藥理實驗方法學(xué).doc

精品文檔第一章 現(xiàn)代藥理學(xué)實驗方法與技術(shù)簡介 第一節(jié) 分子生物學(xué)試驗方法與技術(shù) 分子生物技術(shù)在藥理學(xué)實驗中應(yīng)用較為廣泛，包括核酸分子探針的標記、核酸分子雜交、多聚酶鏈反應(yīng)、蛋白印跡雜交技術(shù)、cDNA文庫、隨機分子庫技術(shù)、外核基因在真核細胞中的表達、轉(zhuǎn)基因動物、人類基因治療等?，F(xiàn)將更為常用的技術(shù)介紹如下：一、核酸分子探針的標記 標記核酸分子探針（nucleic acid probe）是進行核雜交的基礎(chǔ)，根據(jù)核酸分子探針的來源及性質(zhì)進行選擇，選擇的基本原則是具有高度的特異性，探針選擇直接影響雜交結(jié)果的分析。根據(jù)檢測對象和目的不同，可選擇不同的探針種類及標記方法。 探針種類1基因組DNA探針 是克隆化的各種基因片斷，也是最常用的核酸探針，探針應(yīng)盡可能選用基因編碼（外顯子），避免使用內(nèi)含子及其它非編碼序列。2cDNA探針 與mRNA互補的DNA鏈稱cDNA，是一種較為理想的核酸探針，特異性較高。3RNA探針 RNA與RNA或DNA雜交體的探針穩(wěn)定性，特異性高。4寡核苷酸探針 人工合成寡核苷酸片段做探針，可根據(jù)需要合成相應(yīng)序列。 標記物 常用的探針標記物有兩類：放射性同位素和非放射性同位素。標記物的檢測具有高度靈敏性和特異性。標記和探針結(jié)合不影響雜交的特異性和穩(wěn)定性。其中放射性同位素是應(yīng)用最多的探針標記物，但易造成放射性污染，多數(shù)同位素的半衰期短，不能長期存放。常用的放射性同位素有32P3P35S，有時也用14C,125I或131I。二、核酸分子雜交（nucleic acid hybridiazation ） 是指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈在一定的條件下，按堿基互補配對原則形成異質(zhì)雙鏈的過程。核酸分子雜交是分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，靈敏度高、特異性強，主要用于特異DNA或RNA的定性定量檢測。三、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外酶促擴增特異DNA片段的方法。傳統(tǒng)的DNA擴增法是分子克隆法，需經(jīng)過DNA酶切、鏈接、轉(zhuǎn)化等步驟構(gòu)建含有目的基因的載體。然后導(dǎo)入細胞中進行擴增，再用同位素標記的探針進行篩選，操作復(fù)雜，耗時。PCR技術(shù)靈敏度高，特異性強，操作簡便。PCR是本世紀分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中最重要的發(fā)明之一。四、cDNA文庫 是指以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成的互補 DNA（complementary DNA,cDNA）。cDNA文庫是指一群含重組DNA細菌或嗜菌體克隆。每一個克隆只含一種mRNA的信息，足夠數(shù)目克隆的總和則含細胞的全部mRNA信息，此種克隆群體叫cDNA文庫。五隨機分子庫技術(shù)（random moleculer library） 采用不同技術(shù)手段和在不同的分子水平有效地實現(xiàn)分子的多樣性。其技術(shù)路線，一是利用化學(xué)合成的方法生成已知結(jié)構(gòu)的化合物，以某種特定方式和一定規(guī)律組合在一起，只要確定某一化合物具有活性，即可根據(jù)建庫的組合方式確定其結(jié)構(gòu)，圍繞此技術(shù)發(fā)展的隨機分子庫總稱為化學(xué)合成庫（synthetic chemical library）。二是利用基因工程方法直接合成的DNA或RNA的核酸庫（nucleic acid library ）,由DNA隨即編碼表達的小分子和大分子的混合群體而表達物的表面顯露又提供了可從龐大的復(fù)雜的群體中快速篩選到目的物，這就是近幾年發(fā)展起來的極富有應(yīng)用潛力的核酸編碼分子肽庫（oligonucleotide-encoded peptide library ）。六真核基因的表達調(diào)控技術(shù) 真核細胞具有比原核細胞更為龐大的和復(fù)雜的基因組。高等真核細胞基因組編碼成千上萬個基因，基因內(nèi)遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞過程，即基因表達過程受不同層次調(diào)節(jié)機制精密調(diào)控，此調(diào)控既決定著基因表達的量，又決定基因表達的時空順序。調(diào)控過程精密復(fù)雜，涉及到轉(zhuǎn)錄前染色質(zhì)的活化；轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)；轉(zhuǎn)錄后的加工；翻譯水平的調(diào)節(jié)及翻譯后的修飾等?；虮磉_的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。七轉(zhuǎn)基因動物 是用實驗方法導(dǎo)入的外源基因在其染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動物。此種方法可建立轉(zhuǎn)基因動物模型，以研究外源基因在整體動物中的表達調(diào)控率；能改變動物基因使其表現(xiàn)更符合人類需要；也可用轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生人類所需要的生物活性物質(zhì)。第二節(jié) 細胞生物學(xué)實驗方法與技術(shù)細胞生物學(xué)是生命科學(xué)中的重要分支，它以生命基本單位細胞為研究對象，應(yīng)用近代物理、化學(xué)和實驗生物學(xué)方法，從顯微、亞顯微和分子水平來揭示細胞生命活動及規(guī)律，其中包括細胞的生長、發(fā)育、分裂、分化、遺傳、變異（包括癌變）、興奮、運動、代謝、衰老與死亡等基本生命現(xiàn)象，并且利用與調(diào)控細胞的行為活動，已達到為生產(chǎn)實踐尤其為醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)服務(wù)。