【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）鐮形扇頭蜱肌鈣蛋白I基因的克隆及表達(dá)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)碩士論文

密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士 學(xué)位論文 鐮形扇頭蜱肌鈣蛋白 I 摘 要 蜱是一種重要的體表寄生蟲，是許多人和動(dòng)物疾病的傳播媒介，經(jīng)蜱傳播的病原體有病毒、立克次體、螺旋體以及原蟲。 為了尋找新的抗蜱免疫候選抗原 ,我們 從鐮形扇頭蜱半飽血雌蜱唾液腺 庫(kù)篩選目的 列 ,通過 法獲取該 長(zhǎng)序列。 用 析該基因在蜱體內(nèi)的 分布 , 并 研究該基因 是否含內(nèi)含子 。將該基 因 連接 到 ）表達(dá)載體， 并轉(zhuǎn)入宿主菌 經(jīng) 導(dǎo) 表達(dá) ,并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行 析。結(jié)果從該文庫(kù)的 的肌鈣蛋白 I（ 因疑似序列 ,經(jīng) 5法得到了 該基因的全長(zhǎng)序列?；蛉L(zhǎng) 852編碼 219 個(gè)氨基酸 ,預(yù)測(cè)分子量約為 25經(jīng)同源性比較，該基因 預(yù)測(cè)的氨基酸序列與長(zhǎng)角血蜱肌鈣蛋白 I(I:14041807)有很高的同源性（同源性為 ,肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于 147基酸處 ,且 與長(zhǎng)角血蜱肌鈣蛋白 I 肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)完全相同，表明該基因是鐮形扇頭蜱 肌鈣蛋白 I 基因。 析表明，該基因在鐮形扇頭蜱卵、幼蜱、若蜱、成蜱以及殼、唾液腺、腸均有表達(dá)。 以 鐮形扇頭蜱基因組 模板擴(kuò)增到編碼肌鈣蛋白 序分析，該序列不含內(nèi)含子。 因 可以在 高效表達(dá) ,融合蛋白分子量大小為 45析表明，抗 組蛋白兔血清可以識(shí)別蜱體內(nèi)的 在 226間有兩條帶，說(shuō)明在蜱體內(nèi)可 能同時(shí)存在兩個(gè)大小不等的 上所述，本研究首次克隆、表達(dá)了鐮形扇頭蜱肌鈣蛋白 I 基因，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步研究，為該基因的進(jìn)一步研究打下了基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞 : 鐮形扇頭蜱；肌鈣蛋白 I；克??；表達(dá) a of of as To a a of of we in by ,)we of a (ST of 5219 5of a I:14041807)of in . at 47. nI nI in NA nI CR NA as no 45 26nI at in To a in a be to ; 錄 第一章 引言 1 第二章 材料與方法 6 材料與試劑 6 鐮形扇頭蜱的實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng) 11 鐮形扇頭蜱總 取及鑒定 11 鐮形扇頭蜱肌鈣蛋白 I 基因 列的獲取 12 鐮形扇頭蜱肌鈣蛋白 I 基因 5端的克隆 13 鐮形扇頭蜱肌鈣蛋白 I 全長(zhǎng)基因的克隆 17 析肌鈣蛋白 I 在鐮形扇頭蜱的分布情況 19 肌鈣蛋白 I 基因組序列分析 20 鐮形扇頭蜱肌鈣蛋白 I 基 因的原核表達(dá) 21 融合蛋白的純化 25 融合蛋白的復(fù)性及濃度測(cè)定 27 蛋白質(zhì)免疫原性分析 28 第三章 結(jié)果與分析 31 鐮形扇頭蜱的實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng) 