分子克隆技術(shù)在熱帶作物中的應(yīng)用.doc

課 程 論 文 分子克隆技術(shù)在熱帶作物中的應(yīng)用摘要：分子克隆技術(shù)在熱帶作物中主要用于建立基因文庫、分離高產(chǎn)和抗性基因、基因重組選擇適當(dāng)受體和載體以及異源基因的導(dǎo)入等。在熱帶作物品種鑒定、資源保護(hù)以及繁殖育種中起到了重要的作用。關(guān)鍵詞：分子克隆；熱帶作物分子克隆技術(shù)也稱為基因克隆技術(shù),包括把來自不同生物的基因同有與自主復(fù)制能力的載體DNA在體外人工連接,構(gòu)建成新的重組DNA,然后送入受體生物中去表達(dá),從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)和狀態(tài)的轉(zhuǎn)移和重新組合。熱帶作物是熱帶地區(qū)的栽培植物，是適于熱帶地區(qū)栽培的各類經(jīng)濟(jì)作物的總稱。主要包括橡膠；油料作物：油棕、椰子、腰果；香料作物：胡椒、香茅、香根、羅勒；纖維作物：龍舌蘭科麻類、番麻、蕉麻、爪哇木棉；飲料作物：咖啡、可可；藥材：砂仁、巴戟、檳榔、三七；熱帶水果：香蕉、荔枝、龍眼、菠蘿、芒果、油梨、番瓜、番石榴等。一、分子克隆技術(shù)分子克隆技術(shù)是七十年代初發(fā)展起來的新技術(shù)，在十年時間里已經(jīng)得到了廣泛地應(yīng)用。它不僅對分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)等學(xué)科研究起了很大的推動作用，而且在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)等實(shí)際部門也將作出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。分子克隆技術(shù)涉及面很廣，包括限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用，基因分離，載體組建，DNA片段連接，細(xì)胞轉(zhuǎn)化，重組體的篩選和鑒定，基因表達(dá)和物質(zhì)的生產(chǎn)等方面1。二、熱帶作物的發(fā)展現(xiàn)狀本世紀(jì)以來,世界熱帶農(nóng)業(yè)發(fā)展勢頭強(qiáng)勁,熱帶作物初級產(chǎn)品的產(chǎn)量從2000年的4. 85億噸上升至2006年的6. 12億噸, 5年間增長了26%。在世界熱帶經(jīng)濟(jì)作物中,產(chǎn)量增長幅度比較大的作物有油棕果、天然橡膠和木薯, 5年分別增長了45%、39%和27%。近年,熱帶水果產(chǎn)量均有不同程度的增長, 2006年香蕉、芒果、菠蘿、油梨和番木瓜的產(chǎn)量比2000年分別增加了10%、16%、21%、24%和12%。2。隨著熱作產(chǎn)業(yè)的快速穩(wěn)定發(fā)展，熱帶作物資源的不可替代性、地域的不可替代性、產(chǎn)品的不可替代性及其在中國經(jīng)濟(jì)發(fā)展和國家建設(shè)中所具有的地位日益重要?？茖W(xué)收集和保存熱帶作物資源，以使其能夠得到合理的開發(fā)利用已成為確保熱帶作物產(chǎn)業(yè)持續(xù)穩(wěn)定健康發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)3。三、分子克隆技術(shù)在熱帶作物中的應(yīng)用分子克隆技術(shù)在熱帶作物中主要用于建立基因文庫、分離高產(chǎn)和抗性基因、基因重組選擇適當(dāng)受體和載體以及異源基因的導(dǎo)入等。在熱帶作物品種鑒定、資源保護(hù)以及繁殖育種中起到了重要的作用。1、 橡膠橡膠分為天然橡膠和合成橡膠。天然橡膠主要來源于三葉橡膠樹，巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis)因膠乳產(chǎn)量高、質(zhì)量好、易于獲取而具有商業(yè)開發(fā)價值，成為世界上天然橡膠的主要來源。由于巴西橡膠樹是多年生喬木，常規(guī)育種周期長，選育種受到很大的限制。不斷發(fā)展的基因工程技術(shù)解決了傳統(tǒng)育種中不能突破的問題，其優(yōu)點(diǎn)在于可有目的地改變植物的某一性狀而不影響其他性狀，并縮短育種周期。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日臻完善，目前已經(jīng)獲得了許多轉(zhuǎn)基因植物，但是橡膠樹的基因轉(zhuǎn)化仍存在很大困難。