當(dāng)前細胞生物學(xué)與醫(yī)藥保健事業(yè)聯(lián)系的較為緊密的熱點問題主要有以下幾種：1）真核細胞基因結(jié)構(gòu)及其表達調(diào)控；2）細胞膜、膜系、受體與信號傳遞研究；3）細胞生長、分化、衰老、癌變、死亡，尤其是程序性細胞死亡的研究；4) 細胞工程，包括基因工程及體細胞核移植的研究。一、細胞培養(yǎng)常用方法 1、細胞原代培養(yǎng)（primay culture） 又稱初代培養(yǎng)，即直接從機體取下細胞、組織、或器官、讓他們在體外維持與生長。原代細胞的特點是細胞或組織剛離開機體，他們的生物狀態(tài)尚未發(fā)生很大的改變，一定程度上可反映他們在體內(nèi)的狀態(tài)，表現(xiàn)出來源組織或細胞的特性，因此用于藥物實驗尤其是藥物對細胞活動、結(jié)構(gòu)、代謝、有無毒性或殺傷作用等研究是極好工具。常用的原代培養(yǎng)方法有組織快培養(yǎng)法及消化培養(yǎng)法。前者方法簡單，細胞也較易生長，尤其是培養(yǎng)心肌有時能觀察到心肌組織塊的搏動。細胞從組織塊外長并鋪滿培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶后即可進行傳代。2、細胞的傳代培養(yǎng) 當(dāng)細胞生長至單層匯合時，便需要進行分離培養(yǎng)否則會因無繁殖空間、營養(yǎng)耗竭而影響生長，甚至整片細胞脫離基質(zhì)懸浮起來直至死亡。為此當(dāng)細胞達到一定密度時必須傳代或再次培養(yǎng)，目的是借此繁殖更多的細胞，另一方面是防止細胞的退化死亡。二、器官培養(yǎng)方法器官培養(yǎng)（organ culture）是指用特殊的裝置使器官、器官原基或它們的一部分在體外存活，幷保持其原有的結(jié)構(gòu)和功能。器官培養(yǎng)可模擬體內(nèi)的三維結(jié)構(gòu)，用于觀察組織間的相互反應(yīng)、組織與細胞的分化以及外界因子包括藥物對組織細胞的作用。器官培養(yǎng)方法很多，最經(jīng)典的方法即表玻皿器官培養(yǎng)法；一種最常用的方法是不銹鋼金屬網(wǎng)格法及Wolff培養(yǎng)法和擴散盒培養(yǎng)法，實驗者可根據(jù)情況選擇采用。三、放射自顯影術(shù)測定放射自顯影術(shù)（autoradiography）是利用放射性同位素電離輻射對核子乳膠的感光作用，顯示標本或樣品中放射物的分布、定量以及定位的方法。放射性同位素能在緊密接觸的感光乳膠中記錄下它存在的部位和強度，準確顯示出形態(tài)與功能的定位關(guān)系?，F(xiàn)已可將放射自顯影術(shù)與電鏡以及生物分子結(jié)合起來。不但可以研究放射性物質(zhì)在組織和細胞內(nèi)的分布代謝，而且可以揭示核酸合成及其損傷等改變，目前已在生命科學(xué)各領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。四、染色體分析技術(shù) 染色質(zhì)或染色體是遺傳物質(zhì)在細胞水平的形態(tài)特征。前者是指當(dāng)細胞處于合成期時遺傳物質(zhì)經(jīng)堿性染料著色后，呈現(xiàn)出細絲狀彌漫結(jié)構(gòu)；當(dāng)細胞進入分裂期時，染色質(zhì)細絲高度螺旋化凝聚為形態(tài)有特征的染色體。特別是在分裂中期，復(fù)制后的染色體達到最高程度的凝聚，稱為中期染色，是進行染色體形態(tài)觀察分析的最佳時期。染色體分析應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣，主要用于以下幾方面：1）為臨床診斷提供新手段；2）研究不育和習(xí)慣性流產(chǎn)發(fā)生的遺傳基礎(chǔ)；3) 通過檢查胎兒的染色體，預(yù)防有染色體異常患兒出生（先天愚型）；4）根據(jù)染色體的多肽性進行親子和異型配子的起源研究；結(jié)合DNA重組技術(shù)可以將基因定位于染色體的具體區(qū)帶上。五、電鏡技術(shù) 早在1940年，英國劍橋大學(xué)首先試制成功掃描電子顯微鏡，但因分辨率低無實用價值。1965年英國劍橋科學(xué)儀器有限公司開始生產(chǎn)出商品掃描電鏡，其以顯著優(yōu)點廣泛用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、電子學(xué)及勘探、冶金、國防、公安、機械與輕工業(yè)等諸多領(lǐng)域，并已成為非常有用的研究工具。電鏡主要特點：1）景深大，較光學(xué)顯微鏡大幾百倍；2）圖像富有立體感，是一個具有真實感的三維結(jié)構(gòu)立體圖象；3）圖像放大范圍大，光學(xué)顯微鏡有效放大倍數(shù)為1000倍左右，透視電鏡的放大倍數(shù)為幾百倍至100萬倍，掃描電鏡可放大十幾倍至幾十萬倍；4）分辨率高，掃描電鏡可達63nm；5）樣品可在三度空間平移和旋轉(zhuǎn)，聚焦后可以任意放大倍數(shù)，而不需調(diào)整重新聚焦。六、細胞、細胞器、及細胞間質(zhì)的分離技術(shù)、 1、 細胞的分離 分離不同的細胞及亞細胞組分在現(xiàn)代生物學(xué)研究中起著重要的作用。如研究某種藥物治療白血病的機理，需要分離培養(yǎng)人或動物的骨髓細胞，觀察藥物的細胞作用；研究與細胞生長分化有關(guān)的生長因子的作用，需將與此類因子有關(guān)的細胞分離出來；分離細胞膜，線粒體等細胞的亞組分，對于研究信號傳遞，某些遺傳疾病，也都是必不可少的手段。 2、細胞膜的分離 細胞內(nèi)的膜系統(tǒng)與細胞質(zhì)膜統(tǒng)稱為生物膜（biomembrane）,他們都有共同結(jié)構(gòu)和特征。首先要分離出形狀完整的、具有生物活性的、高純度的細胞膜，用于研究細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，以利于觀察膜在細胞與環(huán)境進行能量交換及信息傳遞的過程。3、細胞核的分離 細胞核作為一個功能單位，完整的保存遺傳物質(zhì)，幷指導(dǎo)RNA合成，后者為蛋白質(zhì)及其它細胞組分合成所必需。因此細胞核分離是研究基因表達及細胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)的首要步驟。