【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）無尾兩棲類晶狀體發(fā)育及再生過程中Sox2基因和αA-，βB1-晶狀體蛋白的表達研究

蘭州大學碩士學位論文 無尾兩棲類晶狀體發(fā)育及再生過程中 因和 1 第一章 前言 狀體的發(fā)生 狀體的決定和誘導 胚胎晶狀體起源于神經(jīng)板附近的外胚層。當神經(jīng)管閉合后，預定視網(wǎng)膜區(qū)域從前腦外突形成視泡，隨后視泡與表面頭部外胚層的預定晶狀體直接接觸，幾個小時后，外胚層增厚形成晶狀體板，晶狀體板中的細胞開始合成晶狀體特異性的晶狀體蛋白 1。在實驗胚胎學出現(xiàn)前， 19 世紀的生物學家認為，晶狀體的發(fā)育依賴于預定晶狀體組織和周圍組織的相互作用，尤其是它和發(fā)育中的視網(wǎng)膜的相互作用，因為在視杯從覆蓋在其上的外胚層脫落的不正常的人類和動物胚胎中，或者在無眼畸形的情況下，如果視杯缺失，則晶狀體也會缺失。 1901 年， 神經(jīng)板期胚胎的預定視網(wǎng)膜區(qū)域，這些胚胎的眼和晶狀體都未發(fā)育 ，而晶狀體是起源于實驗中未受到損傷的外胚層，因此，他認為視泡與外胚層的接觸是晶狀體形成所必需的。此后， 實驗進一步使這一晶狀體誘導的基本觀點成形。 視泡移植到 側(cè)面外胚層下，結(jié)果晶狀體在這個位置形成。這些結(jié)果表明，眼原基對于晶狀體誘導是充分條件。后來，有人重復 實驗時，得到了相反的結(jié)果。 80 年代末期， 人使用世系追蹤技術證明在 R. 胎側(cè)面異位表達的晶狀體僅僅來源于污染的供體細胞，這些細胞攜帶在移植的視泡上。因此 ，視泡對于晶狀體誘導并不是充分條件。晶狀體的發(fā)育過程遠比 觀點復雜 2, 3。實際上晶狀體的決定 開始于更早的時期，在原腸胚形成時，有一個短暫的時期中外胚層首次對來自預定神經(jīng)板前部的晶狀體誘導信號起反應。有人提出，在原腸胚晚期及神經(jīng)板形成時期，當預定晶狀體區(qū)域暴露于晶狀體誘導信號，預定晶狀體外胚層發(fā)生了變化，從而產(chǎn)生了形成晶狀體的傾向性。與此同時，一些重要的調(diào)節(jié)基因在預定晶狀體區(qū)域表達，包括視網(wǎng)膜和晶狀體形成所必需的 , 4。晶狀體外胚層具有形成晶狀體傾向性的假設來源于一個移植實驗。在這個實驗中，從原腸胚期到神經(jīng)管期，預定晶狀體外胚層被移植到另一個宿主胚胎的預定晶狀體區(qū)域，覆蓋在新形成的視泡上。研究結(jié)果表明，視泡是一蘭州大學碩士學位論文 無尾兩棲類晶狀體發(fā)育及再生過程中 因和 2 個非常弱的晶狀體誘導子，實際上，原腸胚外胚層基本不能對來自視泡的信號起反應。而這個外胚層被移植到更早時期胚胎的結(jié)果與此相反，在更早時期的胚胎中誘導信號更強烈。然而，當更后時期的預定晶狀體外胚層被移植到誘導 環(huán)境弱的神經(jīng)管期胚胎中，產(chǎn)生了增強的晶狀體形成反應 5。這個結(jié)果表明，在這些中間時期中，預定晶狀體外胚層狀態(tài)發(fā)生了變化，使其預先具有晶狀體形成傾向。有實驗證實，在非洲爪蟾和 ，晶狀體外胚層及其毗鄰的頭部表面外胚層在神經(jīng)胚期獲得形成晶狀體的傾向 1。實驗證明，只有中期和晚期的外胚層具有對神經(jīng)板前部的信號起反應的感受性，這種感受性被認為是外胚層自身固有的，不是被周圍組織所誘導的。有人將晶狀體的決定劃分為三個時期：感受性，傾向性和最后的決定。感受性是對起初的誘導信號起 反應的能力，它被認為是在外胚層中獨立存在的過程，前神經(jīng)板提供形成晶狀體的傾向性，最后的決定則是由視泡誘導的。 狀體的形態(tài)發(fā)生 視泡與預定晶狀體外胚層接觸后預定晶狀體外胚層的細胞開始伸長形成晶狀體板，增厚的晶狀體板隨后向視泡內(nèi)陷形成晶狀體窩，最后離開頭部表面外胚層形成晶狀體泡。