在1994年Arokiaraj等利用基因槍法獲得了第一株轉(zhuǎn)基因橡膠植株，隨后，在1998年他們又嘗試用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化橡膠愈傷組織,但是轉(zhuǎn)化效率很低。2000年Montoro等人研究了Ca在橡膠的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中的作用，但未得到轉(zhuǎn)基因植株4,5,6。2006年王穎7等以GUS基因?yàn)閳蟾婊颍琋PT(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶,Neomycinphosphotransferase)基因?yàn)楹Y選標(biāo)記基因，用基因槍轟擊橡膠愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過質(zhì)粒DNA提取、愈傷組織誘導(dǎo)、基因槍轉(zhuǎn)化、GUS組織染色和PCR擴(kuò)增鑒定，初步確定GAI基因已經(jīng)整合到橡膠基因組中。2、 檳榔檳榔（Areca cathecu L.）是中國四大南藥（檳榔、砂仁、益智、巴戟）之首，藥用價值很高。檳榔產(chǎn)業(yè)是海南省熱帶作物產(chǎn)業(yè)中僅次于天然橡膠的第二大支柱產(chǎn)業(yè)。自1981年，在屯昌發(fā)現(xiàn)檳榔黃化病以來，瓊海、陵水、萬寧、三亞等地的檳榔種植區(qū)相繼開始發(fā)現(xiàn)黃化病的危害，發(fā)生情況逐年嚴(yán)重，發(fā)生地點(diǎn)和面積也不斷擴(kuò)大，大量檳榔植株黃化死亡，嚴(yán)重影響了海南檳榔產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展7,8。俞浩等9調(diào)查認(rèn)為萬寧、屯昌的檳榔黃化病是由缺鉀引起。金開璇等10通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)海南檳榔黃化病病株的輸導(dǎo)組織內(nèi)存在類細(xì)菌（Bacteria-like Organisms，簡稱BLO）與類菌原體（Mycoplasma like organisms，MLO）菌體，初步認(rèn)為海南檳榔黃化病是由BLO與MLO復(fù)合侵染引起的。在此之后，羅大全等11通過電鏡觀察、抗菌素注射診斷、PCR技術(shù)檢測，證實(shí)海南檳榔黃化病是由植原體（原稱類菌原體）引起，但未見從分子水平等方面對其分類地位研究的報道。車海彥12等利用植原體16S rDNA通用引物對海南感染黃化病的檳榔花苞總DNA進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，獲得約1.2 kb的特異片段，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列測定。通過BLAST程序比較、系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建及iPhyClassifier分析表明，引起海南檳榔黃化病病原植原體屬于翠菊黃化植原體組（16Sr組），且為該組中一個新的亞組，即G亞組，現(xiàn)將其暫命名檳榔黃化植原體（Arecanut yellow leaf phytoplasma，AYL）。以期為檳榔黃化病快速檢測技術(shù)體系的建立提供理論依據(jù)，為探索該病害的防治奠定基礎(chǔ)。3、香蕉香蕉屬芭蕉科(Musaceae)、芭蕉屬(Musa),是人類最早栽培的作物之一。目前具有商品價值的栽培品種,幾乎全是三倍體植物,為營養(yǎng)性結(jié)實(shí),由于它沒有種子,給繁殖和育種都帶來一定困難, 近年來,電擊法和基因槍法在單子葉植物的基因轉(zhuǎn)移上得到了廣泛的應(yīng)用,因此,對于香蕉來說,電擊法和基因槍法可能是最為有效的轉(zhuǎn)化方法。用這兩種方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化的最適宜受體是原生質(zhì)體,但也可用于帶壁的細(xì)胞如懸浮培養(yǎng)細(xì)胞,愈傷組織等。Gawel等利用限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)對香蕉19個種(或亞種)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了研究(1992)及對香蕉葉綠體DNA的RFLP進(jìn)行了分析(1991);Faure等(1993)利用三種標(biāo)記(RFLPs,RAPDs和同工酶)對二倍體野生蕉進(jìn)行了部分分子連鎖圖譜分析并對這些數(shù)據(jù)用于進(jìn)一步的遺傳、進(jìn)化及育種研究進(jìn)行了討論13。