不同組織來源的細胞經(jīng)勻漿后，用分級離心或超聲波處理等方法進行純化。4、溶酶體的分離 溶酶體是處理細胞吞噬物的細胞器，含有高濃度的各種水解酶類，調(diào)控細胞內(nèi)的消化過程。溶酶體的分離常用于研究因溶酶體功能缺陷而引起的多種疾病。5、線粒體的分離 線粒體是細胞呼吸的主要場所，細胞活動所需要的能量，主要由在線粒體內(nèi)進行氧化所產(chǎn)生的能量供給。制備線粒體關(guān)鍵是保持其完整性及高純度。 6、細胞DNA、RNA分離與純化 核酸是遺傳信息及基因表達的物質(zhì)基礎(chǔ)。核酸的提取與純化關(guān)鍵是保持核酸的完整性，但較困難，主要因為：一是細胞內(nèi)有活性很高的核糖核酸酶；二是酸堿等化學(xué)因素；三是高溫機械損傷等物理因素，需嚴格遵守操作規(guī)程。七、細胞凋亡研究方法 細胞凋亡(apoptosis),又稱為程序性死亡（programmed cell death,PCD）指的是有核細胞在一定條件下，通過激活其自身內(nèi)部機制，尤其是開啟與關(guān)閉某些基因以及內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶活化，導(dǎo)致產(chǎn)生細胞自然性死亡的過程?？梢哉J為細胞死亡的這種方式是一種生理性的自發(fā)過程。為此有人也稱其為細胞自殺。目前認為程序性死亡幾乎和細胞的增殖同樣重要，如果沒有細胞凋亡，個體不能形成與存活，或者發(fā)生疾病。只有通過細胞凋亡的發(fā)生，使特定細胞群體在特定的時間和特定的部位死亡。從而使機體在總體上保障其細胞數(shù)量，以及形態(tài)與功能的平衡。近年來如何用藥物誘導(dǎo)癌細胞死亡也成為細胞凋亡的熱點之一。透視電鏡觀察是研究細胞凋亡的首選方法。八、原位雜交 原位雜交技術(shù)是將分子雜交與組織化學(xué)相結(jié)合，用標記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細胞內(nèi)特異互補的DNA或RNA序列。它分為三類：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA。已廣泛用于生物學(xué)的各個領(lǐng)域。原位DNA末端標記可以用于細胞凋亡的定量研究。原位雜交技術(shù)和PCR技術(shù)結(jié)合用于檢測人乳頭瘤病毒（HPV）九、單克隆抗體是1975年被描述的一種可產(chǎn)生無限量，并可預(yù)測其性質(zhì)的抗體制備技術(shù)。該技術(shù)的關(guān)鍵步驟在于淋巴細胞之間的融合，所以稱為“淋巴細胞雜交瘤技術(shù)”；由于雜交瘤經(jīng)過篩選可產(chǎn)生針對單一抗原決定簇抗體的細胞克隆，故稱為單克隆抗體技術(shù)。該技術(shù)的問世使得免疫學(xué)研究與實踐發(fā)生了革命性的改觀，同時還為生物學(xué)和醫(yī)藥學(xué)的許多領(lǐng)域提供了前所未有的研究工具。人們利用其可精確地識別出極為復(fù)雜的分子，測定出無法測定的物質(zhì)，識別出新的細胞群體，揭示了以往未曾了解的細胞分化途徑，為腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病等的診斷和治療創(chuàng)造出令人興奮的前景。十、神經(jīng)細胞培養(yǎng) 神經(jīng)細胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)取出某一種神經(jīng)組織，在無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下模擬在體生理環(huán)境，使之存活和生長，幷保持其結(jié)構(gòu)和功能。神經(jīng)細胞培養(yǎng)按培養(yǎng)前切割程度分為器官培養(yǎng)、組織快培養(yǎng)和細胞分離培養(yǎng)。1、器官培養(yǎng) （organ culture ） 是切割最少型的培養(yǎng)。全器官或器官大片放在保溫的營養(yǎng)液中可保存數(shù)日。這類培養(yǎng)切斷了正常的血供，器官的營養(yǎng)交換取決于簡單的灌流。2、組織塊培養(yǎng) （explant culture） 是真正最小器官培養(yǎng)。組織塊通常厚度為0.51mm，一個或幾個組織塊放在一個培養(yǎng)皿內(nèi)存活數(shù)周。實驗在其組織塊周圍生長出的邊緣細胞上進行。3、細胞分離培養(yǎng) （dissciated cell culture ）是由分散其原始組織至其組成的細胞。常用酶進行消化。第三節(jié) 信息傳遞的研究方法與技術(shù)一、受體與配基結(jié)合試驗技術(shù) 受體與配基結(jié)合試驗是一種在體外直接觀察受體的實驗手段。隨著各種高比活度的特異性受體配基的合成，此方法已成為藥理學(xué)的基本技術(shù)之一，幷廣泛用于生理、生化、細胞生物等許多相關(guān)學(xué)科。二、G蛋白的純化分離技術(shù) G蛋白是細胞膜上一類結(jié)構(gòu)和功能都非常相似的蛋白質(zhì)。其主要功能是偶聯(lián)受體及其效應(yīng)器。受體與激動劑結(jié)合并被激活時，先激活其相應(yīng)的G蛋白，然后G蛋白再與相應(yīng)的效應(yīng)器（酶離子通道等）發(fā)生反應(yīng)，改變效應(yīng)器的活性。與G蛋白偶聯(lián)的受體種類繁多，受G蛋白調(diào)控的效應(yīng)器包括腺苷酸環(huán)化酶，磷脂酶C，cGMP磷酸二酯酶，離子通道等。因此，G蛋白的研究對闡明跨膜信息傳遞機理有非常重要的意義。三、環(huán)核苷酸測定技術(shù) 環(huán)核苷酸是重要的細胞內(nèi)信使物質(zhì)，參與調(diào)控各種激素、神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)所導(dǎo)致的各種細胞生命活動。常用的測定方法有：cAMP蛋白質(zhì)競爭結(jié)合法；cGMP放射免疫測定技術(shù)；腺苷酸環(huán)化酶測定技術(shù)等。四、花生四烯酸代謝產(chǎn)物測定技術(shù)細胞內(nèi)磷脂、甘油三酯及膽固醇經(jīng)?；饷傅淖饔冕尫懦龌ㄉ南┧幔╝rachidonic acid ,AA）。