實驗一 抗體的制備及效價檢測.doc

實驗一 抗體的制備及效價檢測一、實驗目的本實驗是單克隆抗體技術的免疫階段的過程，為單克隆抗體技術提供免疫淋巴細胞。了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制備技術，掌握雙向免疫擴散法測定抗體的效價。二、實驗原理機體的特異性免疫反應是指機體受抗原物質刺激后產生體液免疫和細胞免疫的過程。一種抗原能否引發(fā)抗體反應，一方面取決于抗原分子表面有無特異性的化學結構-抗原決定簇，另一方面取決于機體有無相應的免疫活性細胞。當上述兩個條件具備時，抗原進入機體經過一定的潛伏期，抗體效價逐步上升，達到高峰后，能維持一短暫的時期，以后又逐漸下降，但當?shù)诙谓佑|相同的抗原時，抗體的上升較前次為快， 高峰時的效價也比前次為高?？贵w持續(xù)的時間也較長，此也稱為再次反應。完全福氏佐劑的使用能夠延長抗原在體內的存留時間，增加可溶性抗原的免疫性。通常制備抗體時常用完全福氏佐劑加強免疫。抗原、抗體在合適的濃度和比例條件下，抗原和其相應的抗體在有固相支持的液相環(huán)境中各自發(fā)生擴散。分子雙向擴散接觸時形成肉眼可見的沉淀線反應?？贵w的效價即時指與固定濃度的抗原發(fā)生沉淀反應時所需的最小抗體濃度。三、實驗步驟1動物的選擇：選擇2-3個月以上的小鼠。免疫作好標號。分籠飼養(yǎng)。2抗原的選擇：將抗原（纖維素酶）稀釋為4 mg/ml，即可與佐劑混合制成乳劑用于動物免疫。3佐劑和抗原乳劑的制備佐劑 完全福氏佐劑：輕礦物油（石臘油）8.5 ml；羊毛脂1.5 ml；滅活結核桿菌10 mg?？乖閯┲苽?（1）油劑：礦物油和羊毛脂按比例混合，高壓8磅20分鐘滅菌后作為油劑，使用前微火融化。（2）水劑：滅活結核桿菌1 mg/ml + 抗原4 mg/ml （均為終濃度）。（3）油劑和水劑1：1混合。混合方式：研磨或者注射器混合。4免疫方法：小鼠背部皮下多點注射，每點0.1ml。第一次免疫：實驗組小鼠加佐劑的抗原。A組：每只小鼠背部、腋下多點注射，共計0.4 ml磷酸緩沖液。B組：每只小鼠背部、腋下多點注射，共計0.4 ml加佐劑的抗原乳劑。第二次免疫：第3周實驗組小鼠不加佐劑抗原。A組：每只小鼠背部、腋下多點注射，共計0.4 ml磷酸緩沖液。B組：每只小鼠背部、腋下多點注射，共計0.4 ml 2mg/ml纖維素酶液。第三次免疫：第二次免疫后1周，實驗組小鼠不加佐劑抗原。A組：每只小鼠背部、腋下多點注射，共計0.4 ml磷酸緩沖液。B組：每只小鼠背部、腋下多點注射，共計0.4 ml 2mg/ml纖維素酶液。第四次免疫：第三次免疫后1周，實驗組小鼠不加佐劑抗原。A組：每只小鼠背部、腋下多點注射，共計0.4 ml磷酸緩沖液。B組：每只小鼠背部、腋下多點注射，共計0.4 ml 2mg/ml纖維素酶液。5抗血清的制備第四次免疫一周后，乙醚麻醉小鼠，眼眶取血或心臟取血。收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4下，析出血清，離心，4000rpm,10min。在無菌條件，吸出血清，分裝（0.050.2ml），貯于-40以下冰箱，或凍干后貯存于4度冰箱保存。6抗體的效價檢測：雙向免疫擴散法。瓊脂凝膠板的制備：膠布包圍一片載玻片使之形成不透水的槽。用生理鹽水加熱溶解瓊脂配成1%溶液，均勻澆注于玻片內。注意勿產生氣泡，瓊脂厚度約2.5mm。打孔：待瓊脂凝固后，用去尖頭的吸頭（直徑約為3-4mm）在凝膠上打孔，孔間距為3-5mm。在小孔中加少量加熱的液體瓊脂，防止?jié)B漏。打孔樣式為梅花樣，如圖抗原:纖維素酶C組: 血清A組血清B組: 血清酶加樣：加樣于孔內，左中間孔為抗原；右中間孔為無關抗原（牛血清白蛋白）；邊孔為不同濃度的抗體（系列用生理鹽水稀釋的抗體1-1/2-1/4-1/8-1/16-1/32，效價分析，本實驗不做）。注意不要外溢（加滿為止）。 結果觀察：加樣完畢，將瓊脂板平放于濕盒內，在室溫或37 擴散18-24小時后，觀察結果。四實驗結果五結果討論實驗內容要求：（1）每組要求注射同一只小鼠；（2）在注射過程中，不要弄死小鼠；盡量選擇淋巴較多的部位，增加小鼠產生抗體能力；（3）免疫后小鼠取血時，盡量讓血取在離心管中；（4）效