Western Blotting 綜述.doc

Western Blotting 定義:免疫印跡是一個(gè)用于蛋白質(zhì)分析的常規(guī)技術(shù)，在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持物，然后利用抗原-抗體的特異性反應(yīng)，從蛋白混合物中檢測(cè)出目標(biāo)蛋白，從而定量或定性的確定正?；?qū)嶒?yàn)條件下細(xì)胞或組織中目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。western blot 是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的免疫生化技術(shù)。特點(diǎn):Western Blot結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測(cè)定的特異敏感等多種優(yōu)點(diǎn)，可檢測(cè)到低至15ng（最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白。 組成:典型的印跡實(shí)驗(yàn)包括三個(gè)步驟蛋白質(zhì)的電泳分離；將電泳后凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固體膜上，用非特異性，非反應(yīng)活性分子封閉固體膜上未吸附蛋白質(zhì)區(qū)域；免疫學(xué)檢測(cè)。免疫印跡克服了聚丙烯酰胺凝膠電泳后直接在凝膠上進(jìn)行免疫學(xué)分析的弊端，極大地提高了其利用率、分辨率和靈敏度，使其成為使用最廣泛的免疫化學(xué)方法之一。第一步是做SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測(cè)樣品中的蛋白質(zhì)按分子量大小在凝膠中分成帶。第二步把凝膠中已分成條帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纖維素膜(NC 膜)和PVDF 膜，蛋白轉(zhuǎn)移的方法多用電泳轉(zhuǎn)移，它又有半干法和濕法之分，現(xiàn)在大多用濕法。第三步是用特異性的抗體檢測(cè)出已經(jīng)印跡在膜上的所要研究的相應(yīng)抗原。免疫檢測(cè)的方法可以是直接的和間接的。現(xiàn)在多用間接免疫酶標(biāo)的方法，在用特異性的第一抗體雜交結(jié)合后，再用酶標(biāo)的第二抗體（堿性磷酸酶（AP）或辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗第一抗體的抗體）雜交結(jié)合，再加酶的底物顯色或者通過(guò)膜上的顏色或X 光底片上暴光的條帶來(lái)顯示抗原的存在。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)中?；驹硪约安僮鞯谝徊糠郑篠DS-PAGE 電泳1、 電泳樣品的制備-蛋白質(zhì)的變性.蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同的蛋白在不同的PH值下表現(xiàn)出不同的電荷，為了使蛋白在電泳中的遷移率只與分子量有關(guān)，我們?cè)谏蠘忧埃ǔ?huì)進(jìn)行一些處理(上樣緩沖液)。即在樣品中加入含有SDS 和-巰基乙醇的上緩沖液。SDS 即十二烷基磺酸鈉（CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+），是一種陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)； -巰基乙醇是強(qiáng)還原劑，它可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵。電泳樣品加入樣品處理液后，經(jīng)過(guò)高溫處理，其目的是將SDS 與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，以使蛋白質(zhì)完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)同時(shí)使整個(gè)蛋白帶上負(fù)電荷；另外樣品處理液中通常還加入溴酚藍(lán)染料，溴酚藍(lán)指示劑是一個(gè)較小的分子，可以自由通過(guò)凝膠孔徑，所以它顯示著電泳的前沿位置，當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí)，即可停止電泳。用于監(jiān)控整個(gè)電泳過(guò)程；另外樣品處理液中還加入適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加樣時(shí)樣品溶液可以快速沉入樣品凹槽底部。當(dāng)樣品上樣并接通兩極間電流后(電泳槽的上方為負(fù)極，下方為正極)，在凝膠中形成移動(dòng)界面并帶動(dòng)凝膠中所含SDS負(fù)電荷的多肽復(fù)合物向正極推進(jìn)。樣品首先通過(guò)高度多孔性的濃縮膠，使樣品中所含SDS 多肽復(fù)合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶（或稱積層）。2、 凝膠制備以及電泳2.1 SDS-PAGE凝膠配制 配制相應(yīng)濃度的SDS-PAGE分離膠，TEMED加入后迅速混勻制膠，沿壁迅速灌注分離膠溶液，留出積層膠所需空間（梳齒長(zhǎng)再加1cm）。覆蓋5mm水(或異丙醇）層于分離膠溶液上，約30-60min后分離膠和水層之間會(huì)出現(xiàn)清晰界面，表明分離膠充分聚合（可微微傾斜模具，檢測(cè)凝膠是否聚合）。 ddH2O輕輕洗滌凝膠頂部數(shù)次，以除去未聚合的凝膠，再用濾紙吸凈殘留液體，注意不要接觸膠面。覆蓋層可保持膠面平整和防止空氣進(jìn)入，因?yàn)檠鯕鈹U(kuò)散進(jìn)入凝膠會(huì)抑制聚合反應(yīng)。灌膠時(shí)開始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。膠濃度10%時(shí)可用0.1%的SDS封，濃度10%時(shí)用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封膠后切記，勿動(dòng)。