而AA通過環(huán)加氧酶和脂加氧酶途徑分別代謝轉(zhuǎn)化為一系列活性物質(zhì)，如前列腺素、前列環(huán)素、血栓素、白三烯等。這些物質(zhì)在體內(nèi)含量少，但有極強的生物活性。能調(diào)節(jié)多種系統(tǒng)（神經(jīng)、內(nèi)分泌、消化、呼吸、生殖、血液、心血管、腎等）,并在炎癥、免疫、過敏、凝血、腫瘤和心血管等一系列的病理過程中發(fā)揮作用而具有重要的臨床意義。常用的檢測方法：生物測定法、高效液相測定法、放射免疫分析法、酶免疫測定法、放免配基受體結(jié)合法。五、肌醇磷脂及其代謝產(chǎn)物的測定技術(shù) 肌醇磷脂是細胞膜中的一種脂質(zhì)，能被磷脂酶C水解生成三種重要的細胞內(nèi)信使物質(zhì)，都已成為藥理學(xué)和生物化學(xué)等學(xué)科中研究的熱點。常用實驗方法有：肌醇磷脂的測定、磷酸肌醇的分離及測定、甘油二酯的測定、同位素標記測定肌醇磷脂等。六、蛋白激酶C的純化和測定 蛋白激酶C是一種普遍存在于生物體內(nèi)的磷脂依賴的激酶家族。在細胞的信息傳遞和生長調(diào)節(jié)中起到重要作用。蛋白激酶C參與多種激素、神經(jīng)遞質(zhì)及生長因子調(diào)控過程。測定蛋白激酶C活性及純化該酶成為跨膜信息傳遞研究的重要技術(shù)。七、離體器官受體生物測定 使用某些離體器官進行受體激動劑、拮抗劑的生物檢定，是一項目前仍在廣泛應(yīng)用的經(jīng)典的藥理學(xué)方法。可以測定藥物對受體的親和力，對特定亞型的選擇，能決定藥物是激動劑還是拮抗劑，并能分析藥物與受體的構(gòu)效關(guān)系，反映的是藥物在器官水平上的作用，因此，與細胞或分子水平上的實驗結(jié)果可以互相印證，有其不可替代的意義。第四節(jié) 鈣研究方法與技術(shù)簡介鈣是人體內(nèi)極其重要的金屬離子，廣泛存在于細胞和體液中。它在細胞活動乃至生命過程和疾病的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，已成為化學(xué)、生物學(xué)、基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)及其它許多科學(xué)研究的一個重要領(lǐng)域。一、細胞內(nèi)游離鈣研究方法與技術(shù)（一）鈣指示劑鈣指示劑是近十多年來發(fā)展起來的一類離子指示劑，也稱離子探針或染料，已成為觀察細胞內(nèi)游離離子濃度及其動態(tài)變化和空間分布極有價值的工具。目前常用鈣指示劑根據(jù)其物理特性一般可分為兩類1、鈣熒光指示劑：是指在一定波長的激發(fā)光照射下，鈣指示劑復(fù)合物可發(fā)出熒光。屬于此類的指示劑有Fura-2 、Quin-2、Fiuo-3、 Indo-1等。2、光吸收指示劑：是指它們與鈣離子結(jié)合后，其吸收光譜峰值隨Ca2+指示劑復(fù)合物濃度的不同而變化，據(jù)此便可觀察細胞內(nèi)游離鈣的動態(tài)變化并測定細胞內(nèi)鈣濃度。屬于此類指示劑的有Purpurate diacetic acid (PDAA)、Antipyrylazo等。光吸收指示劑一般屬于低鈣親和力指示劑。（二）雙波長熒光分光光度計測定方法應(yīng)用雙波長熒光分光光度法不僅可以檢測細胞懸液，單層培養(yǎng)細胞及單個細胞內(nèi)游離鈣濃度的變化，也可以測定細胞內(nèi)瞬間平均鈣濃度的變化及亞細胞水平鈣離子的梯度分布等。各種細胞測定方法差異在于標本的制備過程，其余步驟基本相同?；痉椒橹苽錁吮镜募毎麘乙?，加入熒光指示劑，用雙光束熒光分光光度計測定熒光。測定條件：激發(fā)光光柵5nm，發(fā)射光光柵10nm，以300-420nm掃描激發(fā)光譜，然后固定激發(fā)波長在高峰波長，觀察不同實驗條件下熒光強度的變化，由公式計算游離鈣濃度。二、鈣結(jié)合蛋白的研究方法鈣結(jié)合蛋白的研究方法包括鈣調(diào)素的純化及測定、鈣調(diào)素的表達與突變的研究方法、鈣調(diào)素結(jié)合蛋白檢測方法及鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白的研究方法。三、細胞內(nèi)鈣釋放研究方法1、放射性標記法測定鈣釋放：將分離的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體囊胞用放射性標記的鈣離子負載，負載后的囊胞置于一濾器上，通過過濾與負載液分離。在濾器中加入各種促鈣釋放介質(zhì)后，定時測定濾器中殘留的放射活性即可推斷內(nèi)鈣釋放情況。2、三磷酸肌醇刺激內(nèi)鈣釋放的研究方法制備細胞或細胞器懸液，加入鈣離子熒光指示劑負載，再加入一定濃度的三磷酸肌醇（IP3）刺激內(nèi)鈣釋放，觀察熒光強度的變化即可反應(yīng)鈣釋放情況。四、鈣離子受體測定方法從?；蛉思谞钆韵偌毎腸DNA文庫中篩選出編碼鈣離子受體的cDNA，將其mRNA注入爪蟾卵細胞，使其表達，在細胞膜上形成具有天然活性的鈣離子受體。當(dāng)細胞培養(yǎng)液中存在一定濃度的鈣或其它陽離子時，激活鈣受體，使胞內(nèi)鈣離子濃度增加，打開氯離子通道，測定氯離子通道電流的變化，便可用于篩選鈣離子受體激動劑或拮抗劑。第五節(jié) 放射配體受體結(jié)合實驗方法與技術(shù)一、基本概念1、受體（ receptor） 一類介導(dǎo)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能蛋白質(zhì)，可與周圍環(huán)境中微量化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合，通過信息放大系統(tǒng)，觸發(fā)后續(xù)的生理或藥理效應(yīng)。2、配體（ligand） 能與受體特異結(jié)合的物質(zhì)，如神經(jīng)遞質(zhì)、藥物或激素等。3、判斷受體的標準 真正的受體必須具備：飽和性、特異性、可逆性、高親和性、結(jié)構(gòu)專一性、立體選擇性、區(qū)域分布性、亞細胞或分子特征、有內(nèi)源性配體等。4、受體的基本分類 化學(xué)門控離子通道受體； G蛋白耦聯(lián)受體。5、受體調(diào)節(jié)的方式 1）共價調(diào)節(jié)（covalent modification） 尤其是蛋白磷酸化反應(yīng)在受體的脫敏過程中起了非常重要的調(diào)節(jié)作用。