31 總 提取 31 列結(jié)果及序列分析 32 目的基因 5端的克隆 32 全長(zhǎng)基因的克隆 35 肌鈣蛋白 I 在不同發(fā)育階段和不同解剖部位的 分布情況 37 基因組序列分析 38 基因的原核表達(dá) 39 重組 蛋白濃度的測(cè)定 41 析 43 第四章 討論 44 鐮形扇頭蜱的實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng) 44 5法在獲取未知基因方面的應(yīng)用 44 鑒定陽(yáng)性克隆的方法 45 融合蛋白的純化 45 肌鈣蛋白 I 46 五章 結(jié)論 48 參考文獻(xiàn) 49 附錄 54 致謝 56 作者簡(jiǎn)介 57 V 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 定引物 定通用擴(kuò)增引物 烯酰胺 ， N芐青霉素 bp 基對(duì) 血清白蛋白 補(bǔ)的 碳酸二乙酯 磷酸脫氧核苷酸 EB 化乙錠 二胺四乙酸 達(dá)序列標(biāo)簽 丙基硫代 LB B 培養(yǎng)基 OD 密度值 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 酸鹽緩沖液 of 速擴(kuò)增 端 轉(zhuǎn)錄 二烷基磺酸鈉 丙烯酰胺凝膠電泳 （羥甲基）氨基甲烷 泳緩沖液 氧核糖核酸末端 轉(zhuǎn)移酶 肌鈣蛋白 I 43 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 1 第一章 引 言 一 . 蜱類簡(jiǎn)介 蜱是一類營(yíng)專性寄生生活的不完全變態(tài)的節(jié)肢動(dòng)物 ,隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門蜱螨亞綱寄螨目蜱亞目蜱總科 ,包括硬蜱科、軟蜱科和納蜱科 3 科，其中最常見、危害最大的為硬蜱科，其次為軟蜱科，納蜱科僅在非洲南部發(fā)現(xiàn)一種。 目前，世界上已發(fā)現(xiàn)的蜱超過 800 種，在中國(guó)已記錄的蜱有 110 種 ，主要分為硬蜱和軟蜱兩大類。蜱的發(fā)育需經(jīng)過卵、幼蟲、若蟲和成蟲 四個(gè)階段，其中幼蟲、若蟲和成蟲這三個(gè)階段都要在人或動(dòng)物身上吸血，在幼蟲變?yōu)槿粝x以及若蟲變?yōu)槌上x的過程中，都要經(jīng)過蛻皮。根據(jù)各發(fā)育階段吸血時(shí)是否更換宿主可將硬蜱分為一宿主蜱、二宿主蜱和三宿主蜱。蜱的繁殖能力很強(qiáng)，一般硬蜱一生產(chǎn)卵數(shù)千粒，璃眼蜱屬和花蜱屬中有些種類產(chǎn)卵數(shù)可達(dá) 20000 粒以上，軟蜱一生產(chǎn)卵多次，一般情況下可產(chǎn)卵 1000 余個(gè)。蜱的活動(dòng)具有明顯的季節(jié)性，在季節(jié)變化分明的地區(qū)，他們一般都在一年中溫暖的季節(jié)活動(dòng)。在同一地區(qū)，不同種類的蜱活動(dòng)季節(jié)各不相同，而同一種蜱在不同地區(qū)，由于氣候和環(huán)境的不同，活動(dòng)時(shí)間 的長(zhǎng)短也有差別。 蜱類絕大多數(shù)寄生在哺乳動(dòng)物體表，少數(shù)寄生在鳥類、爬行類以及兩棲類。蜱不僅吸食大量血液，刺激叮咬部位發(fā)炎，有的還可以引起宿主呈現(xiàn)功能麻痹性癱瘓，更為重要的是它是許多病原體的傳播媒介和保蟲宿主，它已成為人類疾病的第二大傳播媒介 , 僅次于蚊子。它是許多細(xì)菌、病毒、真菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體、原蟲和線蟲的傳播媒介或儲(chǔ)存宿主，其中大多數(shù)是人、畜禽和人畜共患病，如森林腦炎、萊姆病、出血熱、 Q 熱、蜱傳斑疹傷寒、野兔熱、布氏桿菌病等。