配制相應(yīng)體積的積層膠液體，在已聚合分離膠上直接灌注積層膠液體，立即插入加樣梳，并在空隙處補(bǔ)足積層液液體（小心避免混入氣泡），室溫靜置3060min至完全聚合，將凝膠固定于電泳裝置上，上、下槽加入Tris甘氨酸電泳緩沖液，至少要淹沒加樣孔。小心拔出加樣梳，避免損壞加樣孔，如加樣孔有氣泡，可向其中加入適量電泳緩沖液將氣泡驅(qū)除；若上樣孔有變形，可用適當(dāng)粗細(xì)的針頭撥正。凝膠的質(zhì)量直接影響以后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，要特別注意幾點(diǎn)：凝膠要均一沒有氣泡；積層膠與分離膠界面要水平；AP和TEMED的量不能過(guò)多，太多會(huì)導(dǎo)致膠易脆裂；拔梳子時(shí)要快，盡量保證點(diǎn)樣孔平整。 2.2電泳 電泳啟動(dòng)時(shí)，蛋白樣品處于PH6.8 的上層，PH8.8 的分離膠層在下層，上槽為負(fù)極，下槽為正極。出現(xiàn)了PH 不連續(xù)和膠孔徑大小不連續(xù)：?jiǎn)?dòng)時(shí)Cl解離度大，Pro解離度居中，甘aaCOO解離度小，遷移順序?yàn)椋≒H6.8）Cl Pro COO。在Cl與Pro之間和Pro與COO之間都將出現(xiàn)低離子區(qū)，同時(shí)也出現(xiàn)高電勢(shì)，高電勢(shì)迫使Pro向Cl遷移，COO向Pro遷移。如：一個(gè)Cl領(lǐng)路，COO推動(dòng)，蛋白在中間，這樣就起到濃縮的作用了。在濃縮膠運(yùn)動(dòng)中，由于膠聯(lián)度小，孔徑大，Pro受阻小，因此不同的蛋白質(zhì)就濃縮到分離膠之上成層，起濃縮效應(yīng)，使全部蛋白質(zhì)處于同一起跑線上。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入分離膠時(shí)，此時(shí)Pro，Cl，甘aa 離子在PH8.8 的溶液中，Cl完全電離而很快到達(dá)正極，甘aa 電離度加大很快躍過(guò)蛋白質(zhì)，而到達(dá)正極，只有蛋白質(zhì)分子在分離膠中較為緩慢的移動(dòng)。由于Pro在電泳過(guò)程中，受到溶液離子的變化而PH 值發(fā)生變化，但每一瞬間，其所帶電荷數(shù)除以單位質(zhì)量是不同的，所以帶負(fù)電荷多者遷移快，反之則慢，這就現(xiàn)了電荷效應(yīng)。由于膠孔徑小，而且成為一個(gè)整體的篩狀結(jié)構(gòu)，它們對(duì)大分子阻力大，小分子阻力小，起著分子篩效應(yīng)，也就是蛋白質(zhì)在分離膠中，以分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)而出現(xiàn)遷移率的差異，最終達(dá)到彼此分開。2.3 PAGE 膠的聚合原理：甲叉雙丙烯酰胺和丙烯酰胺在過(guò)硫酸胺的作用下聚合，形成膠，如下圖：催化劑：過(guò)硫酸銨（AP）在隔氧的狀態(tài)下，最好現(xiàn)配現(xiàn)用，使用新鮮的。加速催化劑：TEMED，四甲基乙二胺。催化劑的作用是使單體聚合成網(wǎng)狀聚合物。2.4 SDS聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍第二部分：樣品的印跡1、 膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC 膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF 等。我們選用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及具有更好的化學(xué)兼容性。硝酸纖維素（nitrocellulose, NC)膜：NC與蛋白質(zhì)靠疏水作用結(jié)合，無(wú)需預(yù)先活化，對(duì)蛋白質(zhì)的活性影響??； 非特異性本底顯色淺； 價(jià)格低廉，使用方便。但結(jié)合在NC上的小分子蛋白質(zhì)在洗滌時(shí)易丟失； NC韌性較差，易損壞。聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜：與蛋白質(zhì)親和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正電基團(tuán)，使其更容易與帶負(fù)電荷蛋白結(jié)合。2、 膜的預(yù)處理NC膜的預(yù)處理：剪裁與膠大小一致的NC膜，將其浸入1轉(zhuǎn)移緩沖液平衡5 分鐘以上。（注意：必須保證NC膜始終完全浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中）PVDF 膜及濾紙的預(yù)處理：剪裁與膠大小一致的膜泡入甲醇中，約1-2 分鐘。膜的選擇主要根據(jù)：a.膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力（也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。?；b.不影響后續(xù)的顯色檢測(cè)（也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好）；c.如果后繼實(shí)驗(yàn)有其他要求，比如要做蛋白測(cè)序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目的來(lái)挑選不同的轉(zhuǎn)移膜。目的蛋白分子大小(kDa) 膠濃度轉(zhuǎn)移時(shí)間(h) 基本操作流程:3、 轉(zhuǎn)膜蛋白質(zhì)印跡法首先是要將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法。毛細(xì)管印跡法是將凝膠放在緩沖液浸濕的濾紙上，在凝膠上放一片硝酸纖維素膜，再在上面放一層濾紙等吸水物質(zhì)并用重物壓好，緩沖液就會(huì)通過(guò)毛細(xì)作用流過(guò)凝膠。緩沖液通過(guò)凝膠時(shí)會(huì)將蛋白質(zhì)帶到硝酸纖維素膜上，硝酸纖維素膜可以與蛋白質(zhì)通過(guò)疏水相互作用產(chǎn)生不可逆的結(jié)合。這個(gè)過(guò)程持續(xù)過(guò)夜，就可以將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。