以乙酰膽堿受體為例，細胞內(nèi)cAMP升高所引起的蛋白磷酸化可使乙酰膽堿受體對乙酰膽堿的脫敏速度增加810倍。2）非共價調(diào)節(jié)（non-covalent modification）影響受體功能的非共價調(diào)節(jié)機制包括膜電位的變化；機械性改變受體的分布（斑片鉗技術(shù)）；受體和其他膜蛋白（如G蛋白）或某些小配體（陰離子，陽離子，核苷酸）之間的變構(gòu)影響；膜脂質(zhì)環(huán)境的改變等。3）協(xié)同性調(diào)節(jié)（coordinate regulation）已知不同受體可含有同源受體區(qū)如胰島素受體和上皮生長因子-抗?jié)兯厥荏w中的酪氨酸激酶區(qū)。由此可推測一種受體被激活后可能通過一共同密碼（code）來調(diào)節(jié)同一細胞上的其他許多受體。4）鏈鎖反應(yīng)（receptor cascades） 另外一種可能的調(diào)控機制，即一個受體被激活之后，可能會釋放一種細胞外信使，激活第二個細胞表面受體。稱之為放大性的鏈鎖反應(yīng)。二、放射配體結(jié)合法的應(yīng)用領(lǐng)域1、闡明藥物作用機制；2、新藥設(shè)計和藥物篩選；3、探討疾病的病因、發(fā)病機理，提高臨床合理用藥和診斷水平；4、測定組織或血液中藥物濃度；5、探尋新的受體、受體亞型和內(nèi)源性配體。三、放射受體結(jié)合實驗技術(shù)簡介1、放射配體的選擇 需要非常高的選擇性，并要求與靶受體有很高的親和性，解離常數(shù)最好小于10nmol/L，還要考慮配體的生物學(xué)以及生物化學(xué)特征。拮抗劑性配體必須能阻斷激動劑與靶受體結(jié)合引起的生物學(xué)效應(yīng)。放射性受體結(jié)合試驗中，最常用的放射性同位素是氚，3H配體的主要優(yōu)點是氚化過程不影響配體的生物活性，使用較安全，其信號必須用閃爍技術(shù)加以放大。放射配體的另一個重要特性是特異性結(jié)合與非特異性結(jié)合的比率，理想的配體應(yīng)有不少于99%的特異性結(jié)合。2、組織的選擇和制備 用于放射受體結(jié)合試驗的理想的組織應(yīng)含有高密度的靶受體和低密度的與配體非特異結(jié)合的受體。用于放射受體結(jié)合試驗的組織可取自腦、外周組織、天然表達或移植受體的細胞株等。3、緩沖液 最常用的緩沖液是50mmol/L，PH為7.4的Tris-Cl的緩沖液；重碳酸鹽、磷酸鹽和HEPES緩沖液亦可用于結(jié)合試驗。 4、非特異性結(jié)合的測定 非特異性結(jié)合的測定原理是加入大量的對靶受體具有藥理活性的并可使受體飽和的非放射性配體。特異性結(jié)合量是指配體與靶受體結(jié)合量，可由總結(jié)合量中減去非特異性結(jié)合量求出。5、孵育條件 結(jié)合實驗應(yīng)該用能產(chǎn)生最大特異結(jié)合和適宜的孵育條件。需要經(jīng)過大量的實驗才可摸索出最佳的測定條件。6、放射配體-受體復(fù)合體與游離放射配體的分離最常用的最有效的分離方法是過濾，結(jié)合試驗中最常用的濾紙是玻璃纖維濾紙。通常用25ml冷緩沖液沖洗23次就足夠了。過濾完成后，濾紙置于盛有閃爍液的閃爍瓶中進行液閃測定。當(dāng)放射配體解離較快時，可用離心的方法將放射配體-受體復(fù)合物從游離配體中分離出來。其它方法還有：凝膠過濾色譜法、凝膠過濾透析術(shù)、免疫沉淀法等。第六節(jié) 免疫藥理學(xué)實驗方法與技術(shù)簡介免疫藥理學(xué)是介于免疫學(xué)和藥理學(xué)間的邊緣學(xué)科，主要研究藥物對機體免疫系統(tǒng)和免疫功能的作用及其機制，為某些疾病藥物治療提供理論基礎(chǔ)。免疫藥理學(xué)方法一般是采用體外的試管內(nèi)研究和體內(nèi)的整體研究相結(jié)合，體外試驗研究可澄清藥物對免疫應(yīng)答某一特定環(huán)節(jié)如T細胞增殖、細胞因子等產(chǎn)生的具體影響，而整體研究則可探討藥物對抗原介導(dǎo)的的免疫應(yīng)答、正常的體液免疫及細胞免疫功能、同種異體移植排斥反應(yīng)、異常免疫應(yīng)答如超敏反應(yīng)和自身免疫病以及初次及再次免疫應(yīng)答等的影響。在未來免疫藥理學(xué)的研究領(lǐng)域中，基因工程、基因治療、細胞因子治療以及其它各種生物治療的研究和應(yīng)用將是研究的熱點和前沿區(qū)域。一、免疫細胞的分離與純化 體內(nèi)外的免疫藥理學(xué)實驗研究都需要從動物或人的血液或淋巴組織中分離免疫細胞，獲得高純度的免疫細胞是進行本研究的最基本的前提條件。外周血中白細胞的分離常用自然沉降法和高分子聚合物沉降法；外周血單個核細胞（peripheral mononuclear cells，PMNC）分離多采用密度梯度離心法。從淋巴組織中分離淋巴細胞懸液-制備脾細胞懸液、淋巴結(jié)細胞懸液、胸腺細胞懸液。淋巴細胞的分離純化包括：分離PMNC中的淋巴細胞和巨噬細胞 常用方法有玻璃粘附法、磁鐵吸引法、羰基鐵乳膠分層液法、補體溶解法及葡聚糖凝膠過濾法等。T細胞、B細胞及T細胞亞群的分離純化 常用技術(shù)：E花結(jié)分離法、Percoll非連續(xù)性密度梯度離心分離法、洗淘法（panning）、補體細胞毒法、尼龍毛分離法、磁性激活細胞分離器（magnetic activated cell sorter，MACS）分離技術(shù)及流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）。二、藥物對免疫系統(tǒng)功能影響的實驗技術(shù)簡介1、對免疫細胞表面抗原分子的影響 對細胞表面的CD（cluster of differentiation，分化簇）抗原的檢測與分析可通過細胞毒法、葡萄菌體蛋白A法、免疫細胞化學(xué)法和免疫熒光染色分析法等，借助流式細胞儀進行的免疫熒光染色分析法使該項技術(shù)的標準化、定量化和自動化水平大大提高，體內(nèi)外藥理試驗均可采用之。2、對免疫細胞功能的影響 常用：3H-TdR摻入試驗、固相抗CD3單克隆抗體誘導(dǎo)細胞增殖的檢測、混合淋巴細胞反應(yīng)、抗原刺激的T細胞增殖反應(yīng)、預(yù)激淋巴細胞對抗原的增殖反應(yīng)等。