大多數(shù)脊椎動物的晶狀體發(fā)生過程是基本相同的，但兩棲類動物不經(jīng)過晶狀體窩的階段，增厚的晶狀體板分為內(nèi)層和外層，內(nèi)層發(fā)育成中空的晶狀體泡，而外層發(fā)育成預定角膜上皮。組成晶狀體泡后壁的細胞隨后伸長并分化形成初級晶狀體纖維細胞。這 個分化過程包括細胞周期阻滯，細胞去核以及晶狀體蛋白的急劇上調(diào)。晶狀體泡的前部細胞形成一個單層的晶狀體上皮包圍著晶狀體纖維。晶狀體赤道區(qū)域的晶狀體上皮細胞持續(xù)分裂并最終分化成次級晶狀體纖維細胞。成熟的初級晶狀體纖維細胞和次級晶狀體纖維細胞在晶狀體內(nèi)逐步伸長，最后填充于整個晶狀體中。而位于晶狀體赤道區(qū)域前方的細胞始終保持為晶狀體上皮細胞。在晶狀體泡形成的過程中，視泡也形成了視杯，由神經(jīng)視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜色素上皮層內(nèi)外兩層組成 6。 圖 1脊椎動物晶狀體發(fā)育圖示 7 of in 州大學碩士學位論文 無尾兩棲類晶狀體發(fā)育及再生過程中 因和 3 視泡（ 頭部表面外胚層（ 晶狀體板（ ，視杯（ 晶狀體窩（ 視網(wǎng)膜（ 晶狀體泡（ 晶狀體上皮（ 晶狀體發(fā)生相關的轉(zhuǎn)錄因子 晶狀體的發(fā)生是一個階段性的過程，伴隨著很多轉(zhuǎn)錄因子的相繼激活。根據(jù)它們的功能，可以將這些轉(zhuǎn)錄因子歸納為三類。第一類由基板前基因組成，它們涉及基板前外胚層的形成，基板前外胚層是頭蓋感覺組織的共同原基。第二類由晶狀體 特化基因組成，它們在基板前外胚層內(nèi)建立了晶狀體區(qū)域。第三類由晶狀體分化基因組成，它們在視泡與預定晶狀體外胚層接觸后促進晶狀體的形態(tài)發(fā)生6。在原腸胚形成末期，包圍神經(jīng)板前部的基板前外胚層表達“基板前基因”，包括 , 9， 0， 1， 2， 3, 4， 5也在基板前外胚層的前部表達?；迩盎虮磉_后，在神經(jīng)板期，晶狀體特化基因 始在預定晶狀體外胚層表達 12, 16。 開始在包括預定晶狀體和鼻外胚層的基板前外胚層表達，但隨著發(fā)育的進行，最后定位在預定晶狀體外胚層。神經(jīng)管閉合后，預定視網(wǎng)膜區(qū)域從前腦外凸形成視泡。當視泡與預定晶狀體外胚層相互作用時， 預定晶狀體區(qū)域被激活 17, 18。預定晶狀體外胚層與視泡接觸后，預定晶狀體外胚層細胞伸長形成晶狀體板，這一過程中“晶狀體分化基因” 被激活，包括 9， 0， 1，2， 2， 3， 7和 4。基板前基因，比如 0，5， 6， 4和 5的表達在晶狀體板形成時被關閉。隨后晶狀體泡后部的細胞伸長并分化成初級晶狀體纖維，在晶狀體板中表達的基因中， 7， 2和 7在晶狀體纖維細胞中維持表達。與晶狀體纖維細胞不同的是，晶狀體上皮細胞中持續(xù)表達 3， 8， 9，9， 0， 1和 2。 狀體再生 蟾晶狀體再生 非洲爪蟾具有晶狀體再生的能力， 1963 年， 出非洲爪蟾的再生晶狀體來源于外角膜內(nèi)層。他將非洲爪蟾晶狀體再生的形態(tài)發(fā)生過程劃分為 5 個時期（如圖 1第一個階段，爪蟾外角膜的內(nèi)層細胞從鱗狀轉(zhuǎn)變成立方狀；第二個階段，外角膜的內(nèi)層細胞形成兩到三層厚的細胞團；第三個階段，細胞團形成晶狀體泡，這個過程又可以分為早期中期和晚期三個亞期；第四個階段，晶狀體蘭州大學碩士學位論文 無尾兩棲類晶狀體發(fā)育及再生過程中 因和 4 泡的后端形成初級 晶狀體纖維；第五個階段，初級晶狀體纖維被次級晶狀體纖維包圍 30。變態(tài)前的非洲爪蟾蝌蚪的晶狀體被摘除后，外角膜內(nèi)層中間區(qū)域的細胞轉(zhuǎn)分化形成新的晶狀體細胞。存在于玻璃體中的誘導因子在這個過程中起到重要的引導作用，這種因子被認為來源于視網(wǎng)膜，稱為玻璃體因子，它可以在外角膜細胞和角膜周圍上皮細胞中誘導晶狀體分化。