但這種方法轉(zhuǎn)移的效率較低，通常只能轉(zhuǎn)移凝膠中一小部分蛋白質(zhì)（1020）。電泳印跡可以更快速有效的進(jìn)行轉(zhuǎn)移。這種方法是用有孔的塑料和有機(jī)玻璃板將凝膠和硝酸纖維素膜夾成三明治形狀，而后浸入兩個(gè)平行電極中間的緩沖液中進(jìn)行電泳，選擇適當(dāng)?shù)碾娪痉较蚓涂梢允沟鞍踪|(zhì)離開凝膠結(jié)合在硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜就稱為一個(gè)印跡（blot），用于對(duì)蛋白質(zhì)的進(jìn)一步檢測(cè)。3、封閉 在進(jìn)行抗體雜交之前，需要先對(duì)轉(zhuǎn)印膜進(jìn)行封閉，以防止免疫試劑的非特異性吸附。封閉一般采用異源性蛋白質(zhì)或去污劑，常用的有0.2%Tween-20，20%BSA，5%脫脂奶等，至于選擇哪一類封閉液，首先應(yīng)考慮與檢測(cè)試劑相適應(yīng)，如采用葡萄球蛋白A（SPA）作用檢測(cè)試劑，就不能用全血清封閉，其次是盡可能使非特異著色背靜淺，封閉液以20%BSA效果較好，其次是5%N-fat milk.封閉過(guò)程：1) 洗轉(zhuǎn)印膜：室溫漂洗3次x10min,以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的SDS，防止影響后面的抗體結(jié)合。2) 取漂洗的轉(zhuǎn)印膜，放入5% No-fat milk的封閉液內(nèi)，搖床震動(dòng)，室溫封閉1h，也可在4度過(guò)夜。3) 用1xTBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次x10min.第三部分免疫學(xué)檢測(cè)1、 一抗以及二抗雜交和顯色用所要研究的蛋白質(zhì)的抗血清（一抗）處理，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)與一抗結(jié)合，而其它蛋白質(zhì)不與一抗結(jié)合，這樣清洗去除未結(jié)合的一抗后，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)的位置上結(jié)合著一抗。處理過(guò)的印跡進(jìn)一步用適當(dāng)標(biāo)記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗是抗鼠Ig G 的抗體。處理后，帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質(zhì)的位置。目前有結(jié)合各種標(biāo)記物的抗特定Ig G 的抗體可以直接購(gòu)買作為標(biāo)記的二抗。最常用的一種是酶連的二抗，印跡用酶連二抗處理后，再用適當(dāng)?shù)牡孜锶芤禾幚?，?dāng)酶純化底物生成有顏色的產(chǎn)物時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生可見的區(qū)帶，指示所要研究的蛋白質(zhì)的位置。在酶連抗體中使用的酶通常是堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶。堿性磷酸酶可以將無(wú)色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸鹽（BCIP）轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物；而辣根過(guò)氧化物酶可以以H2O2 為底物，將3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色產(chǎn)物或?qū)?-氯萘酚氧化成藍(lán)色產(chǎn)物。另一種檢測(cè)辣根過(guò)氧化物酶的方法是用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法，辣根過(guò)氧化物酶在H2O2 存在下，氧化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾（luminol，氨基苯二酰一肼）并發(fā)光，在化學(xué)增強(qiáng)劑存在下光強(qiáng)度可以增大1000 倍，通過(guò)將印跡放在照相底片上感光就可以檢測(cè)辣根過(guò)氧化物酶的存在。除了酶連二抗作為指示劑，也可以使用其它指示劑，主要包括以下一些：I125 標(biāo)記的二抗：可以通過(guò)放射性自顯影檢測(cè)。熒光素異硫氰酸鹽標(biāo)記的二抗：可以通過(guò)在紫外燈下產(chǎn)生熒光來(lái)檢測(cè)。I125 標(biāo)記金黃色葡萄球菌蛋白A（Protein A）：Protein A 可以與Ig G 的Fc 區(qū)特異性的結(jié)合，因此Protein A 可以代替二抗：I125 標(biāo)記的Protein A 通過(guò)放射性自顯影檢測(cè)。金標(biāo)記的二抗：二抗通過(guò)微小的金顆粒包裹，與一抗結(jié)合時(shí)可以表現(xiàn)紅色。生物素結(jié)合的二抗：印跡用生物素結(jié)合的二抗處理后，再用堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的凝集素處理。生物素可以與凝集素緊密結(jié)合，這種方法實(shí)際上相當(dāng)于通過(guò)生物素與凝集素的緊密結(jié)合將二抗與酶連接，通過(guò)酶的顯色反應(yīng)就可以進(jìn)行檢測(cè)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是由于生物素是一個(gè)小分子蛋白，一個(gè)抗體上可以結(jié)合多個(gè)生物素，也就可以結(jié)合多個(gè)酶連接的凝集素，可以大大增強(qiáng)顯色反應(yīng)的信號(hào)。除了使用抗體或蛋白作為檢測(cè)特定蛋白的探針以外，有時(shí)也使用其它探針如放射性標(biāo)記的DNA，可以檢測(cè)印跡中的DNA 結(jié)合蛋白。主要試劑1、SDS-PAGE 試劑：2、勻漿緩沖液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；-巰基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。