3、淋巴細胞功能的體內(nèi)實驗 小鼠接觸性超敏反應(yīng)、移植物抗宿主反應(yīng)（graft-versus-host disease，GVHD）、遲發(fā)性超敏反應(yīng)（delayed-type hypersensitivity，DTH）、體內(nèi)檢測TH細胞活性。4、對B細胞影響的體內(nèi)外實驗 血清中IgG、IgA、IgM的測定（單向免疫擴散法、散射比濁法）；抗體生成細胞檢測（溶血空斑試驗、溶血分光光度法）。5、對單核巨噬細胞功能的影響實驗 巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗、白色念珠菌3H葡萄糖摻入實驗、單核巨噬細胞對腫瘤細胞的細胞毒反應(yīng)測定、單核因子測定等。6、對超敏反應(yīng)影響的體內(nèi)外實驗 總IgE水平測定：酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、放射免疫單擴散法（radioactive single radial diffusion，RSRD）、免疫斑點法（dot immunobinding assay，DIBA）、反向被動血凝法（reversed passive hemagllutination assay，RPHA）、紙片放射免疫吸附試驗（paper radio immunosorbent test，PRIST）。特異性IgE抗體測定：ELISA、放射過敏原吸附試驗（radioallergosorbent test，RAST）、P-K試驗、被動皮膚過敏反應(yīng)（passive cutaneous anaphylaxis，PCA）、皮內(nèi)試驗（intradermal test）。人外周血單個核細胞體外合成IgE的測定：微量固相放射免疫測定法（microtiter solid-phase radioimmunoassay，MSPRIA）和ELISA法。參與I型超敏反應(yīng)介質(zhì)的測定：相應(yīng)介質(zhì)試劑盒測定，如LTs試劑盒。動物模型：如過敏性哮喘模型等。三、影響免疫功能的藥物藥效學(xué)研究原則根據(jù)藥物對免疫功能的影響進行分類，可分為免疫增強劑、免疫調(diào)節(jié)劑和免疫抑制劑。1、免疫增強劑和免疫調(diào)節(jié)劑的免疫藥理學(xué)研究免疫增強劑和免疫調(diào)節(jié)劑可分為兩大類：生物類和化學(xué)合成化合物類。生物制品類包括菌苗、細菌的某些成分如脂多糖、真菌產(chǎn)物、免疫細胞的產(chǎn)物如細胞因子和免疫球蛋白、免疫細菌如LAK細胞、自然化合物及中草藥及其單體成分等。化學(xué)合成化合物類包括含硫化合物、多聚核苷酸等。這些藥物的藥理作用因用藥方案不同，如給藥途徑、用藥劑量和用藥時間等，會導(dǎo)致不同的藥效；另外，藥物本身的純度和藥物受試對象的種系、年齡、疾病類型與程度及遺傳背景亦會對藥效產(chǎn)生一定的影響，因此，在進行實驗設(shè)計時要全面考慮這些因素。臨床上免疫增強劑和免疫調(diào)節(jié)劑主要用于原發(fā)性和繼發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫病、腫瘤及慢性微生物感染的治療，故選擇實驗動物模型時，應(yīng)考慮采用免疫缺陷模型動物、荷瘤動物、自身免疫病模型及相應(yīng)病原體感染動物模型。2、免疫抑制劑的免疫藥理學(xué)研究免疫抑制劑的篩選程序一般是先進行體外實驗，然后進行體內(nèi)實驗。動物的體內(nèi)實驗多采用實驗性過敏性腦脊髓炎和淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎的病理模型和新西蘭NZB小鼠。在動物實驗時，應(yīng)考慮動物的品系、對免疫應(yīng)答所影響的環(huán)節(jié)、治療指數(shù)、給藥途徑、最佳治療方案等。在免疫藥理學(xué)研究之后，還應(yīng)進行基礎(chǔ)藥理學(xué)研究、藥物的急性和慢性毒性研究、藥物的動力學(xué)研究等。第七節(jié) 腫瘤藥理實驗方法與技術(shù)腫瘤藥理實驗方法無外乎體內(nèi)和體外實驗兩種。從實驗?zāi)康纳峡?，又可以分成抗癌作用和抗癌作用機制研究兩種。一、抗癌作用研究（一）體外實驗法：用培養(yǎng)的腫瘤細胞系進行。1、噻唑藍（MTT）法 在培養(yǎng)的活細胞線粒體中與NADP相關(guān)的脫氫酶可將黃色的四氮唑（MTT）催化成不溶性的藍紫色的甲替，將甲替用二甲基亞砜（DMSO）溶解后，利用酶標儀（試驗波長570nm，參比波長450nm）測定光密度值，按照公式 實驗組光密度值腫瘤細胞生長抑制率（%）=（1 - ）100% 對照組光密度值計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率。用系列濃度的藥物可制作腫瘤細胞生長抑制率的量效曲線。2、染料排斥法 本方法是根據(jù)活細胞具有排斥某些染料的功能，而死細胞因胞膜破壞而易于被染料著色的原理，在培養(yǎng)的對數(shù)生長期的細胞懸液中加入伊紅、臺盼藍、或苯胺黑等染料，在室溫下放置5分鐘后，在15分鐘用血球計數(shù)板計數(shù)200個細胞。根據(jù)公式未染細胞數(shù)活細胞率（%）= 100% 細胞總數(shù)3、生長曲線法 本方法是根據(jù)腫瘤的Gompertzian生長曲線而設(shè)計。培養(yǎng)的腫瘤細胞在初期為指數(shù)增殖期，隨著細胞密度的增加，因代謝產(chǎn)物的積聚和營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，增殖趨于減緩乃至停止，進入所謂的平臺期。在培養(yǎng)后的的即刻、1、2、3、4、5、7天的細胞，用臺盼藍染色，細胞計數(shù)，然后取細胞對數(shù)對培養(yǎng)時間作圖可獲細胞生長曲線。1）將生長曲線外延至Y軸可獲得截距No，用公式計算藥物對增殖細胞的殺傷力（No是對照組的的截距）2）用Nt代表接種后t小時的細胞數(shù)， 用公式TD = 0.301t / logNt - LogNo 計算藥物對細胞增增時間（TD）的影響。3）取平臺期每毫升的細胞均數(shù)，比較細胞生長的飽合密度（Ns）。4、集落形成法 本方法利用分裂6代以上的克隆原單細胞子細胞可形成集落成簇（每簇細胞數(shù)50）的能力，比較藥物對單個腫瘤細胞增殖能力的影響。