蜱及蜱傳播疾病引起的經(jīng)濟(jì)損失十分巨大，據(jù) 計(jì)，世界上有 80%的牛被 蜱侵襲，僅硬蜱給畜牧業(yè)造成的損失，全球每年就高達(dá) 70 億美元。 蜱的防治 方法 主要有以下幾種：化學(xué)防治、生物防治、遺傳防治和免疫防治。（ 1）化學(xué)防治：化學(xué)防治是最主要的防治方法，過去 國(guó)內(nèi)外 常用 有機(jī)氯制劑 , 有機(jī)磷制劑 , 有機(jī)氮制劑來(lái)滅蜱，這些藥物雖然有效 , 但對(duì)人、畜毒性大 , 殘效期長(zhǎng) , 造成極大的環(huán)境污染 , 有的現(xiàn)已被相關(guān)管理部門禁止使用。目前多采用擬除蟲菊酯類化合物 (如滅菊酯類 ) 和抗生素類藥物 (如伊維菌素 )。由于化學(xué)藥物的長(zhǎng)期使用而出現(xiàn)的 食品安全、環(huán)境污染以及蜱的抗藥性問題，促使人們?cè)O(shè)法尋找新 的防治策略。（ 2）生物防治： 自然界中有些動(dòng)物可大量捕食蜱類。如一些鳥類、嚙齒動(dòng)物、家禽、螞蟻、寄生蜂等。曾發(fā)現(xiàn)有 5 種膜翅目的跳小蜂寄生于蜱體內(nèi) ,它們將卵產(chǎn)于蜱體內(nèi) , 待發(fā)育成成蟲時(shí) , 才從蜱體飛出 , 寄生后不久 , 蜱即死亡。據(jù) 000)報(bào)道 ,昆蟲病原真菌 (109孢子體/殺死附尾扇頭蜱 (彩飾花蜱 (全部幼蟲、 80%若蟲和 80%成蟲。（ 3）遺傳防治：利用 遺傳學(xué)方法改良牲畜品種及利用輻射、化學(xué)不育劑、激素等可使蜱產(chǎn)生染色體異位 , 失去生殖能力 , 然后將它們釋放到野生種群中 , 在那里讓處理的成蟲與野生成蟲交配。這樣 , 下一代的數(shù)量就會(huì)大大的減少 , 使蜱的自然種群不斷衰減。（ 4）免疫防治： 澳大利亞學(xué)者利用從微小牛蜱的腸上皮發(fā)現(xiàn)的 成重組疫苗，對(duì)微小牛蜱有一定的保護(hù)效果，成為到目前為止唯一的商業(yè)化的抗蜱疫苗?？跪缫呙缭隍珙惙乐沃芯哂泻艽蟮臐撃?,它比傳統(tǒng)的化學(xué)防治更有應(yīng)用前景 ,但目前尚未實(shí)現(xiàn)大面積應(yīng)用 ,主中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 2 要原因是由于對(duì)疫苗的認(rèn)識(shí)尚十分缺乏、技術(shù)不成 熟和成本等問題，目前的研究重點(diǎn)集中在分離、純化、鑒定與蜱類生理功能密切相關(guān)的目標(biāo)抗原 ,并對(duì)其生物功能進(jìn)行研究。 鐮形扇頭蜱（ 于硬蜱科扇頭蜱屬。該蜱是三宿主蜱，在我國(guó) 3份在宿主體上發(fā)現(xiàn)成蟲，主要寄生于水牛，也能寄生于黃牛、豬、山羊、綿羊、犬、野豬、野兔、水鹿等動(dòng)物，有時(shí)也侵襲人。該蜱是我國(guó)南方的優(yōu)勢(shì)蜱種，分布全國(guó) 15 個(gè)省，主要傳播牛的巴貝斯蟲病、馬巴貝斯蟲病、吉氏巴貝斯蟲病。 二 與其它的吸血節(jié)肢動(dòng)物相比，硬蜱 的吸血時(shí)間特別長(zhǎng)，一般在 1014 天才能達(dá)到飽血狀態(tài)。在蜱的長(zhǎng)時(shí)間吸血過程中，必然引起宿主一系列免疫排斥和防御反應(yīng)，為了克服宿主的排斥反應(yīng)，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間吸血，蜱產(chǎn)生一些抗凝血因子、免疫調(diào)節(jié)分子、抗菌多肽等功能分子來(lái)使其持續(xù)吸血，這些功能分子都具有候選疫苗價(jià)值。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷應(yīng)用，已經(jīng)從蜱的唾液腺、血淋巴、腸道等組織、器官分離了許多重要的功能分子，它們?cè)诳鼓⒚庖哒{(diào)節(jié)、固定口器、維持蜱的正常生理代謝等方面起重要作用，其中部分功能分子顯示出了抗蜱免疫候選抗原的重要價(jià)值，有些已經(jīng)成功的被制成基因工程苗。 