 0.5%鹽酸酒精： 0.5ml鹽酸加入99.5ml 70%酒精實(shí)驗(yàn)步驟：1. 取石蠟切片于烤箱中55-60烘烤1-1.5h使石蠟熔化2. 二甲苯脫蠟：將烤箱中取出的切片迅速置于二甲苯染色缸中脫蠟3min3次3. 系列酒精復(fù)水：將脫蠟完成后的切片分別置于無(wú)水乙醇2min3次，95%乙醇2min3次，70%酒精2min；蒸餾水中輕晃漂洗2min。4. 抗原修復(fù)：切片置于10mM檸檬酸鹽緩沖液中95以上修復(fù)，具體時(shí)間視不同組織不同切片質(zhì)量決定。注意不可長(zhǎng)時(shí)間沸騰，以免導(dǎo)致脫片。實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)用格蘭仕家用微波爐設(shè)置條件：取600ml檸檬酸鹽緩沖液，power1加熱7min后溶液沸騰，調(diào)制power 60繼續(xù)加熱13min，在power60條件下可保證緩沖液溫度達(dá)到要求但不長(zhǎng)時(shí)間沸騰，在加熱過(guò)程中使用保鮮膜封閉燒杯口并在保鮮膜上用針頭扎孔，以免加熱過(guò)程中緩沖液蒸發(fā)導(dǎo)致濃度改變。5. 自然冷卻至室溫，ddH2O流水沖洗10min。注意:室溫自然冷卻，流水沖洗保證檸檬酸鹽緩沖液不殘留，殘留可能導(dǎo)致后續(xù)實(shí)驗(yàn)受到影響6. 使用與二抗來(lái)源相同的封閉血清37濕盒中封閉1h。滴加血清前可使用免疫組化筆在載玻片上畫(huà)圈以保證血清或抗體不會(huì)擴(kuò)散7. 甩去封閉液滴加一抗4濕盒過(guò)夜孵育。一抗?jié)舛劝凑照f(shuō)明書(shū)推薦使用封閉血清稀釋使用8. 一抗過(guò)夜孵育后PBST搖床漂洗5min，PBS搖床漂洗5min4次9. 按照說(shuō)明書(shū)推薦濃度滴加相應(yīng)二抗37濕盒孵育20-30min，PBS搖床漂洗5min3次10. 3%H2O2封閉10min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。清水漂洗后PBS 3min3次。注意：3%H2O2現(xiàn)配現(xiàn)用。時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)11. 滴加SABC后37濕盒孵育20min，PBST搖床漂洗5min4次，PBS 5min2次12. DAB染色：按照說(shuō)明書(shū)要求現(xiàn)用現(xiàn)配DAB染液滴加至組織處于鏡下觀察染色，陽(yáng)性染色出現(xiàn)后自來(lái)水沖洗后PBS漂洗2min。13. 蘇木素復(fù)染：滴加蘇木素至玻片上染色，染色時(shí)間視蘇木素質(zhì)量決定。染色后自來(lái)水沖洗完全去除蘇木素14. 鹽酸酒精分化及氨水返蘭：蘇木素染色在酸性條件下呈現(xiàn)棕色，在堿性條件下呈現(xiàn)藍(lán)色。分別調(diào)整鹽酸酒精分化及氨水返蘭時(shí)間使蘇木素染色為淡藍(lán)色。15. 脫水封片：按照與脫蠟復(fù)水反向順序進(jìn)行脫水，脫水后使用中性樹(shù)膠封片。16. 鏡檢：待封片干燥后顯微鏡下觀察。注意事項(xiàng)：1. PBS濃度與PH值：使用PBS工作液濃度為1，PH：7.4-7.6；濃度過(guò)高或PH偏酸不易于染色且易導(dǎo)致背景較高。2. 切片質(zhì)量不佳較易脫片時(shí)一抗4孵育過(guò)夜后可37復(fù)溫30min，但易導(dǎo)致背景較高。3. 封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液要求PH值為7.4-7.6.4. 封閉血清應(yīng)應(yīng)與二抗種屬相同，可減少非特異性背景染色5. 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中封閉以后干片會(huì)使背景加深。6. 蘇木素復(fù)染后氨水返藍(lán)過(guò)程會(huì)使背景及陽(yáng)性染色有所降低，因此DAB染色時(shí)可以適當(dāng)延長(zhǎng)染色時(shí)間。7. 顯微鏡下觀察時(shí)使用自然光進(jìn)行觀察，盡量不要使用軟件補(bǔ)光。8. 在進(jìn)行熒光染色時(shí)可以忽略H2O2封閉過(guò)程9. 如不采用SABC法，則H2O2封閉過(guò)程應(yīng)提前至使用二抗之前。DAB顯色時(shí)如在較短時(shí)間即可顯色但背景較高時(shí)可以考慮降低一抗?jié)舛燃霸黾右豢购笃创螖?shù)