本方法有貼壁法和半固體培養(yǎng)法兩種。1）貼壁法 需要選用貼壁生長的細胞， 按500細胞/ml的濃度接種到35mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)后棄去培養(yǎng)基，用瑞氏-姬姆薩染色后，在20解剖顯微鏡下計數(shù)含有50個細胞的細胞集落。2）半固體軟瓊脂培養(yǎng)法 取對數(shù)生長的細胞，用含小牛血清的培養(yǎng)液稀釋成1000細胞/ml的懸液；溶化5%的瓊脂液，并按1：9的比例與含小牛血清的新鮮培養(yǎng)液混合，倒入35mm培養(yǎng)皿（1ml/皿），室溫下待瓊脂凝固，取0.94ml的細胞懸液，加0.04ml的5%瓊脂, 加到已制備的瓊脂平皿中，室溫下凝固。移入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在16解剖顯微鏡下計數(shù)直徑大于75m的細胞集落。以集落形成抑制百分率對對數(shù)劑量作圖，可得“S”型曲線，從曲線上求取半數(shù)抑制濃度IC50；以集落的存活分數(shù)與劑量作圖，可獲得克隆原細胞存活曲線，方程為S=1-(1-e-D/Do)n，S為存活分數(shù)， D 為劑量， Do為存活分數(shù)每下降1/e時所需的藥物劑量， n為外推值。Do越小， 藥物的殺傷力越大，N越大殺死細胞的藥物劑量越大。5、硫化若丹明B法（SRB）法 硫化若丹明（sulforhamine B）呈粉紅色，溶于水，可與生物大分子的堿性氨基酸結(jié)合，這種結(jié)合物在波長515nm時的讀數(shù)與細胞表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，可用于細胞的定量。測試的細胞先用TCA固定，去除固定液，加入SRB， 室溫下靜置， 然后去除未結(jié)合的SRB， 用非緩沖tris堿液溶解結(jié)合的SRB，在自動化分光光度平板讀數(shù)儀（515nm波長）測定OD值?？筛鶕?jù)下述公式計算: T - T0 生長率（%）= 100% C - T0C、T和To分別為對照組細胞，為給藥組細胞，另外的對照平板加藥時的細胞的OD值。 T - T0殺傷率(%) = 100% T T - T050%生長抑制所需的藥物濃度(GI50) = 100% C - T0 T - T0殺死50%細胞所需的藥物濃度(LC50)= 100% T0(二) 在體試驗法1、小鼠白血病L1210 系用甲基膽蒽誘發(fā)DBA/2小鼠而得。取接種于DBA/2小鼠第67天之腹水，制成細胞懸液，每只小鼠（DBF1或CDF1）腹腔接種活細胞1105，觀察體重變化，計算平均存活時間T/C（T-治療組存活時間，C-對照組存活時間）。T/C大于125%，并可重復(fù)，認為有抗癌活性，T/C大于150%，并可重復(fù)，認為具有顯著活性。2、大鼠Walker-256瘤 本瘤細胞接種在皮下或肌肉成為實體瘤，接種于腹腔則成為腹水瘤。取Walker-256瘤體制成瘤細胞懸液，按106個細胞接種于大鼠大腿肌肉。計算瘤重和T/C。重復(fù)實驗T/C42%，認為有活性。3、Lewis 肺癌 是一個在C57BL/6小鼠上發(fā)現(xiàn)的自發(fā)性肺內(nèi)未分化的上皮樣癌。該癌細胞惡性程度高，皮下、肌肉接種對藥物的敏感性低，但可向肺轉(zhuǎn)移，靜脈接種可在肺形成瘤集落。方法是取接種于C57BL/6小鼠肌肉或腋窩皮下的1315天的Lewis肺癌，制成細胞懸液接種2106個細胞于BDF1小鼠皮下或腹腔內(nèi)，12天后處死動物，作皮下接種者直接摘取腫瘤稱重，作腹腔接種者，將雙側(cè)后肢從髖關(guān)節(jié)處剪下，荷瘤肢重減去正常肢重即為瘤重。重復(fù)實驗T/C42%為有活性。二、抗癌作用機制研究（一）藥物作用周期特異性研究進行藥物作用細胞周期性實驗必須首先制備同步化的細胞，常用的體外培養(yǎng)細胞同步化的方法有機械振蕩法、雙胸苷同步法、含羞草氨酸俘獲法和離心洗脫法。1、機械振蕩法 機械振蕩法分離同步化細胞是基于單層貼壁生長的細胞在進入有絲分裂期時, 胞形變圓，松散地附在支持物上，利用搖晃或拍擊培養(yǎng)瓶可以剝離出這些細胞，利用此方法可以得到較純的M 期細胞。雙胸苷同步法的原理是先以高濃度的TdR處理細胞，使細胞內(nèi)的dTTP升高，后者抑制CDP 向dCDP的轉(zhuǎn)變，DNA復(fù)制受阻，S期細胞停滯在S 期，其它期細胞積聚在G1/S邊界；撤TdR，讓原處于S期的細胞完全越過S期，再給予TdR，讓越過S期的細胞進入G1/S邊界，然后撤去TdR，讓細胞重新生長，同時進入S期。因此，本方法可以得到較純的S期細胞。2、含羞草氨酸俘獲法 含羞草氨酸可將細胞集結(jié)于G1/S邊界，阻止細胞進入S期。在撤除含羞草氨酸后，細胞可同步進入S 期。3、離心洗脫法 離心洗脫法的原理是進入細胞周期的的體積呈線性增加。G1期細胞體積最小，離出口最近而被最先洗出。G2/M細胞體積最大離進氣口最近而被后洗出。在上述同步化處理尚需配合以同步化程度的檢測，檢查的方法有兩種：流式細胞光度技術(shù)和放射性同位素技術(shù)。前者通過測定細胞的熒光強度來定量細胞的DNA量； 后者則利用測定摻入到DNA中的3H-胸苷（3H-TdR）或溴脫氧尿苷（BrdU）的量來獲知處于S 期的細胞量。（二）藥物抗微管作用 利用微管蛋白在37聚合，在冰浴上解聚的特點，測定微管蛋白或微管液的OD值，分別獲得S型的聚合曲線和倒S型的解聚曲線， 比較藥物對曲線的影響， 用下式計算抑制率。 實驗組光密度值抑制率（%）=（1 - ）100% 對照組光密度值（三）藥物與DNA結(jié)合能力檢查 吸收光譜移動法 原理是DNA與藥物形成復(fù)合物后吸收光譜發(fā)生改變，吸收峰產(chǎn)生位移，位移波長隨DNA/ 藥物復(fù)合物的量增加而增加。利用紫外分光光度計進行紫外吸收光譜掃描，可觀察到這些改變。熒光光譜移動法 原理是在激發(fā)光的激發(fā)下，DNA-藥物復(fù)合物的熒光發(fā)射光譜發(fā)生改變，譜峰向短波方向移動，熒光強度增強，同時激發(fā)光譜說發(fā)生改變。用熒光分光光度計測定激發(fā)光譜和發(fā)射光譜可觀察到這些變化。（四）藥物造成的DNA損傷彗星（Comet）微凝膠單細胞電泳法 正常的DNA為負超螺旋結(jié)構(gòu)， 在pH12.0時則完全解鏈。DNA受損后鏈斷裂, 成為一個松散的結(jié)構(gòu), 在電場的作用下,松散的DNA離開細胞核向正極移動, 形成彗星似的拖尾,變換不同pH緩沖液可檢測斷裂的是雙鏈還是單鏈。