基因芯片在植物研究中的應(yīng)用.doc

基因芯片技術(shù)及其在植物研究中的應(yīng)用 郭曉琴 中州大學，河南 鄭州 450044摘要：基因芯片是以預(yù)先設(shè)計的方式把大量DNA探針或基因片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龍膜等載體上，形成致密、有序的DNA分子點陣。具有高通量、微型化、自動化、快速、準確等優(yōu)點。基因芯片技術(shù)在植物的病原體檢測、抗逆性基因表達、轉(zhuǎn)基因的檢測、新基因發(fā)現(xiàn)、突變基因篩查等方面有廣泛的應(yīng)用。本文簡述了基因芯片的原理、技術(shù)特點及其在植物研究方面的應(yīng)用。關(guān)鍵詞：基因芯片；植物；病原物檢測；逆境Gene Chip Technology and Its Application in Plant Research Guo Xiao-qin Zhongzhou University， Zhengzhou 450044，ChinaAbstrat：Gene chips are pre-designed amounts of DNA probes or gene fragment in a specific arrangement which is fixed to the silicon, glass, plastic or nylon film carrier. With a high-throughput, miniaturization, automation, fast, and accurate. Gene chip technology play a important role in plant pathogen detection, resistance gene expression, transgene detection, discovery of new genes, mutation screening, etc. This paper introduces the principle of gene chips, the main technical features and its application in plant research.Keywords：gene chip; plant; pathogen detection; stress基因芯片技術(shù)是隨著人類基因組計劃的開展而發(fā)展起來的多種學科交叉滲透的高新生物技術(shù)。自1996年美國生物技術(shù)公司Affvmetrix制造了世界上第一個商業(yè)化基因芯片(Gene chips)起，基因芯片的研究和開發(fā)進入跨越式發(fā)展1。因為基因芯片技術(shù)用于基因分析的卓越優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于生命科學各個領(lǐng)域，如用于檢測基因表達，DNA測序，突變檢測，基因篩查，新基因的發(fā)現(xiàn)等2。本文簡要綜述基因芯片的原理、技術(shù)特點以及基因芯片技術(shù)在植物研究中的作用。1 基因芯片技術(shù)的原理及特點基因芯片又稱DNA芯片(DNA chips)，是生物芯片(bio-chip)的一種，是綜合應(yīng)用微電子學、物理學、化學、生物學和其他高新技術(shù)，把大量DNA片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龍膜等載體上，形成的致密、有序的DNA分子點陣。因其固相載體常用硅玻片或硅芯片，故稱之為基因芯片3?；蛐酒夹g(shù)使得我們能夠在全基因組水平上對基因的結(jié)構(gòu)及其表達調(diào)控等問題進行研究，因此基因芯片也被譽為“縮微實驗室”( Lab- on- a- Chip) ?；蛐酒夹g(shù)的基本原理是分子生物學中的核酸分子原位雜交技術(shù)（DNA blotting hybridization），即將短鏈核酸分子固定在固相載體上作為探針，將分析樣品標記后，與固定在芯片上的探針雜交。其技術(shù)程序一般主要包括芯片制備、待測樣品的制備和標記、雜交反應(yīng)、結(jié)果檢測和數(shù)據(jù)處理分析等4。與傳統(tǒng)的核酸印跡雜交技術(shù)相比，基因芯片具有諸多優(yōu)點，如可信度高、信息量大、操作簡單、重復性好、可重復使用等3-5。2. 基因芯片在植物研究中的應(yīng)用2.1 在植物病原體檢測中的應(yīng)用Lee等設(shè)計了一種芯片，可以檢測和區(qū)別4種感染葫蘆科植物的煙草花葉病毒組成員6。Abdullah等應(yīng)用該技術(shù)成功檢測了馬鈴薯A病毒(PVA)等12種病毒7，馬新穎等建立了黃瓜花葉病毒、煙草花葉病毒、木槿褪綠環(huán)斑病毒等10種植物病毒的基因芯片檢測方法8。陳昱等結(jié)合RT-PCR，制備了用于檢測CMV、TMV和PVY 3種病毒的基因芯片9。龍海等結(jié)合雙重PCR和基因芯片技術(shù)，以鐵載體受體(Putative siderophore receptor)基因序列和RNA多聚酶西格瑪因子(RNA polymerase sigma factor, rpoD)基因序列為靶標，設(shè)計引物和特異性探針，同時檢測和鑒定水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘藍黑腐病菌等4種病菌，對這4種致病菌基因組DNA的檢測靈敏度約為3 pg10。羅煥亮等通過分析比對11種檢疫性植原體的16S rDNA序列，設(shè)計了通用引物以及種間特異性探針，并建立了植原體基因芯片檢測技術(shù)，實現(xiàn)了高通量檢測植原體病原，提升了檢疫鑒定植原體的速度11。2.2 研究植物的逆境基因表達近年來，闡明植物逆境脅迫下的分子機制成為研究的熱點，基因芯片技術(shù)也已成為重要的研究手段。Dhanaraj等采用cDNA微陣列分析了藍莓(Vaccinium section Cyanococcus)在大田和室內(nèi)的耐低溫脅迫研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)表達的基因在冷室中要比大田的要多，有些基因僅在室內(nèi)被誘導表達，比如與抗脅迫相關(guān)的基因，一些編碼糖酵解和TCA循環(huán)的酶類和一些與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的酶類12。