近年來，植物基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，為培育抗病毒植物新品種提供了新的途徑，Powell等將編碼煙草花葉病毒（TMV）外殼蛋白基因用植物表達(dá)載體導(dǎo)入煙草和番茄細(xì)胞中使之表達(dá)，首次獲得了抗TMV的轉(zhuǎn)基因煙草和番茄，此后，杜道林14等對海南香蕉花葉病毒外殼蛋白基因進(jìn)行分離克隆和測序，并將其構(gòu)建成植物表達(dá)載體, 為進(jìn)一步培育抗花葉病香蕉品種奠定基礎(chǔ)。4、菠蘿菠蘿又稱鳳梨(Ananas comosus)，是世界三大熱帶果樹之一，也是重要的觀賞植物和纖維植物，耐干旱瘠薄，生長迅速，因此，將CYP1A1導(dǎo)入菠蘿中可培育出具有環(huán)境凈化功能的新型果樹和觀賞植物雖有研究者進(jìn)行過菠蘿遺傳轉(zhuǎn)化研究15-16，但迄今尚未見P450基因轉(zhuǎn)化菠蘿等果樹的研究報道何業(yè)華17等在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)CYP1A1轉(zhuǎn)化菠蘿的研究中以菠蘿愈傷組織為受體，獲得了轉(zhuǎn)CYP1A1的轉(zhuǎn)基因菠蘿植株，旨在以該基因提高菠蘿對本身及土壤中殘留農(nóng)藥等POPs的降解能力。5、番木瓜番木瓜(Carica papaya Linnaeus)也稱木瓜、萬壽果,是熱帶亞熱帶多年生草本植物。我國廣東、廣西、福建、海南、云南和臺灣都有種植。對番木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因(PRSV-CP)的分離和轉(zhuǎn)基因工作始于80年代后期、90年代初期，目前在基因的分離克隆、轉(zhuǎn)基因番木瓜進(jìn)入大田的抗病試驗(yàn)等方面已取得了突破性的進(jìn)展，但對基因表達(dá)與抗病性關(guān)系方面卻研究得不多，周鵬等通過質(zhì)粒的提取、RNA斑點(diǎn)雜交和間接斑點(diǎn)ELISA等技術(shù)估測了轉(zhuǎn)基因番木瓜中mRNA、蛋白質(zhì)的表達(dá)量，進(jìn)而檢測它們與抗病能力的關(guān)系，以、揭示了PRSV-CP轉(zhuǎn)基因番木瓜表達(dá)水平與抗病能力的內(nèi)在聯(lián)系18。6、木薯木薯是三大薯類作物之一，全球第六大糧食作物，被譽(yù)為“淀粉之王”，是世界億人口賴以生存的食糧。由于我國人多地少，木薯作為一種單位面積產(chǎn)量較高的潛在糧食作物和生物能源，其生產(chǎn)對于我國的糧食穩(wěn)定和生物能源的發(fā)展有重要意義。首屆中國（博鰲）農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新論壇上獲悉，中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院僅用年的時間，已經(jīng)完成個木薯品種的基因組深度測序，同時采用幾種超高通量測序技術(shù)，綜合組裝獲得較完整的基因組草圖，基因組精細(xì)圖的完成能夠闡明木薯基因組結(jié)構(gòu)的基本特征，有利于進(jìn)行基因定位和基因調(diào)控，同時可以利用一些重要的基因來改良木薯品種，為木薯產(chǎn)業(yè)提供高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和綜合利用的新品種。甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種較好的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，它的蛋白質(zhì)加工方式和高等真核生物相似，為理想的高等真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)。目前國外從多種植物中克隆了HNL基因，其中Hasslacher等將來自三葉膠的HNL cDNA分別在大腸桿菌、釀酒酵母和甲醇酵母中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，研究結(jié)果表明三葉膠HNL cDNA在甲醇酵母中表達(dá)量最高，目的產(chǎn)物可達(dá)可溶性總蛋白的30；而haughes等在大腸桿菌中表達(dá)了來自木薯的HNL基因。