堿洗脫法 收集細胞于濾膜上，用細胞溶解液裂解細胞并洗去RNA和蛋白質(zhì)，暴露DNA，用洗脫液進行洗脫，若DNA發(fā)生鏈斷裂，則易于經(jīng)濾膜洗出。（五）藥物對DNA拓撲異構(gòu)酶的影響DNA拓撲異構(gòu)酶是調(diào)節(jié)DNA空間結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化的關(guān)鍵性核酶，分成拓撲異構(gòu)酶I和II，抑制拓撲異構(gòu)酶I可以造成DNA的單鏈斷裂，抑制拓撲異構(gòu)酶II，可造成雙鏈斷裂，進而干擾DNA的復(fù)制、重組和基因表達。實驗的原理是用從腫瘤細胞核提取的拓撲異構(gòu)酶II處理PBR322DNA，后者是一種質(zhì)粒DNA，主要存在有超螺旋、缺口狀和線性DNA三種形式，瓊脂糖電泳上顯示出三條帶，在拓撲異構(gòu)酶的作用下超螺旋DNA解旋、斷裂，電泳時超螺旋帶減弱或消失，相應(yīng)的缺口環(huán)狀或線性DNA增加。如果藥物對拓撲異構(gòu)酶具有抑制作用，則可見超螺旋帶保留。此方法亦可改進為觀察藥物對拓撲異構(gòu)酶功能的促進和抑制作用。方法是選定不能使一定量DNA完全斷裂量的拓撲異構(gòu)酶處理PBR322DNA后電泳可見超螺旋帶，同時加入不同濃度的藥物，如果藥物抑制拓撲異構(gòu)酶，則超螺旋帶增強，若藥物增強拓撲異構(gòu)酶活性，則見螺旋帶減弱或消失。（六）藥物對細胞核酸代謝的影響 DNA和RNA合成均需要特殊氨基酸，用同位素標記前體物如3H-TdR，3H-UR可分別摻入到細胞DNA 和RNA中去， 用液閃法測定其同位素活性則可知細胞DNA和RNA 的合成情況。（七）藥物對腫瘤細胞凋亡的誘導(dǎo)作用細胞凋亡是一種受基因調(diào)控的細胞程序性死亡過程，細胞凋亡時表現(xiàn)為細胞體縮小，染色質(zhì)濃縮成大小不等的塊狀，并裂解為小片段。DNA斷裂長度為核小體核苷酸長度(180200堿基對)的整倍數(shù)，提取后普通的瓊脂糖電泳表現(xiàn)為特殊的云梯狀，凋亡小體形成。檢查細胞凋亡的方法有：1、熒光顯微鏡的形態(tài)學(xué)檢查 該方法是利用凋亡細胞染色質(zhì)濃縮，DNA廣泛裂解的特征和熒光化合物可嵌入DNA分子或以靜電相互作用與DNA分子結(jié)合的原理，建立DNA的熒光探針。常用的方法是用Hoechst33342和PI聯(lián)合染色，然后在熒光顯微下用紫外光激發(fā)。凋亡的細胞對Hoechst33342具有高攝取比，加之染色質(zhì)的高度濃縮，呈強藍色熒光；正常細胞呈微弱熒光，壞死細胞則呈紅色熒光（被PI染色）。2、流式細胞光度術(shù) 該方法的原理是用DNA結(jié)合性的熒光染料標記DNA， 因為細胞發(fā)生凋亡時，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶降解、斷裂DNA，斷裂生成的小分子量DNA溢出細胞外，細胞內(nèi)DNA總量降低，利用流式細胞光度術(shù)可以檢測出DNA的這種結(jié)構(gòu)和量的變化。3、瓊脂糖電泳分析法 利用該方法可檢測出呈云梯狀的寡聚核小體。第八節(jié) 心腦血管藥理學(xué)實驗方法與技術(shù)簡介 心腦血管藥物實驗方法很多，擇其要者簡介如下：一、血壓測定及相關(guān)模型血壓測定法大體分為直接和間接測壓法。直接測壓可選用頸動脈或股動脈插管，通過壓力換能器記錄血壓變化，一般用麻醉動物作急性實驗。常用的間接測壓法主要有大鼠尾容積測壓及尾動脈脈搏測壓法。實驗性高血壓模型有：1、腎血管性高血壓模型（腎動脈狹窄性高血壓模型），分為2腎1夾型（兩側(cè)腎完整，一側(cè)腎動脈狹窄）、1腎1夾型（一側(cè)腎切除，另一側(cè)腎動脈狹窄）和2腎2夾型（兩側(cè)腎完整，兩側(cè)腎動脈狹窄），常用動物是狗和大鼠。2、內(nèi)分泌性高血壓模型 常用大鼠，包括DOC鹽性高血壓模型、腎上腺再生性高血壓模型。3、神經(jīng)原性高血壓模型。4、遺傳性高血壓模型， 根據(jù)采用的遺傳學(xué)方法進行分類：選擇性近親繁殖高血壓模型（如自發(fā)性高血壓大鼠SHR、Dahl鹽敏感大鼠DS、米蘭種高血壓大鼠 MHS、遺傳性高血壓大鼠 GH、以色列種高血壓大鼠 SBH、里昂種高血壓大鼠 LH）基因工程高血壓模型 高血壓轉(zhuǎn)基因動物（transgenic animals of hypertension）、高血壓基因敲除動物（geneknockout animals of hypertension）。研究降壓藥作用機理的實驗方法包括:中樞降壓(毀髓貓或大鼠模型、減弱神經(jīng)反射性調(diào)節(jié)實驗等)；外周降壓（神經(jīng)節(jié)阻斷、對傳出神經(jīng)遞質(zhì)及受體的影響、對在體血管阻力或離體血管平滑肌作用實驗等）。二、心臟與血管實驗法簡介 心臟實驗可用在位心臟和離體心臟進行。離體心臟實驗最常用的方法是Straub法、八木-Hartung法與Langendorff法。前兩種方法主要觀察藥物直接對心臟收縮力、傳導(dǎo)與心輸出量的影響，適用于兩棲類動物如青蛙、蟾蜍等離體心臟；后者適用于哺乳類動物兔、豚鼠、大鼠等，不僅可觀察藥物對心肌的直接作用，還可觀察藥物對冠脈流量的影響。本法雖然排除了神經(jīng)體液的調(diào)控作用，但不能同時控制前、后負荷和心率，故又建立了離體工作心臟實驗法。在位心臟實驗法有Blbring法、家兔不破壞胸膜記錄心收縮力法、狗心肺裝置實驗法等。 冠脈血管及冠脈血流量實驗法 離體實驗主要有冠狀動脈條實驗、Langendorff離體心臟測定冠脈灌流量法；在位心臟測定冠脈血流量及心肌耗氧量、測定區(qū)域性心肌血流量、86Rb測定心肌營養(yǎng)血流量法。 心血管藥理實驗方法中的技術(shù)手段還有：清醒大鼠心功能及血流動力學(xué)實驗、動物心電圖、心導(dǎo)管技術(shù)等。三、抗心肌缺血與再灌注損傷藥物實驗法簡介首先介紹心肌缺血與再灌注損傷模型的制備：整體動物結(jié)扎冠脈后再灌注模型（常用犬、兔、大鼠進行）；離體心臟缺氧造成全心缺氧和其后的在給氧損傷，亦可結(jié)扎離體心臟的冠脈，然后松結(jié)產(chǎn)生局部心肌再灌注損傷；體外心肌培養(yǎng)缺糖缺氧與再給糖給氧產(chǎn)生再灌注損傷。心肌缺血與梗塞范圍測定：組織學(xué)檢查；