外角膜和角膜周圍上皮共同構(gòu)成了一個晶狀體形成區(qū)域，這個區(qū)域的大小大概是眼睛直徑的兩倍 30, 31。研究表明，將外角膜和角膜周圍上皮的碎片移植到眼睛的玻璃體腔中并暴露于玻璃體因子，它們能轉(zhuǎn)分化成晶狀體組織，在這些實驗中，原有的晶狀體保留在原處，新的異位晶狀體從移植物上生長出來 32, 33。而來自于晶狀體形成區(qū)域外的上皮碎片則不會形成晶狀體。正常情況下，晶狀體本身和內(nèi)角膜形成的物理屏障使外角膜細胞不能與玻璃體因子接觸。如果用微孔濾器屏障代替晶狀體，角膜轉(zhuǎn)分化也不發(fā)生，表明玻璃體與外角膜物理接觸的破壞阻礙了再生 34。 在非洲爪蟾中，外角膜再生新的晶狀體的能力在 50期和 58期之間逐漸減弱，59 期后幾乎沒有，到變態(tài)后完全消失。研究表明，晶狀體再生能力減弱主要是因為內(nèi)角膜的快速愈合阻礙了視網(wǎng)膜因子到達外角膜，從而抑制了外角膜的晶狀體轉(zhuǎn)分化過程，而外角膜在爪蟾晶狀體再生能力喪失后仍具有一定程度的形成晶狀體的能力 35。同為爪蟾屬的熱帶爪蟾不能正常再生晶狀體，正是因為這個種的內(nèi)角膜愈合迅速，而熱帶爪蟾的角膜是具有轉(zhuǎn)分化的能力的，有人將其角膜移植到玻 璃體腔證明了這點，這表明角膜轉(zhuǎn)分化涉及的因子和應答通路在熱帶爪蟾和非洲爪蟾中是保守的。不過熱帶爪蟾角膜對玻璃體因子應答的區(qū)域更集中，只有中央的角膜細胞可以轉(zhuǎn)分化，而周圍角膜細胞不能 36。為了研究非洲爪蟾蝌蚪外角膜這種再生晶狀體的能力是由引導晶狀體形成傾向性和預定晶狀體外胚層的晶狀體分化的早期誘導因子產(chǎn)生的，還是由引導角膜形 成的晚期誘導因子產(chǎn)生的，或是由二者共同產(chǎn)生的，有人將經(jīng)歷了不同時期的誘導因子的外胚層表皮或角膜移植到玻璃體腔中并檢測再生能力，研究表明，兩種誘導因子都與外角膜的這種能力有關并且任何一種因子都能單獨誘導這種能力 37。角膜 兩個過程的形態(tài)分化似乎是相同的。晶狀體是從胚胎頭 部表面外胚層發(fā)生的，外角膜也是從這個區(qū)域衍生的。轉(zhuǎn)分化需要與神經(jīng)視網(wǎng)膜相互作用，而在胚胎晶狀體發(fā)生的后期視泡和預定晶狀體外胚層也有相互作用。鑒于這兩個過程間的這些相似處，有研究者比較了 6晶狀體發(fā)生和再生過程中的表達模式，研究發(fā)現(xiàn)這些基因在兩個過程中都有表達，這表明這兩個過程是緊密聯(lián)系的，這些基因的重復表達可能是角膜 38。 蘭州大學碩士學位論文 無尾兩棲類晶狀體發(fā)育及再生過程中 因和 5 圖 1洲爪蟾蝌蚪晶狀體再生過程圖示 30 of 蠑螈晶狀體再生 蠑螈具有晶狀體再生的能力，再生的晶狀體來源于虹膜背緣色素上皮細胞，這個過程被稱為 生。具體過程是：晶狀體摘除后，背緣虹膜的色 素上皮細胞去分化，即這些細胞失去原有的細胞特性例如色素化。巨噬細胞也被募集到這個區(qū)域介導這個過程。去分化同時標志著重新進入細胞周期，這個對于增殖是非常重要的。在晶狀體摘除后 4 天可以觀察到增殖的第一個高峰期，大概晶狀體摘除后 10 天，去分化的細胞在虹膜背緣形成一個有內(nèi)外兩層的囊泡 39。晶狀體摘除后 12時，囊泡的內(nèi)層開始增厚，細胞伸長并分化成初級晶狀體纖維細胞，這個時候可以觀察到增殖的第二個高峰期，并且晶狀體蛋白開始合成。隨著再生過程的進行，初級晶狀體纖維繼續(xù)在囊泡內(nèi)層形成，次級晶狀體纖維也開始在晶狀體囊的外層。晶狀體摘除 18時晶狀體蛋白繼續(xù)合成。晶狀體摘除后 25 天，一個完整的包含晶狀體上皮和晶狀體纖維細胞的完整的晶狀體形成 40。 它物種的晶狀體再生 晶狀體再生現(xiàn)象并不是只限于兩棲動 物，在其它脊椎動物中也有發(fā)生。有研究報道，在雞胚中，晶狀體從靠近脈絡膜的虹膜邊緣的一層細胞再生。與蠑螈類似，有些有種類的魚能通過虹膜背緣轉(zhuǎn)分化再生晶狀體。