Ozturk等利用cDNA微陣列研究了大麥干旱脅迫下基因表達情況，有15%的轉(zhuǎn)錄簽受到干旱的誘導或抑制，上調(diào)表達的轉(zhuǎn)錄簽中主要涉及到了茉莉酸合成相關(guān)基因、類金屬硫蛋白、晚胚胎期豐富(late-embryogenesis-abundant, LEA)基因、ABA相關(guān)基因等13。Jiang等采用包含23 686個擬南芥基因的cDNA微陣列分析了鹽脅迫處理6 h， 24 h，和48 h后根系的基因表達情況，分別檢測到2,433和2,774個基因受鹽脅迫的誘導和抑制14。2.3 轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測尋找和搜集用于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的啟動子、目的基因(如抗病基因、抗蟲基因等)和標記基因的EST序列，制成基因芯片，可以對轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品進行檢測。周萍萍等根據(jù)大豆中所轉(zhuǎn)入的外源基因，選擇camv35S啟動子、nos終止子和p4epsps基因，以大豆內(nèi)源基因lectin基因為內(nèi)參照基因設(shè)計了引物和探針，檢測轉(zhuǎn)基因含量不同的RRS標準參考物檢測靈敏度均可達04515。Suzuki等使用寡聚核苷酸微陣列分析了攜帶35S：VP1的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，并分析鑒定了353個VP1ABA調(diào)控的基因16。2.4 用于檢測基因突變和多態(tài)性分析基因芯片可以同時檢測多個基因乃至整個基因組的突變，還可研究基因( 組) 的多態(tài)性，將基因芯片技術(shù)用于檢測分子突變，除可準確定位突變位點、確定突變類型外，更重要的是它的快速、高效性。將此技術(shù)應(yīng)用在遺傳育種上，大大降低了植物育種的難度和工作量。3展望為提高基因芯片分析的準確性，降低操作的復雜性，基因芯片發(fā)展方向至少應(yīng)包括以下幾個方面：（1）允許更長的寡核苷酸探針用于點陣芯片；（2）芯片制備、樣品處理、雜交、檢測以及數(shù)據(jù)分析趨向標準化；（3）設(shè)計新的更敏感的信號檢測系統(tǒng)。最近幾年，基因芯片技術(shù)有了很大的進展，目前該技術(shù)對樣品的需要量非常少，效率高，能同時分析數(shù)千種作為遺傳、基因組研究或診斷用的DNA序列，并且檢測基因表達變化的靈敏度高，特別是在探明基因之間表達的相互關(guān)系方面具備無可比擬的優(yōu)點。盡管基因芯片技術(shù)還存在很多問題，但由于其具有并行化和高通量的特點，它的應(yīng)用前景仍十分廣闊，如對基因功能、植物生理機制、食品衛(wèi)生、環(huán)境污染監(jiān)測的研究等方面。參考文獻1熊偉基因芯片技術(shù)在生命科學研究中的應(yīng)用進展及前景分析J生命科學儀器，2010，8(1):32-362Check Hayden EGene chips unmask cryptic diseasesJNature，2008，18;455(7211):274-2763 李克勤，宮奇琳，徐煥春，2004，生物芯片技術(shù)及應(yīng)用J生物醫(yī)學工程研究，23(10)：59-60.4吳明煜，郭曉紅，王萬賢，柯文山，楊毅，吳燕，2005，生物芯片研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景J，科學技術(shù)與工程，7(5)：3437.5王升啟基因芯片技術(shù)及應(yīng)用研究進展J生物工程進展，1999，19(4):45516Lee G P，Min B E，Kim C S，et alPlant virus cDNA chip hybridization for detection and differentiation of four cu-curbit-infecting TobamovirusesJJournal of Virological Methods，2003，110:19247Abdullahi I，Koerbler MThe 18S rDNA sequence of Synchytrium endobioticum and its utility in microarrays for the simultaneous detection of fungal and viral patho-gens of potatoJApplied Microbiology Biotechnology，2005，68:3683758馬新穎，汪琳，任魯風，等10種植物病毒的基因芯片檢測技術(shù)研究J植物病理學報，2007，37(6):5615659 陳昱，潘迎捷，趙勇，等. 基因芯片技術(shù)檢測3種食源性致病微生物方法的建立J.微生物學通報，2009， 36(2): 285-291.10龍海，李一農(nóng)，李芳榮. 四種黃單胞菌的基因芯片檢測方法的建立J. 生物技術(shù)通報,2011,1(1):186-190.11羅煥亮，張麗君，胡小華等.植原體檢測基因芯片制備及其初步應(yīng)用J.植物檢疫，2011,25（1）：9-13.12Dhanaraj AL, Alkharouf NW, Beard HS, Chouikha IB, Matthews BF, Wei H, Arora R, Rowland LJ. Major differences observed in transcript profiles of blueberry during cold acclimation under field and cold room conditionsJ. Planta, 2007, 225(3): 735751.13Ozturk ZN, TalamelV, Deyholos M, Michalowski1 CB, Galbraith DW, Gozukirmizi N, Tuberosa R, Bohnert HJ. Monitoring large-scale changes in transcript abundance in drought- and salt-stressed barleyJ. Plant Mol Biol, 2002, 48(5-6): 551573.14Jiang YQ, Deyholos MK. Comprehensive transcriptional profiling of NaCl-stressed Arabidopsis roots reveals novel classes of responsive genesJ. BMC Plant Biol, 2006, 6: 25.15周