微生物 顯微鏡和顯微技術(shù) ppt課件

24 04 2020 1 2顯微鏡和顯微技術(shù) 24 04 2020 2 24 04 2020 3 借助于顯微鏡觀察微生物的方法即顯微技術(shù) 顯微技術(shù)是微生物檢驗技術(shù)中最常用的技術(shù)之一 24 04 2020 4 顯微鏡的種類和原理 顯微觀察樣品的制備 24 04 2020 5 一 顯微鏡的種類和原理 一 光學(xué)顯微鏡 普通光學(xué)顯微鏡 暗視野顯微鏡 相差顯微鏡 熒光顯微鏡 現(xiàn)在的光學(xué)顯微鏡分辨的最小極限達0 2 m 24 04 2020 6 普通光學(xué)顯微鏡的幾個基本概念 24 04 2020 7 24 04 2020 8 24 04 2020 9 24 04 2020 10 24 04 2020 11 1 普通光學(xué)顯微鏡 由三部分構(gòu)成 照明系統(tǒng) 包括光源和聚光器 光學(xué)放大系統(tǒng) 由物鏡和目鏡組成 是顯微鏡的主體 目鏡和物鏡都由復(fù)雜的透鏡組構(gòu)成 機械裝置 用于固定材料和觀察方便 24 04 2020 12 油鏡使用 光鏡使用方法 24 04 2020 13 2 暗視野顯微鏡 原理 聚光鏡中央有擋光片 使照明光線不直接進人物鏡 只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進入物鏡 因而視野的背景是黑的 物體的邊緣是亮的 適用范圍 生活細菌運動性觀察 24 04 2020 14 特點 只能看到物體的存在與運動 不能辨清其微細結(jié)構(gòu) 暗視野顯微鏡的使用 24 04 2020 15 基本原理 把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差 從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度 使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見 3 相差顯微鏡 相差顯微鏡使用 24 04 2020 16 微分干涉差顯微鏡DIC顯微鏡下的硅藻形態(tài) 適用范圍 對透明的活體進行直接觀察 24 04 2020 17 4 熒光顯微鏡 原理 熒光素吸收紫外線并放出部分波長較長的可見光 發(fā)熒光的物體會在黑暗背景顯現(xiàn)為光亮有色物體 24 04 2020 18 綠色 銅綠假單胞菌黃色 蠟樣芽孢桿菌 綠色 微管紅色 微絲藍色 核 24 04 2020 19 1931年在德國柏林由克諾爾和哈羅斯卡首先裝配完成的 用高速電子束代替光束 放大倍數(shù)可達80萬倍 分辨的最小極限達0 2納米 二 電子顯微鏡 透射電子顯微鏡 掃描電子顯微鏡 24 04 2020 20 1 透射電子顯微鏡 目前TEM的分辨力可達0 2nm 用電子束作光源 用電磁場作透鏡 用于電鏡的標(biāo)本須制成厚度約50nm左右的超薄切片 放大倍數(shù)最高可達近百萬倍 由電子照明系統(tǒng) 電磁透鏡成像系統(tǒng) 真空系統(tǒng) 記錄系統(tǒng) 電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成 24 04 2020 21 高爾基體的TEM照片 偽彩色 24 04 2020 22 24 04 2020 23 2 掃描電子顯微鏡 掃描電子顯微鏡 大腸桿菌掃描電鏡圖 工作原理 電子束掃描 激發(fā)樣品表面放出二次電子 電子產(chǎn)生多少與標(biāo)本表面立體形貌有關(guān) 電子經(jīng)探測器收集 經(jīng)光電倍增管和放大器 產(chǎn)生樣品立體圖像于熒光屏上 主要用于 樣品表面結(jié)構(gòu) 24 04 2020 24 掃描電子顯微鏡原理 24 