其它的脊椎動物，如小鼠，兔子，和貓也能再生晶狀體，但是與其它動物不一樣，這些哺乳動物不是通蘭州大學碩士學位論文 無尾兩棲類晶狀體發(fā)育及再生過程中 因和 6 過轉(zhuǎn)分化再生晶狀體，而是由殘留在晶狀體囊上的晶狀體上皮細胞再生而來，如果沒有晶狀體囊，晶狀體再生則不能發(fā)生 41。 狀體再生的分子生物學研究 晶狀體再生相關的信號途徑 血酶信號途徑 損傷可以導致脈管系統(tǒng)中凝血素的釋放，然后凝血因子激活 凝血酶。凝血酶在蠑螈細胞重新進入細胞周期中起到重要作用。用凝血酶處理蠑螈骨骼肌小管可以誘導增殖，而小鼠的肌小管沒有這種反應 42。有人推測，這種物種特異性的反應說明凝血酶與再生組織中的有絲分裂后的細胞重新進入細胞周期相關，并發(fā)揮重要作用。 研究支持了這一推測，他們的研究表明，在體外用凝血酶處理成體蠑螈背緣和腹緣的色素上皮細胞，可以使它們重新進入有絲分裂的 對于凝血酶在晶狀體再生中作用的最有力的證據(jù)來自于 研究。 他們的研究表明，在蠑螈晶狀體摘除后 20 分鐘到大約 7 天的時間內(nèi)，凝血酶在背緣虹膜瞳孔緣被激活，在不能再生晶狀體的虹膜腹緣則沒有凝血的激活 43。凝血酶的抑制導致虹膜背緣細胞不能重新進入細胞周期，晶狀體再生不完全或被抑制 43, 44。 號途徑 其受體對于晶狀體發(fā)育有重要作用。 控制晶狀體蛋白基因表達及調(diào)節(jié)表達的時空模式中起到支配性的作用。另外，它們在晶狀體纖維分化和維持中也發(fā)揮重要作用。在雞中 遠端視泡的表達導致晶狀體區(qū)域的擴大 45。在轉(zhuǎn)基因小鼠中過量表達 致晶狀體上皮的不正常分化 46, 47。許多體與晶狀體再生相關。用 理晶狀體摘除后的蠑螈眼睛可以誘導虹膜背緣產(chǎn)生具有不正常極性的晶狀體和兩個晶狀體的形成 48。 于虹膜背緣上皮細胞體外再生晶狀體是必需的。體外培養(yǎng)的背緣虹膜細胞只有在 處理時才形成晶狀體 49。 人的研究表明，眼內(nèi)注射組體能誘導虹膜背緣在沒有摘除原有晶狀體的情況下再生晶狀體。 ，如 0。眼內(nèi)注射 而在背緣虹膜形成晶狀體樣結(jié)構(gòu) 51。 非洲爪蟾晶狀體再生中也發(fā)揮重要作用。體外培養(yǎng)的非洲爪蟾蝌蚪外角膜在 在的情況下發(fā)生分化。不同的 體也在晶狀體再生中有重要作用，包括 8, 52, 53。研究發(fā)現(xiàn)， 表達限定在去分化的背緣虹膜，在調(diào)節(jié)晶狀體再生中發(fā)揮作用。將蠑螈培養(yǎng)在 無尾兩棲類晶狀體發(fā)育及再生過程中 因和 7 這種能抑制 身磷酸化的化學物質(zhì)的溶液中，晶狀體再生和纖維分化被抑制，這表明 號在晶狀體再生中起到關鍵作用 52。用 理背緣虹膜色素上皮細胞團也能抑制這些細胞團的晶狀體再生 49。將 染至培養(yǎng)的蠑螈背腹緣虹膜色素上皮細胞，然后移植到宿主蠑螈中，并不能誘導腹緣虹膜再生，虹膜背緣再生晶狀體也沒有收到影響，這表明 號對于晶狀體再生并不是充分的 50。 號途徑 號途徑，尤其是 脊椎動物眼睛和晶狀體發(fā)育中起重要作用 54, 55。研究表明， 晶狀體再生中也發(fā)揮重 要作用。有研究報道，抑制 處理可以誘導沒有再生能力的腹緣虹膜再生晶狀體 56。在這個實驗中，研究者用重組型鼠腱蛋白或者截短的沒有信號能力的人類 理蠑螈虹膜外植體來抑制 號，然后再將其重新抑制到宿主蠑螈中。兩個處理均能誘導正常情況下無再生能力的腹緣虹膜再生晶狀體。另外，研究發(fā)現(xiàn)被 理 的背緣虹膜外植體的晶狀體再生能力減弱。 號途徑 在晶狀體發(fā)育中， 號途徑對于晶狀體上皮分化成晶狀體纖維細胞是必需的 57 受體基因的純合子突變小鼠的晶狀體上皮不能進行充分分化 58。另外， 號能導致 小鼠胚胎眼周外胚層的功能缺失導致異位類晶狀體的形成 59。為了研究 號在晶狀體再生中的可能作用，研究者使用了 抑制劑以及 白復合物的小分子拮抗物 60, 61，不過使用這些分子并不能決定性地說明 號在晶狀體 再生中的作用，因為 多種作用并且存在多種 號途徑。