卵巢上皮性癌組織中p15、p16基因突變及其臨床意義.doc

卵巢上皮性癌組織中p15、p16基因突變及其臨床意義中華婦產(chǎn)科雜志 2000年第7期第35卷 論著摘要作者：李紅霞江森李文軍單位：李紅霞（現(xiàn)在北京鐵路總醫(yī)院婦產(chǎn)科）；江森（250021 濟(jì)南，山東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科）；李文軍（重慶第三軍醫(yī)大學(xué)婦產(chǎn)科）p15、p16基因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)和分離的兩個(gè)抑癌基因。研究表明，p15、p16基因突變與人類腫瘤的發(fā)生有關(guān)，在多種原發(fā)性腫瘤及其腫瘤細(xì)胞系中均存在p15、p16基因純合性缺失與點(diǎn)突變1。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)卵巢上皮性癌（OEC）中p15、p16基因純合性缺失與點(diǎn)突變，探討其在OEC發(fā)生、發(fā)展中的作用，并評(píng)價(jià)其可否作為腫瘤標(biāo)記物應(yīng)用于OEC的診斷、監(jiān)測(cè)及預(yù)后的判斷。一、資料與方法1.研究對(duì)象：43例OEC、11例卵巢良性上皮性瘤及4例卵巢交界性上皮性瘤取自山東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院、山東省立醫(yī)院及解放軍第九醫(yī)院婦產(chǎn)科19951997年住院的手術(shù)患者。OEC患者平均年齡53歲（2974歲）；病理類型包括，漿液性囊腺癌23例、粘液性囊腺癌12例、未分類癌6例及子宮內(nèi)膜樣癌2例；按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟1988年手術(shù)病理分期，早期（期）12例、晚期（期）31例；按世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)，病理分級(jí)為G1G2級(jí)32例、G3級(jí)11例；同時(shí)伴有腹膜、鄰近器官或淋巴結(jié)等轉(zhuǎn)移者29例?；颊呔鶠槌醮问中g(shù)，術(shù)前均未予化學(xué)治療（化療）和放射治療（放療）。卵巢良性上皮性瘤患者平均年齡46 歲（2972歲），其中漿液性囊腺瘤6例，粘液性囊腺瘤5例。卵巢交界性上皮瘤患者平均年齡34歲（2159歲），其中漿液性及粘液性腫瘤各2例。2.方法：（1）標(biāo)本制備及DNA提取：取患者腫瘤及瘤旁組織（有轉(zhuǎn)移者同時(shí)取轉(zhuǎn)移灶組織）共145份，以組織包埋劑包埋，立即置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80冰箱中保存。使用時(shí)先制成5 m厚的冰凍切片，行顯微分離腫瘤組織，對(duì)照蘇木素伊紅染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察，選擇腫瘤細(xì)胞富集區(qū)（腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞比例70%），以手術(shù)刀片分離、刮取腫瘤細(xì)胞并提取DNA。（2）p15、p16基因純合性缺失和點(diǎn)突變的檢測(cè)及判斷標(biāo)準(zhǔn)2：采用多聚酶鏈反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳方法檢測(cè)p15、p16基因純合性缺失，以多聚酶鏈反應(yīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)檢測(cè)p15、p16基因點(diǎn)突變。判斷標(biāo)準(zhǔn)：p15、p16基因純合性缺失的標(biāo)準(zhǔn)為腫瘤組織p15（或16）與正常組織p15（或16）的比值0.25 ；PCR-SSCP分析p15、p16基因點(diǎn)突變， 則是與自體正常組織對(duì)比,腫瘤組織出現(xiàn)異常遷移帶者表示有基因點(diǎn)突變。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SAS軟件作2檢驗(yàn)（四格表確切概率法）及相關(guān)分析。二、結(jié)果1. 卵巢良性、交界性上皮性腫瘤及OEC癌旁組織中p15、p16基因純合性缺失和點(diǎn)突變的檢測(cè)：卵巢良性、交界性上皮性腫瘤及OEC癌旁組織中未檢測(cè)到p15、p16基因純合性缺失和點(diǎn)突變，OEC組織中p15基因純合性缺失率為46.5%（20/43），與良性腫瘤比較，差異有顯著性（P0.01）。OEC組織中p15基因純合性缺失包括E1、E2共同缺失4例，占缺失總數(shù)的20.0%;僅E1缺失10例;僅E2缺失者6例。PCR-SSCP檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)p15基因點(diǎn)突變。