從現(xiàn)有的研究看，蜱體內(nèi)的功能分子有如下幾類 : (1)抗凝血分子 與其它吸血昆蟲一樣 ,蜱的吸血會(huì)立即引起宿主的凝血反應(yīng) ,從而阻止了蜱的持續(xù)吸血 ,為了完成持續(xù)的吸血以及病原的傳播 ,蜱分泌了具有抗凝血作用的功能分子來(lái)達(dá)到目的。 1990年 白鈍緣蜱 (離鑒定了第一個(gè)蜱抗凝血分子 分子量為 6人類凝血因子 迄今為止已經(jīng)從 毛白鈍緣蜱分離鑒定了 6種 抗凝血分子 ,從 薩氏盾緣蜱 分離鑒定了 3種 抗凝血分子 ,從肩突硬蜱分離鑒定了 2種 抗凝血分子 ,從 微小牛蜱 、 美洲花蜱、附尾扇頭蜱、 截形璃眼蜱 、 變異革蜱各 分離鑒定了的 1種抗凝血分子。 (2)免疫調(diào)節(jié)分子 蜱可以調(diào)節(jié)宿主的天然免疫和獲得性免疫。 1982 年 一次報(bào)道了蜱對(duì)宿主具有免疫調(diào)節(jié)作用，隨后，許多實(shí)驗(yàn)室用蜱的唾液或唾液腺粗提物免疫宿主，觀察唾液相關(guān)分子對(duì)宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)的影響，結(jié)果表明蜱具有的免疫調(diào)節(jié)作用為：阻斷補(bǔ)體的激活 ；降低癢覺反應(yīng)；削弱 減少抗體反應(yīng)；抑制 調(diào)宿主前炎癥巨噬細(xì)胞和 巴 細(xì)胞的細(xì)胞因子反應(yīng)。 (3)粘合劑蛋白分子 粘合劑蛋白分子在固定口器，保證蜱持續(xù)吸血方面起重要作用。蜱的唾液腺粘合劑，主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，以脂蛋白和糖蛋白的形式存在，絞粘成牢固的分子結(jié)構(gòu)，只有強(qiáng)酸強(qiáng)堿才能溶解。999)從長(zhǎng)角血蜱 (液腺 庫(kù)克隆表達(dá)了一個(gè)分子量為29細(xì)胞外間質(zhì)蛋白質(zhì) ,用 組蛋白免疫兔 ,取得了良好的免疫效果， 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析表明它是一種粘合劑類分子 。 (4)酶及酶的抑制劑分子 蜱為了能夠消化血液 ,獲得營(yíng)養(yǎng)， 會(huì)分泌許多有生物活性的酶，已分離鑒定的酶有：蛋白酶 (如中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 3 絲氨酸蛋白酶，鐵蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶等等 )，蛋白酶抑制劑 (如絲氨酸蛋白酶抑制劑 )，過氧化物酶， ，羧酸酯酶等等。有些酶及酶的抑制劑分子已用于抗蜱疫苗的研究。 從附尾扇頭蜱中腸純化了兩個(gè)天門冬氨酸蛋白酶， 從微小牛蜱中腸純化了一個(gè)天門冬氨酸蛋白酶和一個(gè)組織蛋白酶 L 樣半胱氨酸蛋白酶。 從附尾扇頭蜱克隆鑒定了 3 種絲氨酸蛋白酶和 4 種絲氨酸蛋白酶抑制劑，并從長(zhǎng)角血蜱克隆鑒定了一種絲氨酸蛋白酶抑制劑。 陳靈芝等克隆并 表達(dá)了鐮形扇頭蜱的 因，根據(jù)同源性比較的結(jié)果分別 將它們 命名為組織蛋白酶 列號(hào)為 列號(hào)為 (5)抗菌多肽 抗菌多肽廣泛存在于生物體內(nèi) , 并在天然免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。 現(xiàn)已從多種蜱體內(nèi)分離出抗菌樣物質(zhì)，在蜱天然免疫中發(fā)揮重要作用。 （ 2001）首次從變異革蜱血淋巴中分離到一個(gè)分子量為 42抗菌肽 ,該抗菌肽具有很強(qiáng)的抗菌作用。幾乎同時(shí) （ 2001）也從毛白盾緣蜱克隆表達(dá)了兩個(gè)抗菌肽基因，隨后，他們又從毛白盾緣蜱克隆表達(dá)了另外兩個(gè)抗菌肽基因，這些抗菌肽基因主要在中腸表達(dá)。