在以上兩種情況下，背緣和腹緣的虹膜外植體在體外培養(yǎng)中被處理，然后被移植到摘除晶狀體的蠑螈眼睛中。這兩種處理對 號的激活或抑制均沒有影響晶狀體再生，這表明 號在晶狀體再生中沒有發(fā)揮決定性的作用。 類視黃醇及其受體在晶狀體發(fā)育和再生中都起到重要作用 28, 62。小鼠胚胎的視黃酸缺陷導致晶狀體板的形成和視泡內(nèi)陷失敗，最終導致小眼性狀。視黃酸受體在 外，視黃酸及它的其它類似物調(diào)節(jié)晶狀體細胞中的基因表達，并在維持上皮中起到重要作用 47。在發(fā)育過程中，視黃酸還能控制神經(jīng)視網(wǎng)膜細胞的命運 63, 64。外源的視黃酸能導致異常的晶狀體分化 65。視黃酸及視黃酸受體在蠑螈晶狀體再生中起到關鍵作用。晶狀體摘除后，用視黃酸受體的拮抗物處理蠑螈嚴重減弱了背緣虹膜的再生能力 39, 蘭州大學碩士學位論文 無尾兩棲類晶狀體發(fā)育及再生過程中 因和 8 66。 晶狀體發(fā) 育及再生相關的轉(zhuǎn)錄因子 因家族編碼的轉(zhuǎn)錄因子包含一個進化上保守的 泛分布在脊椎動物和無脊椎動物中，在發(fā)育過程中起到重要作用 67。根據(jù)序列同源性，可將 68，其中 69。在雞胚中，通過 析證實， 晶狀體中主要表達的 因。雞胚中，視泡和表皮頭 部外胚層接觸后， 始在與視泡相對的外胚層表達，同時表達 細胞開始形成晶狀體板并且表達 后形成晶狀體， 晶狀體的形成過程中持續(xù)表達。在小鼠的晶狀體發(fā)育過程中， 表達情況與在雞胚中的類似，不同的是，當小鼠的晶狀體分化完成后， 表達量急劇減少 70。 已經(jīng)有 實驗證明， 結(jié)合起始 1而起始晶狀體的分化。在雞胚的側(cè)面頭部外胚層，通過電轉(zhuǎn)實驗同時導入表達 表達載體，發(fā)現(xiàn)在眼睛以外的胚胎表面形成了表達 1些細胞團具有晶狀體板的一些特性 ,即有增厚的上皮結(jié)構(gòu)并且表達作為晶狀體標志的 171，這表明 復合物不只是激活 1際上還起始晶狀體從頭部外胚層發(fā)生 。 相互作用還調(diào)節(jié)晶狀體發(fā)育的其它步驟。有實驗發(fā)現(xiàn)，在表達 頭部外胚層，外源性的和異位的 表達導致 達的穩(wěn)定性 71，這表明 維持機制依賴 作用。 因上維持 達的基因元件已經(jīng)被識別，這個元件是由 結(jié)合而激活的 72。在雞的晶狀體發(fā)育中， 白，尤其是 73，而研究表明 ， 轉(zhuǎn)錄是由 復合物激活的 74，一旦 白的基因被激活， 白和 2 3 又協(xié)同作用增強 75。在小鼠晶狀體發(fā)育中， 白（ 2 3）和 白相互作用激活 70, 76, 77。在爪蟾中， 且在早期發(fā)育過程中， 表達限制在中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在用成纖維細胞生長因子處理的動物極中， 過量表達誘導神經(jīng)分化標志的產(chǎn)生，另外， 顯性負性突變子的過量表達導致神經(jīng)分化標志的減少，這些表明 爪蟾的神經(jīng)發(fā)育中是必不可少的 78, 79。通過測到 爪蟾胚胎 11期開始表達直到 38期。通過 in 實驗發(fā)現(xiàn)，爪蟾胚胎 28期時 大腦和視泡表達，35 期時 大腦神經(jīng)視網(wǎng)膜和晶狀體表達 78。在正常蠑螈虹膜中， 是晶狀體摘除后， 虹膜背緣的表達水平提高，尤其蘭州大學碩士學位論文 無尾兩棲類晶狀體發(fā)育及再生過程中 因和 9 是晶狀體再生出來后， 達水平顯 著提高 80。另外，有研究通過 現(xiàn)，在爪蟾晶狀體摘除后 42角膜的表達量急劇上升 81。 晶狀體發(fā)育中發(fā)揮非常重要的作用。 雜合子突變導致人的無虹膜畸形及小鼠的小眼性狀 4, 82。在果蠅和爪蟾中， 過量表達誘導異位眼睛的形成 83, 84。