王丹19等在對木薯醇腈酶cDNA的克隆及其表達(dá)載體的構(gòu)建的研究中，運(yùn)用RT-PCR從木薯幼葉組織中擴(kuò)增出HNL全長cDNA序列將其克隆至質(zhì)粒pBluescript SK中進(jìn)行序列分析，再利用PCR將其再克隆到酵母表達(dá)質(zhì)粒pPlC35K上，經(jīng)雙酶切鑒定表明成功的構(gòu)建了甲醇酵母表達(dá)載體，下一步將構(gòu)建工程菌，完善發(fā)酵條件，以實(shí)現(xiàn)木薯HNL的高效表達(dá)，為深入研究其作用機(jī)理以及開展工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。四、前景及展望與大宗農(nóng)作物相比，中國熱帶作物種質(zhì)創(chuàng)新和開發(fā)利用起步晚，長期處于落后狀況。且具自主知識產(chǎn)權(quán)的新品種不多，目前僅橡膠樹、木薯、甘蔗、荔枝、龍眼、香蕉、柱花草7個屬或種列入植物新品種保護(hù)名錄。香蕉、菠蘿、番木瓜、芒果、咖啡等主要依靠引進(jìn)國外優(yōu)良品種來發(fā)展，產(chǎn)業(yè)發(fā)展后勁嚴(yán)重不足。熱帶作物是生物技術(shù)開發(fā)和研究的重要領(lǐng)域之一，利用好包括分子克隆技術(shù)在內(nèi)的分子生物技術(shù)，充分利用和發(fā)揮現(xiàn)有的熱帶作物資源優(yōu)勢，改良現(xiàn)有推廣品種，創(chuàng)造新品種，加強(qiáng)熱帶物種資源的保護(hù)。參考文獻(xiàn)：1 敖世洲.分子克隆技術(shù)J.分子生物學(xué)雜志，1981.62 楊連珍，濮文輝,盧琨,世界熱帶作物發(fā)展趨勢及特點(diǎn)分析J.世界熱帶農(nóng)業(yè)信息，2007.123 熊惠波等.熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)現(xiàn)狀研究J.中國農(nóng)學(xué)通報，2009,25(14):283-2854Arokiaraj P,Jones H,Cheong K F,et al.Gene insertion into HeveabrasiliensisJ.Plant Cell Rep,1994,13:425-431.5Arokiaraj P,Yeang H Y,Cheong K F,et al.CaMV 35S promoterdirects-glucuronidase expression in the laticiferous system of transgenic Hevea brasiliensis(rubber tree)J.Plant Cell Rep,1998,17:621-625.6Montoro P,Teinseree N,Rattana W,et al.Effect of exogenous calcium on Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer in Hevea brasiliensis(rubber tree)friable calliJ.Plant Cell Rep,2000,19:851-855.7王穎，陳雄庭.基因槍法將GAI基因?qū)氚臀飨鹉z的研究J.熱帶亞熱帶植物學(xué)報，2006，14(3)：179-1828趙健生.檳榔黃化病的調(diào)查報告J.熱帶作物科技，1985（1）：64-49.9俞浩，馮淑芬，鄭建華.海南島檳榔“黃化病”問題調(diào)查報告J.熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，1986（3）：45-49.10金開璇，孫福生，陳慕容等.檳榔黃化病的病原的研究初報J.林業(yè)科學(xué)，1995，31（6）：556-559.11羅大全.海南檳榔黃化病研究現(xiàn)狀J.世界熱帶農(nóng)業(yè)信息，2007（6）：24-26.12車海彥.海南檳榔黃化病病原物的分子鑒定J.熱帶作物學(xué)報，2010.31（1）：83-8713賀竹梅，李寶健. 香蕉生物技術(shù)研究現(xiàn)狀與展望J.生物工程進(jìn)展，1997,17,（5）：19-2114杜道林. 香蕉花葉病毒外殼蛋白基因克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建J.廣西植物，2002,22：（1）：81-8415Sripaoraya S，Marchat R，Power J BPlant regeneration by somatic embryogenesis and organogenesis in commercial pineapple(Ananas comosus L.)JIn Vitro Cell Dev Biol-Plant，2003，39：450-455.16Ko H L,Campbell P R.The introduction of transgenes to con