最近， （ 2004）從希伯來(lái)花蜱 (淋巴分離了兩種抗菌肽，這兩種抗菌肽均具有抗 G 菌和 G 菌作用。 白霞等克隆并表達(dá)了微小牛蜱的一種抗菌多肽基因，經(jīng)過初步體外抗菌實(shí)驗(yàn)證明具有一定的抗菌活性。 (6)結(jié)構(gòu)蛋白分子 (1989)從微小牛蜱克隆和表達(dá)了腸上皮細(xì)胞表面保護(hù)性抗原分子 的基因工程苗成為第一個(gè)商業(yè)化的寄生蟲疫苗。隨后分離 的 然它們單獨(dú)使用達(dá)不到預(yù)期的效果，但它們?nèi)魏我粋€(gè)與 用，都可提高疫苗的保護(hù)效果。 000)從阿根廷株微小牛蜱克隆和表達(dá)了腸上皮細(xì)胞表面保護(hù)性抗原分子 抗性和敏感的微小牛蜱株都有免疫效果 ,被認(rèn)為是比 廣譜的抗微小牛蜱抗原。 三 研究進(jìn)展 肌鈣蛋白（ n）是橫紋肌興奮收縮耦聯(lián)的主要調(diào)節(jié)蛋白，分子量為 80由三個(gè)亞單位組成 , 肌鈣蛋白 C(、肌鈣蛋白 T(和肌鈣蛋白 I(這 3 個(gè)部 分形成一個(gè)復(fù)雜的蛋白質(zhì) ,細(xì)肌絲中每隔 40并與原肌球蛋白分子密切結(jié)合。 以與 異性結(jié)合， 原肌球蛋白具有高度親和力， 能抑制肌球蛋白的 活性。 當(dāng)胞液內(nèi) 度增加到 10 時(shí) , 合 ,引起 象發(fā)生變化 , 合力增強(qiáng) ,肌動(dòng)蛋白結(jié)合力被削弱 ,使肌動(dòng)蛋白與 離 ,變成應(yīng)力狀態(tài)。與此同時(shí) ,原肌球蛋白移動(dòng)到肌動(dòng)蛋白雙螺旋溝的深處 ,消除了肌動(dòng)蛋白與肌球蛋 白結(jié)合的障礙 ,于是肌動(dòng)蛋白便與肌球蛋白的頭部相結(jié)合 ,產(chǎn)生有橫橋的肌動(dòng)球蛋白。在肌動(dòng)球蛋白中 ,肌動(dòng)蛋白使肌球蛋白的 活性大大提高 ,于是肌球蛋白催化 解 ,水解產(chǎn)生的能量迫使橫橋改變角度 ,而水解產(chǎn)物的釋放又使橫橋的位置恢復(fù) ,再與另一個(gè) 合。如此循環(huán)往復(fù)，細(xì)肌絲便沿粗肌絲滑行，肌肉發(fā)生收縮。當(dāng)胞液內(nèi) 度降低（ 10）時(shí)， 離， 與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，從而使肌動(dòng)蛋白恢復(fù)靜止?fàn)顟B(tài)；同時(shí)，原肌球蛋白亦恢復(fù)原來(lái)的位置，從而使肌動(dòng)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 4 蛋白與肌球蛋白無(wú)法結(jié)合，肌肉又轉(zhuǎn)為舒張狀 態(tài)。 肌鈣蛋白 尤其是 1987年 引起人們的極大關(guān)注 ,1995年美國(guó) 作為急性心肌梗死的最新實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。 人心肌 4以兩種形式存在于心肌細(xì)胞內(nèi) ,即小部分游離于胞質(zhì)中 ,為可溶性 ,大部分以結(jié)構(gòu)蛋白形式固定于肌原纖維上 ,為不溶性 ,當(dāng)胞膜完整性因缺血或缺氧等受到破壞時(shí) ,游離的 而結(jié)合的 成為游離的以急性 早的在血中出現(xiàn) ,并持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間 ,成為診斷心肌損傷很特異且很有前景的生化指標(biāo)。 