OEC組織中p16基因純合性缺失率及點(diǎn)突變率分別為16.0%（7/43）及7.0%（3/43），其中E1缺失者5例，E1、E2、E3完全缺失者1例，E2、E3共同缺失者1例。p16基因發(fā)生點(diǎn)突變的3例均位于E2，且表現(xiàn)為雜合性。p16基因的純合性缺失及點(diǎn)突變率，OEC組織與良性、交界性腫瘤組織比較，差異均無(wú)顯著性(P0.05)。OEC組織中p15、p16基因總變異率（包括純合性缺失率及點(diǎn)突變率）為70.0%。在p16基因突變（包括純合性缺失與點(diǎn)突變）的10例中，9例同時(shí)存在p15基因的純合性缺失；而在p16基因正常的33例中，僅有1例有p15基因的純合性缺失，兩者比較，差異有顯著性（P0.01）。p15、p16基因突變之間存在正相關(guān)性（r=0.48）。2. p15、p16基因突變與臨床病理：病理分級(jí)G3級(jí)中p15基因的純合性缺失率為63.6%，較G1、G2級(jí)的40.0%有升高趨勢(shì)，但兩者比較,差異無(wú)顯著性(P0.05)。p15、p16基因變異多發(fā)生于漿液性囊腺癌，與其他類型OEC比較，差異也無(wú)顯著性(P0.05)。見(jiàn)表1。腫瘤轉(zhuǎn)移灶組織中p15、 p16基因純合性缺失率分別為64.0%及38.5%,與原發(fā)灶比較，差異無(wú)顯著性(P0.05)。表1p15、p16 基因突變與臨床病理參數(shù)的關(guān)系類別總例數(shù) p15基因缺失P值p16基因突變P值例數(shù) 百分率（%）例數(shù) 百分率（%）手術(shù)病理分期早期12 5 41.7216.6晚期31 15 48.40.058 18.6 0.05病理分級(jí)G1G2級(jí)32 1340.6 7 21.9G3級(jí)11 7 63.60.053 27.3 0.05 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有 29 1241.37 24.1無(wú) 14 857.10.053 21.40.05病理類型漿液性囊腺癌 23 13 56.5 6 26.0粘液性囊腺癌 123 25.0 3 25.0未分類癌 6 4 4/6*1 1/6*子宮內(nèi)膜樣癌2 0 0/2*0.050 0/2*0.05*例數(shù)少于10，不計(jì)百分率三、討論1.p15、p16基因突變與OEC形成和發(fā)展的關(guān)系：本研究結(jié)果顯示，OEC組織中p15、p16基因總突變率高達(dá)70.0%，且p15、p16基因突變之間存在正相關(guān)，提示，p15、p16基因突變是OEC形成中的一個(gè)普遍現(xiàn)象，兩者共同參與了OEC發(fā)生、發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，p15基因變異的形式為純合性缺失而非點(diǎn)突變，表明純合性缺失為該基因失活的主要方式，與其他作者的報(bào)道一致3。值得注意的是，本組資料中的3例p16基因點(diǎn)突變均為雜合性，其他作者亦有類似報(bào)道，提示，p16的1個(gè)等位基因是因突變而失活，而另外1個(gè)等位基因失活可能是由于其他機(jī)理，如甲基化作用、雜合性缺失；或如p53基因一樣，p16亦為顯性基因，其中1個(gè)等位基因突變，即引起細(xì)胞周期正常演進(jìn)的紊亂4，其確切機(jī)理尚有待于進(jìn)一步的探討。2.p15、p16基因突變的臨床意義：本研究結(jié)果顯示，在卵巢良性及交界性上皮性腫瘤中未檢測(cè)到p15、p16基因純合性缺失和點(diǎn)突變，提示，p15、p16基因變異是惡性腫瘤的特征性改變，有望作為腫瘤標(biāo)記物用于OEC的診斷及與良性腫瘤的鑒別診斷中。因p15、p16基因突變率在患者各預(yù)后影響因素如臨床分期、病理分級(jí)以及有無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移等之間的差異無(wú)顯著性，故其價(jià)值尚有待于進(jìn)一步探討。參考文獻(xiàn)1，F(xiàn)ujita M, Enomoto T, Haba T, et al. Alteration of p16 gene and p15 genes in human epihtelial ovarian tumors. Int J Cancer,1997, 74:148-155.2，Wong YF, Chung TK, Cheung TH, et al. P16INK4A and p15INK4B alterations in primary gynecologic malignancy. Gynecol Oncol，1997, 65:319-324.3，Roesler JM, Livignston EH, Strivatsan E, et al. Deletion of p15(MTS2) in head ang neck squamous cell carcinomas. J Surg Res, 1998, 77:50-54.4，Pinyol M, Francese C, Bea S, et al. P16INK4A gene