在預定晶狀體上皮定向表達 顯性負性突變體可以抑制 而導致晶狀體板形成失敗 74。研究發(fā)現(xiàn)，在蠑螈中， 晶狀體再生的早期活動相關，調(diào)節(jié)細胞增殖和晶狀體纖維分化。 背腹緣虹膜的增殖細胞中均有表達， 達的下調(diào)使虹膜色素上皮細胞的增殖顯著減少，從而阻礙了晶狀體再生，但是背緣虹膜的去分化誘導沒有受到抑制。在晶狀體再生的早期敲除 致晶狀體蛋白的表達受到抑制，阻礙了晶狀體纖維分化。但是，一旦晶狀體蛋白表達和晶狀體纖維分化開始了，缺失則不會影響晶狀體蛋白的 表達和晶狀體纖維的維持，而對增殖的影響依然存在 85。研究表明， 表達和爪蟾外角膜及上皮的晶狀體再生能力密切相關。 外角膜及角膜周圍上皮組成的晶狀體形成區(qū)域表達，而在晶狀體形成區(qū)域以外的不具備晶狀體再生能力的頭部上皮及側(cè)面上皮則沒有表達。將眼睛移植到頭部上皮和側(cè)面上皮下，只有頭部上皮在移植后獲得了晶 狀體再生能力，能在被移植到玻璃體腔后形成晶狀體，而 在覆蓋移植眼睛的頭部上皮中重新表達。另外，對側(cè)面表皮注射 使其獲得晶狀體再生的能力，使其在被移植到玻璃體腔后形成晶狀體 86。 晶狀體形成所必需的一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在晶狀體板及 晶狀體發(fā)育后期的晶狀體上皮表達 87。在青鳉胚胎 2胞期錯位表達 以導致異位晶狀體在耳基板形成 88，在青鳉胚胎二細胞期敲除表達導致前腦和眼睛的缺失 89。在完整的蠑螈虹膜組織， 背緣虹膜及腹緣虹膜均表達，在腹緣虹膜的表達更高。然而，在晶狀體再生中， 表達只在背緣虹膜有顯著增加。另外，用 黃酸處理腹緣虹膜色素上皮誘導腹緣虹膜轉(zhuǎn)分化。 獨并不能引起腹緣虹膜色素上皮細胞轉(zhuǎn)分 化，而是需要視黃酸（ 存在。有人提出， 背腹緣虹膜表達增強到高于各自的正常閾值是誘導晶狀體再生的關鍵，而不是 相對量 56。 果蠅轉(zhuǎn)錄因子 小鼠的同源物。 要在晶狀體中表達，調(diào)節(jié)晶狀體蛋白在晶狀體纖維細胞中的表達 90。在雞胚中， 件結(jié)合激活 91。 無尾兩棲類晶狀體發(fā)育及再生過程中 因和 10 還可能與晶狀體上皮分化為晶狀體纖維細胞的 過程相關。 除的小鼠晶狀體不能發(fā)生晶狀體纖維細胞的分化而維持空泡狀態(tài)，晶狀體后部的上皮細胞增殖異常，細胞周期抑制蛋白 表達下降，并產(chǎn)生不正常的凋亡。正常晶狀體中 在 除的小鼠中，致晶狀體后部的細胞不能延伸分化成纖維細胞。這說明，在 除的小鼠晶狀體中，晶狀體纖維細胞的分化能夠開始，但是后期停滯，因而推測 晶狀體纖維細胞終端分化及延伸過程所必須的92。在爪蟾晶狀體再生過程中， 先在晶狀體再生的第三階段即晶狀體摘除后 4時在新形成的細胞團中被檢測到，但是在表達了 角膜周圍區(qū)域沒有表達，當再生晶狀體開始分化， 晶狀體上皮及晶狀體纖維細胞中都有表達，隨后，隨著晶狀體再生基本完成， 再生晶狀體中的表達逐漸下降 93。 于晶狀體蛋白 晶狀體蛋白是晶狀體內(nèi)主要 的和特異性的蛋白質(zhì)，構(gòu)成了晶狀體內(nèi)可溶性蛋白的 90%以上。哺乳類 、 兩棲類和魚類中有三種晶狀體蛋白： 晶狀體蛋白， 晶狀體蛋白和 晶狀體蛋白；鳥類和爬行類中則有 目前 種研究結(jié)果相差很大。導致這種差異的主要原因是，復合體的分子量測定結(jié)果取決于很多參數(shù)，例如濃度，溫度， 子強度，以及所研究的晶狀體的年齡和物種。另外一個原因是，許多研究者用體積 排阻色譜法估量 使用這種方法得到的數(shù)據(jù)并不精確，因為蛋白與柱子之間有相互作用，洗脫液的體積依賴于洗脫分子的形狀，另外還需要合適的標準蛋白進行校準 94。 人對牛的 們的研究結(jié)果顯示 7稀釋溶液中的平均分子量大約是 550天然狀態(tài)下約為 7005。在哺乳動物晶狀體中，:194。 