有兩種大小不同的同種型 ,一種的分子量為 27要存在于胚胎期 ,另一種分子量為 要存在于成年鼠的心肌中 ,這兩種同種型的 一些節(jié)肢動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)類似的情況，它們的 3如龍蝦、 鱟 和喇蛄 ( 用全蜱蛋白作抗原，鼠抗 以看見有 270明長(zhǎng)角血蜱肌鈣蛋白 上可以推斷 包括蜱在內(nèi)的吸血節(jié)肢動(dòng)物的 報(bào)道很少， 首次從長(zhǎng)角血蜱克隆表達(dá)了一種 0的蛋白質(zhì)，多種試驗(yàn)結(jié)果表明 0 就是長(zhǎng)角血蜱的 蛋白廣泛分布于肌肉，唾液腺、腸、殼也有分布 , 在長(zhǎng)角血蜱肌鈣蛋白 I 的免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)肌鈣蛋白 I 可以明顯延長(zhǎng)幼蜱和成蜱的飽血時(shí)間，降低幼蜱的飽血率，而且成蜱所孵化的卵的重量比對(duì)照組也有明顯的下降，說(shuō)明肌鈣蛋白 I 在抗蜱免疫中起到了較明顯的作用。 四 本實(shí)驗(yàn)室張維誼等構(gòu)建了鐮形扇頭蜱唾液腺 她們用 劑提取鐮形扇頭蜱唾液腺總 反轉(zhuǎn)錄合成 鏈，應(yīng)用 成雙鏈 其形成兩端分別帶有 粘性末端。經(jīng) 集 400將其連接到帶有 經(jīng)體外包裝后 , 以 達(dá)文庫(kù)。經(jīng)測(cè)定 , 該文庫(kù)庫(kù)容量為 105,重組率為 。擴(kuò)增后的文庫(kù)滴度為 1 09m L。從該文庫(kù)中隨機(jī)挑選 個(gè)單個(gè)噬菌斑到在受體菌 把質(zhì)?；木和坑诤绕S青霉素的每個(gè)平板上隨機(jī)挑選個(gè)菌落，將陽(yáng)性菌落測(cè)序 ,最終獲得個(gè)有效這些 在 現(xiàn)其中有一條編號(hào)為 基因序列非常相似，說(shuō)明這條 基因片段。 本研究擬在已有工作的基礎(chǔ)上，克隆鐮形扇頭蜱肌鈣蛋白 以后的研究工作奠定基礎(chǔ)。本研究將首先把含有 且測(cè)通，以期獲得最大長(zhǎng)度的肌鈣蛋白 后通過 而得到全長(zhǎng)基因，最后采用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)該基因進(jìn)行表達(dá)。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 5 綜上所述，肌鈣蛋 白 I 廣泛存在于蜱的肌肉等多種組織中，并在蜱的生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的作用，它與蜱的運(yùn)動(dòng)、吸血等過程密切相關(guān)，它很可能成為抗蜱疫苗的一類候選分子。所以本課題以中國(guó)南方的優(yōu)勢(shì)蜱種 鐮形扇頭蜱作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)蜱的肌鈣蛋白 I 基因進(jìn)行克隆和表達(dá)，為肌鈣蛋白 I 的深入研究提供基礎(chǔ)。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 材料與方法 6 第二章 材料與方法 料與試劑 要儀器 ： 司 電子天平 海精密科學(xué)儀器有限公司 電熱恒溫水槽 ：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 紫外透射反射分析儀 型（ 312上?？岛坦怆妰x器有限公司 電泳儀 ：大連捷邁科貿(mào)有限公司 立式壓力蒸汽滅菌器 司 玻璃儀器氣流烘干器 b 型：鄭州市上街區(qū)儀器廠 恒溫振蕩器 ：江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠 低速離心機(jī) ：上海安亭科學(xué)儀器廠 垂直板電泳槽、轉(zhuǎn)印電泳槽及電泳儀： 司 微型渦旋混合儀 ：上海瀘西分析儀器廠 型霉菌培養(yǎng)箱 ：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠 恒溫培養(yǎng)箱 ： 司 操凈工作臺(tái) ：上海淀山湖凈化設(shè)備 高速冷凍離心 機(jī) 3： 司 分析天平 ： 司 脫色搖床：江蘇興化市分析儀器廠 紫外呈像儀： 司 去離子水 :司 分光光度計(jì)系統(tǒng) 845 2A 1000 ： 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 : 鐮形扇頭蜱來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)。 