04 2020 25 24 04 2020 26 3 掃描隧道顯微鏡 STM 掃描隧道顯微鏡拍攝的7個鈾原子團 24 04 2020 27 24 04 2020 28 4原子力顯微鏡 24 04 2020 29 24 04 2020 30 光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡的特點比較 24 04 2020 31 一 光學(xué)顯微鏡制樣 活體觀察 染色 壓滴法 懸滴法 菌絲埋片法 活菌 死菌 美藍染色 簡單染色 鑒別染色 革蘭氏染色 鞭毛染色 芽孢染色 二 顯微觀察樣品的制備 24 04 2020 32 1 壓滴法 菌懸液滴于載玻片上 加蓋玻片 觀察 2 懸滴法 蓋玻片中央加一小滴菌懸液 翻轉(zhuǎn)置于特制的凹載玻片上 觀察 3 菌絲埋片法 無菌小塊玻璃紙鋪于平板表面 涂布放線菌或霉菌孢子懸液 培養(yǎng) 取下玻璃紙置于載玻片上 觀察菌絲形態(tài) 光學(xué)顯微鏡樣品制備 活體觀察 特點 避免染色對細胞結(jié)構(gòu)的破壞 用于運動性 攝食特性 生長繁殖過程中形態(tài)變化等觀察 24 04 2020 33 用途 微生物的細致形態(tài)和結(jié)構(gòu)染色前需要對樣品固定 常用固定方法 酒精火焰加熱 化學(xué)固定 光學(xué)顯微樣品制備 染色觀察 24 04 2020 34 1 簡單染色法 涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 鏡檢2 革蘭氏染色法 涂片 固定 結(jié)晶紫色染色 水洗 碘液媒染 水洗 酒精脫色 番紅復(fù)染 水洗 干燥 觀察 24 04 2020 35 二 電子顯微鏡的制樣樣品在進行電鏡觀察前必須進行固定和干燥 制樣時一般采用重金屬鹽染色或噴鍍 提高在電鏡下的反差 24 04 2020 36 1 透射電鏡的樣品制備 負染技術(shù) 投影技術(shù) 超薄切片技術(shù) 冰凍蝕刻技術(shù) 24 04 2020 37 負染法 將樣品的背景染色以凸現(xiàn)樣品 所以稱為負染法 一般是采用電子密度高 本身不會顯示任何結(jié)構(gòu) 又和樣品不起反應(yīng)的物質(zhì) 如磷鎢酸的鈉鹽將樣品包圍 同時染色劑還會進入觀察對象的內(nèi)部 這樣 既能顯示外形 又可在一定程度上反映樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu) 負染法原理 24 04 2020 38 負染色法觀察的鞭毛 用途 可以觀察細菌細胞 病毒等 24 04 2020 39 在真空條件下 用電子散射能力強的重金屬原子來噴鍍樣品表面 這樣在樣品和沒有噴鍍的區(qū)域形成了較強的反差 而沒有噴鍍的部分成了樣品的投影 根據(jù)投影了解樣品的立體形狀 高度 投影法 24 04 2020 40 投影法觀察的噬菌體 用途 觀察細菌的鞭毛或病毒的顆粒 24 04 2020 41 這是最常用的方法 可以觀察細胞或其它樣品內(nèi)部的細微結(jié)構(gòu) 樣品固定 脫水 包埋 切片 只有在20 100納米厚度的切片用透射電子顯微鏡才能觀察 所以一般細菌樣品 一個細胞要分割成10片到50片 超薄切片法 超薄切片法觀察的一種厭氧弧菌 24 04 2020 42 樣品 196 迅速冷凍 加溫到 100 切割樣品 升華 真空 掉斷口處的冰 重金屬噴鍍斷口表面 電子顯微鏡觀察 冰凍蝕刻法 24 04 2020 43 冰凍蝕刻法制備的酵母菌內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖 優(yōu)點 可以避免在固定 脫水和包埋過程中造成細胞結(jié)構(gòu)的人為改變而形成的假象 24 04 2020 44 2 掃描電鏡樣品的制備 樣品先要經(jīng)