其他組織中有微量表達， 96到目前為止，我們還沒有得到 因在于 的亞單位數(shù)目在十個和四十個之間變化 94, 99。為了使晶狀體達到必需的折射率，晶蘭州大學碩士學位論文 無尾兩棲類晶狀體發(fā)育及再生過程中 因和 11 狀體中的蛋白濃度必需非常高，例如，在人類的晶狀體中心，蛋白濃度達到了450 mg/00。在典型的哺乳動物晶狀體中， 5%。因此它是使晶狀體達到這種必需折射率的主要蛋白成分之一 94。 胸腺和脾中也有極微量的表達。在人類中， 1 號染色體上，編碼有 173 個氨基酸殘基的蛋白。 碼，這個基因包含三個外顯子和兩個內(nèi)含子，其中三 個外顯子分別編碼： 63， 41 位， 67氨基酸殘基。 因突變可以導致隱性或顯性白內(nèi)障，這除了與 和 101, 102。 1998 年， 人首次報道了 116C 導致一個家族的常染色體顯性白內(nèi)障 103。對敲除 抑制 前關于 94。 在人類中， 1 號染色體上，編碼有 175 個氨基酸殘基的蛋白。維持晶狀體透明性起結(jié)構(gòu)性的作用。如骨骼，心肌，在皮膚，腦和腎中也有少量表達，說明它有通用的細胞功能 104, 105。 透壓和氧化的損害。在 纖維細胞中， 可以和變性蛋白不可逆結(jié)合，阻止大的光散射聚合物的形成。在晶狀體中，它 的這種功能對于防止白內(nèi)障有重要作用，因為蛋白質(zhì)很容易受到滲透壓和氧化應激的影響而變性和聚集 106, 107。另外，研究發(fā)現(xiàn) 如老年癡呆癥 108，彌漫性路易體病 109，克雅氏病 110，尤其是在亞歷山大癥中，它形成了羅森塔爾纖維的主要成分 111。在這些疾病中， 是 清楚。 5%，是 /12。在人類中， 編碼 于22 號染色體上，并有類似的基因結(jié)構(gòu)。 無尾兩棲類晶狀體發(fā)育及再生過程中 因和 12 與其它蛋白之間的相互作用對于晶狀體透明性有關鍵作用 113。 新生鼠晶狀體中它占可溶性蛋白總量的 114，并且在晶狀體上皮沒有表達，但是它的表達與纖維細胞的開始伸長同時發(fā)生 115因此它是晶狀體纖維分化的標志 ，且調(diào)控其轉(zhuǎn)錄的分子機制與纖維細胞分化的分子機制部分相同。 調(diào)控，它們結(jié)合于 同調(diào)節(jié)其表達 118。有研究表明 ，在雞胚中 1 件（ 68） ，在晶狀體細胞和非晶狀體細胞中激活啟動子活性。另外，雞的 不同的細胞條件下作用不同。研究證明，在這個區(qū)域，至少有一個親和力相對低的 合位點介導 活，兩個高親和力的點介導 抑制作用 91。 件結(jié)合，并激活 三個順式元件都結(jié)合，并且是 轉(zhuǎn)染實驗中，當 轉(zhuǎn)染，它們激活 此，根據(jù)這三個轉(zhuǎn)錄因子在晶狀體發(fā)生中的時空表達，有人提出，在晶狀體上皮中 制在分化的晶狀體纖維中， 代 118。 5%，分為 A， B， C， D 和 E 晶狀體蛋白。 N 端與 C 端相似 119。在人類中， 有一個無活性的啟動子，并且在第二個外顯子有一個終止突變。在 白內(nèi)障中， 0 倍，大約增加到了 0%，從而引起了白內(nèi)障的發(fā)生，這是第一例與假基因再激活相關的人類疾病 120。 狀體蛋白的時空表達 各類晶狀體蛋白的合成模式在不同動物的晶狀體發(fā)育期間有時間和空間上的差異。在大鼠中， 2 天胚胎的晶狀體窩細胞中合成，在14 天胚胎中，所有晶狀體細胞表達晶狀體蛋白。 胎的早期晶狀體泡后部合成，例如預定纖維細胞中，在晶狀體形態(tài)發(fā)生的后期， 121。大鼠晶狀體蛋白合成的時間順序與小鼠的類似。在 ， 無尾兩棲類晶狀體發(fā)育及再生過程中 因和 13 體蛋白 122。而在 正常晶狀體發(fā)育和晶狀體再生過程中， 123, 124。在正常雞胚中， 125，然而在突變體 胚中， 126。大鼠中 其它被研究物種的類似。在小鼠，雞胚和 晶狀體再生過程中， 皮細胞，預定纖維細胞和纖維細胞中表達。