新西蘭大白兔購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 菌種和質(zhì)粒 :大腸桿菌菌株 質(zhì)粒 )均為中國(guó)農(nóng)科院上海家畜寄生蟲病研究所第二研究室提供。 體購(gòu)自 司。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 材料與方法 7 要試劑 劑 , 5劑盒 ,蛋白預(yù)染 司 合酶 , 回收試劑盒 限制性內(nèi)切酶 以及 司 司 白分析試劑盒 司 質(zhì)粒純化試劑盒 司 基因組 取試劑盒 賽百盛公司 4接酶 司 氨芐青霉素 , 瓊脂糖 , 上海生工生物工程有限公司 弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑 司 低分子量蛋白 中科院上海生物化學(xué)研究所 硝酸纖維膜 , 司 蛋白胨 ,酵母提取物 司 要試劑配制 取、 變性電泳相關(guān)試劑 理的去離子水 00拌數(shù)小時(shí) (4h)， 50心管分裝， 121 ， 20菌兩次，以使 發(fā)除去， 存?zhèn)溆谩?75%乙醇 無(wú)水乙醇 75理水 25分混勻， 保存?zhèn)溆谩?10電泳緩沖液 稱量 于 100杯中，加約 70理水，攪拌溶解。用 2N 節(jié) 至 向溶液中加入下列試劑： 理 ) 2M 理 ) 2 理水定容至 100 避光保存。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 材料與方法 8 1上樣緩沖液 10電泳緩沖液 100l 甲酰胺 500l 甲醛 178l 理水 222l 充分混勻， 保存?zhèn)溆谩?酚藍(lán) 溴酚藍(lán) 理水 1分混勻， 保存?zhèn)溆谩?10mg/化乙錠（ g 去離子 水 100分?jǐn)嚢钄?shù)小時(shí)使溴化乙錠完全溶解， 將溶 液轉(zhuǎn)入棕色瓶中，室溫 保存?zhèn)溆谩?泳緩沖液 鈉鹽 g 0 力攪拌器上攪拌溶解 ,稱 2g 粒 ,逐次加入 ,調(diào) 到 解后定容至 100 50沖液（貯存液） 242g 冰乙酸 100力攪拌器攪拌溶解后，定容至 1000溫保存?zhèn)溆谩?克隆轉(zhuǎn)化相關(guān)試劑 1 液 4g 00解后，用 裝成 1份， 貯存?zhèn)溆谩?體培養(yǎng)基 蛋白胨 1g 酵母提取物 g 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 材料與方法 9 加 解，定容至 100 121 高壓蒸汽滅菌 204 保存。 體培養(yǎng)基 體培養(yǎng)基 100脂粉 勻后， 121 高壓蒸汽滅菌 20至 50 左右，加入抗生素，旋轉(zhuǎn)混勻，倒平板，待凝固后，倒置，保鮮膜包 裝， 4 保存。 泳相關(guān)試劑 30%烯酰胺 (29g N， N 1g 用 解，再定容至 1004 ，避光保存。 0濃 至 容至 1004 保存。 0.5 g 2O 80濃 至 容至 1004 保存。 10%0g 0 容至 100溫保存。 10%過硫酸胺（ 過硫酸胺 2O 120 保存，或 4 避光保存。 電泳緩沖液（ 10貯存液） 44g 0g 2O 800國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 材料與方法 10 用去離子水定容至 1000溫保存?zhèn)溆谩?樣品緩沖液（ 2貯存液） 2油 20% 酚藍(lán) 4勻溶解，加少量 容至 104 保存。 染色液 考馬斯亮藍(lán) 醇 50乙酸 10ml 2O 40解過