3、轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O 定容至1000ml。4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。5、膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g 溶于20ml 的0.01M PBS 中。6、顯色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸鎳胺 0.1ml；H202 1.0l。7、兔抗豬R 蛋白抗體、HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG（二抗）。操作步驟1、蛋白質(zhì)樣品獲得：細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)后，可通過(guò)電泳上樣緩沖液直接裂解細(xì)胞，真核細(xì)胞加勻漿緩沖液，機(jī)械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然后4，13,000g 離心15min。取上清液作為樣品。2、電泳：制備電泳凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE。3、轉(zhuǎn)移（半干式轉(zhuǎn)移）：（1）電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，5min3 次。（2）膜處理：預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC 膜，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10min。（3）轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽(yáng)極碳板、24 層濾紙、NC 膜、凝膠、24 層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC 膜精確對(duì)齊，每一步去除氣泡，上壓500g 重物，將碳板上多余的液體吸干。接通電源,恒流1mA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5hr。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源將膜取出,割取待測(cè)膜條做免疫印跡。將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色，放入膜染色液中50s 后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風(fēng)干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結(jié)果作對(duì)比。4、免疫反應(yīng)：（1）用0.01M PBS 洗膜，5min 3 次。（2）加入包被液，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2hr。（3）棄包被液，用0.01M PBS 洗膜，5min3 次。（4）加入一抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS 稀釋，液體必須覆蓋膜的全部），4 放置12hr 以上。陰性對(duì)照，以1%BSA 取代一抗，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。（5）棄一抗和1%BSA，用0.01M PBS 分別洗膜，5min4 次。（6）加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS 稀釋），平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2hr。（7）棄二抗，用0.01M PBS 洗膜，5min4 次。（8）加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng)。5、結(jié)果分析 內(nèi)參即是內(nèi)部參照，對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來(lái)說(shuō)一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白，它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來(lái)做參照物。在Western Blot中使用內(nèi)參其實(shí)就是在WB過(guò)程中另外用內(nèi)參對(duì)應(yīng)的抗體檢測(cè)內(nèi)參，這樣在檢測(cè)目的產(chǎn)物的同時(shí)可以檢測(cè)內(nèi)參的表達(dá)，由于內(nèi)參在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，借助檢測(cè)每個(gè)樣品內(nèi)參的量就可以用于校正蛋白質(zhì)定量、上樣過(guò)程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外使用內(nèi)參可以作為空白對(duì)照，檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個(gè)Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。 常用的蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH和細(xì)胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般要選擇一個(gè)在處理因素作用的條件下蛋白含量不會(huì)發(fā)生改變的蛋白作內(nèi)參。 為了讓實(shí)驗(yàn)更加嚴(yán)謹(jǐn)有說(shuō)服力都要設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，對(duì)照分為：陽(yáng)性對(duì)照（最好有標(biāo)準(zhǔn)品（比如-actin，GAPDH）或陽(yáng)