雖然 是它在 常和突變的雞胚中的這些位置有表達 124哺乳類中唯一在晶狀體形態(tài)發(fā)生中表達 體蛋白的是大鼠。在所有的兩棲動物中，無論是在正常晶狀體發(fā)育過程中還是在晶狀體從虹膜上皮再生的過程中， 體蛋白的表達限于預定纖維細胞和纖維細胞中 124。 狀體蛋白的功能 子伴侶作用 種特性是 1992 年發(fā)現(xiàn)的，實驗使用了純化的牛 且與其它小熱激蛋白和 賴性的分子伴侶 有這種特性。研究者還測定了 用重組蛋白，實驗證實 127蛋白質(zhì)在晶狀體中不周轉(zhuǎn)，為了維持透明度，晶狀體蛋白必需在生命過程中保持穩(wěn)定不變性。 著年齡的增長， 而阻止它們進一步聚集和沉淀，延緩晶狀體的渾濁化。 0%，通過與其它晶狀體蛋白早期未折疊的中間物結(jié)合，它可以阻止它們的聚集和不溶解化 106。 制細胞凋亡和細胞保護作用 131, 132。 經(jīng)有研究證明，在肌細胞中，它在連接分化過程和細胞凋亡抑制中發(fā)揮核心作用 133。通過在應激誘導的細胞中過量表達 究者發(fā)現(xiàn)這種蛋白可以延緩 成熟， 參與細胞凋亡的核心酶 134。這些研究在晶狀體上皮細胞中也得到證實。被誘導過量表達 催化學物和其它應激條件的抗性增強135, 136。在培養(yǎng)的細胞中， 136。研究證明，即使是在無應激的情況下，敲除了 137。這種作用的一個可能機制是與凋亡前蛋白如 合 138。研究者發(fā)現(xiàn) ， 無尾兩棲類晶狀體發(fā)育及再生過程中 因和 14 亡的機制有顯著差異 139。有人提出，在視網(wǎng)膜中， 101。 蛋白酶體相互作用 近年來的研究提出了 個功能與變性蛋白的降 解相關。 0S 蛋白酶體結(jié)合并與 C8/C8/ 20S 蛋白酶體的一個亞基，它可以影響蛋白酶體復合物的裝配，促進結(jié)合在 外， 組成成分 互作用，研究證明這種相互作用對細胞周期蛋白 降解是必須的 101, 140。 細胞骨架相互作用 細胞骨架在形態(tài)發(fā)生過程中和應激條件下發(fā)生廣泛的重構(gòu)，因此是保護和修復的重要對象。 間絲和微管 141。在晶狀體中， 142。對于晶狀體蛋白質(zhì) 143。在心臟中的 疫共沉淀研究顯示 144, 145。在體外，重組 145。這些研究表明， 受射應激的轉(zhuǎn)染細胞中， 135, 136。 （ 1） 與肌動蛋白絲直接相互作用；（ 2）與可溶性的肌動蛋白亞基相互作用。 應激條件下，心肌細胞中過量表達的 體外， 101。 與晶狀體上皮細胞生長 A 基因敲除的小鼠晶狀體細胞的生長比正常晶狀體上皮細胞的生長慢50%，說明 135。進一步的研究表明，在敲除 管細胞骨架的形成受到影響，有絲分裂后期，分離的染色體間的微管 相比野生型細胞減少了 137, 146。并且， A 基因敲除的晶狀體上皮細胞的凋亡率也比野生型細胞高。同時測量 記細胞的結(jié)果顯示，這些細胞是在有絲分裂后期死亡的。在死亡的細胞中，有絲分裂后期和胞質(zhì)分裂沒有完 成，這與微管在分裂后期和胞質(zhì)分裂期沒有整合有關。在正常分裂的晶狀體上皮細胞中， 些研蘭州大學碩士學位論文 無尾兩棲類晶狀體發(fā)育及再生過程中 因和 15 究表明， 是和 明 147。另外， 而影響細胞生長 148。在小鼠晶狀體上皮細胞中同時敲除胞延遲進入 S 期且 S 期延長，并且出現(xiàn)了嚴重的微管重組異常 149, 150。 驗動物簡介 洲爪蟾 非洲爪蟾屬于兩棲綱無尾目負子蟾科，爪蟾屬， 學名： 洲爪蟾主要分布在撒哈拉以南非洲東南部的池塘和河流中，為完全水生中，喜好靜止水域的環(huán)境。白天多潛藏在水底深處，夜晚則會爬到淺灘處。體長可達 12 厘米，雄性比雌性會小一截，后肢具有三對角質(zhì)腳爪，頭部和身體扁平，沒有 外耳和舌頭，由于沒有舌頭只能利用前肢攪食水中的脊椎動物。人工飼養(yǎng)的條件下，一般用動物肝臟或植物類的水藻進行喂養(yǎng)。非洲爪蟾是發(fā)育生物學的